Diese Studien wurden finanziert zum Teil durch Zuschüsse aus dem Alternative Forschungs- und Entwicklungsgemeinschaft (107.588), das National Institute of Health (1U54CA136465-04S1) und dem California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Wir danken Drs. Andrew Wilber und R. Scott McIvor für die großzügige Spende ihrer <pkt2 lubig=""> transponson und pK / hUbiC-SB11 Transposase Plasmide. Wir danken John Tamaresis, Ph.D. Rat der statistischen Methoden, Timothy Brown für die Durchführung der Durchflusszytometrie, Georgette Henrich für die Beratung über Migrationen Assays und Nancy Gamba zur Erleichterung der Sammlung von THR Proben. </pkt2>

Kugelköpfe wurden von Patienten nach elektiven THR Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Alle Gewebe wurden als de-identifizierte Proben in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Stanford University Research Compliance Office gesammelt. 1. Auswählen einer Brustkrebszelllinie (n) <ol><li> Erhalten oder Transfektion die gewünschte Brustkrebszelllinie (n) mit einem Luciferase-GFP-Reporterkonstrukt. Die folgenden Versuche wurden durch Transfektion mit dem Transposon Sleeping Beauty Plasmid PKT2 / Lubig unter Verwendung der MDA-MB-231 und MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien für die stabile Expression von Firefly Luziferase entwickelt (Fluc) und enhanced green fluorescent protein (EGFP) und die Transposase Plasmid pK / hUbiC-SB11 45,46. HINWEIS: Die transfizierten Zelllinien werden als MDA-MB-231-FluC-EGFP und MCF-7-FluC-EGFP bezeichnet. </li></ol> 2. Isolieren Tissue Fragments von Hüftköpfe <ol><li> Nach THR Chirurgie, sammeln die verworfen Hüftkopf in einem sterilen Behälter mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Die Probe wird im Labor und verarbeiten es in 1-3 Stunden nach der Operation. Hinweis: wenn es eine Verzögerung in der Verarbeitung, Man gibt die Probe bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie einen Arbeitsbereich, indem Sie die folgenden Elemente auf einem saugfähigen Matte in einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube: sterile Handschuhe, chirurgische Zange, Zangen, Becherglas mit 70% igem Isopropanol, Instrumente und Gewebekulturgefäße gründlich wie unten für jede Art von Experiment festgelegt . </li><li> Das Tragen eines sterilen OP-Handschuh, um die Runde Femurkopf in einer Hand zu halten, verwenden Sie die Zange in der anderen Hand, um Trabekelknochen Fragmente gewünschter Größe (~ 2-5 mm) von der freiliegenden oberen Welle des Oberschenkelknochens zu extrahieren. Übertragen Knochenfragmente in das Kulturgefäß (beispielsweise 6, 12 oder 24-Well-Gewebekulturplatte oder Migration Kammer), abhängig von der Art der Proliferation, colonization oder Migration Experiment wie in den Schritten 3, 4 oder 5 beschrieben. HINWEIS: Knochengewebefragmenten sollte wie oben, nachdem Sie die ersten Schritte für jede spezifische Proliferation, Kolonisierung oder Migrationsassay beschrieben geerntet werden. Fragmente in einem Größenbereich, wie in Abbildung 2 dargestellt. Fragmente können vor oder nach Versuchen zum Zwecke der Standardisierung abzuwägen. </li></ol> 3. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen Angrenzend an Knochenfragmente zu Brustzellproliferation messen Mit BLI <ol><li> Vor dem Experiment Eine Suspension, die 2 x 10 5 Brustkrebszellen / 50 ul, und bereiten Stopfen aus Knochenwachs zur Immobilisierung von Knochenfragmenten in Kultur. Schneiden Sie ein P200 Mikropipettenspitze in 3 Teile, verwenden Sie das schmale Ende der größte Stück in einem &quot;Cookie-Cutter&quot; Art und Weise, um kleine (~ 35 mg) Knochenstücke Wachs geschnitten. Verwenden Sie das breite Ende der kleinste Stück, um die Knochenwachs Stecker in eine Petrischale ausgeworfenfür die Lagerung. </li><li> Legen Sie ein Stück Knochenwachs auf der 12-Uhr-Position jeder Vertiefung und drücken Sie leicht mit einem sterilen Handschuhen Zeigefinger. </li><li> Je 50 ul der Zellsuspension mit 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in der Mitte jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. (Alternativ Samenzellen in einem verteilten Muster, falls gewünscht.) Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. </li><li> Zeigen 1 Knochenfragment auf 1 Stück Knochen Wachs für jeden experimentellen gut und sanften Druck mit der Knochenzange, um sie zu sichern. Führen Experimenten in dreifacher Ausfertigung, dass 3 Knochenfragmente von einem bestimmten THR Probe werden in den ersten drei Vertiefungen gegeben, während die unteren drei Brunnen enthalten Knochenwachs nur als Kontrolle. </li><li> Unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam zu liefern 5 ml DMEM-10% FBS zu der Seite jeder Vertiefung zu vermeiden Verdrängen der Brustzellen oder Knochenfragmenten. Die Platte wird in eine 3776; C Gewebekultur-Inkubator für 20-24 Std. </li><li> Um Biolumineszenz-Bildgebung durchzuführen (BLI) entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Luciferinsubstrat (um eine Konzentration von 300 ug / ml zu erreichen) in jede Vertiefung. Bild die Platte sofort in einem IVIS Imaging Platform mit den folgenden Parametern: Blende von 1, kleine Binning, Belichtungszeit von 1 Sekunde, Ebene D. Messen Sie die Signalintensität der einzelnen sowie durchschnittliche Strahldichte (Photonen / Sekunde / Quadratzentimeter / Steradiant). </li><li> Verwenden Sie Imaging-Software zu definieren, Regions of Interest (ROI), die durchschnittliche Strahlung für alle experimentellen und Kontrollvertiefungen zu quantifizieren. Export durchschnittliche Strahlungswerte in ein Excel-Blatt, Statistiken führen und Grafiken erstellen. </li></ol> 4. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen direkt Gesetzte Auf Knochenfragmente zur Kolonisation und Cell Number Studieren <ol><li> Verwenden einer Pinzette, um Knochenfragmente direkt in die leeren Wells einer 24-Well-Gewebekulturplatte (1 Fragment / Vertiefung) zu platzieren. </li><li> Pipette 50 ul Zellsuspension Tröpfchen aus DMEM-10% FBS mit 1 X 3-6 Oktober Brustkrebszellen direkt aufeinander Knochenfragment. Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. Hinzuzufügen sanft 1-2 ml DMEM-10% FBS in die Seite jeder Vertiefung, so daß das Fragment wird vollständig in einem Medium eingetaucht ist. Inkubieren der Platte in einem 37 ° C Brutschrank für 20-24 Std. </li><li> Nach der Inkubation verwenden Pinzette jedes Knochengewebefragment in ein frisches 24-Well-Platte mit 1 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung zu übertragen. Um BLI durchzuführen, führen Sie die Schritte 3,6-3,7 oben. Zusätzlich können Fragmente mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, oder gespült, um den Markpopulation für Analysen der Brustkrebs-Zellzahlen und den Eigenschaften wie in Schritt 6 beschrieben, erhalten. </li><li> Um die intakten Fragmente zur qualitativen Bewertung durch Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet folgenden BLI, Pipette 5 ul von fluoreszierenden Bisphosphonat Markierungslösung (preVergleich nach den Anweisungen des Herstellers) in jede Vertiefung, um die mineralisierte spicules der Knochenfragmente zu markieren. Die Platte in der Gewebekultur-Inkubator für weitere 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden der Kultur in der Leuchtstoff Bisphosphonat Etikettierungslösung Verwenden einer Pinzette, um die Fragmente zu Gewebekulturplatten mit Phenolrot-freiem Medium und Ausblick mit einem Fluoreszenzmikroskop für Bild GFP (485 nm) und Bisphosphonat-Etikett (680 nm) konfiguriert übertragen. </li></ol> 5. Mess Migration von Brustkrebszellen zu Knochengewebe Fragmente und kultivierten Knochenfragment Stände <ol><li> Migration in Richtung Knochengewebekulturüberstand. HINWEIS: Führen Experimenten in dreifacher Ausführung, so daß 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe verwendet werden, um 3-Überstände zu erzeugen. Für jedes Experiment wird die Migration auf drei Vertiefungen, die Knochenüberständen gegen drei Brunnen, die nur Steuermedium verglichen. <ol><li> Geneknochen tisklagen Ständen indem Knochenfragmente in die Wells einer 12-Well-Platte mit 2,2 ml DMEM-10% FBS pro Mulde. Kultur in einem 37 ° C Brutschrank für 24 Stunden. Ziehen Sie das Medium nach 24 Stunden und ersetzen mit 2,2 ml frischem DMEM-10% FBS. Treat Kontrollvertiefungen enthaltenden DMEM-10% FBS in der gleichen Weise. HINWEIS: Das Medium wird nach 24 Stunden geändert, um Faktoren als Reaktion auf Gewebetrauma nach einer Operation erfolgen abgesondert zu entfernen. Weil Knochengewebe Überstände werden in generierten FBS enthaltenden Medium, Vertiefungen, die FBS enthaltenden Medium nur enthalten, um für die Beiträge der FBS, um Brustkrebs-Zellmigration steuern. </li><li> Nach 48 Stunden, sammeln 0,9 ml jedes Überstands / Steuermedium und Pipette in die Vertiefungen einer Aufnahmeplatte. Die Einsätze werden später in diese Vertiefungen gelegt werden. Inkubieren Sie die Aufnahmeplatte in der Gewebekultur-Inkubator während der Aussaat der Einsätze. Hinweis: Der verbleibende Überstand (~ 1 ml nach dem Eindampfen) können für die Analyse von Sekretom facto gesammeltrs auf Wunsch 44. </li><li> Um die Transwell-Einsätze Saatgut, legen Sie sie in ein Standard, leere 24-Well-Gewebekulturplatte. Pipette 350 ul Zellsuspension, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS auf das obere, innere Membranoberfläche jedes Einsatzes, wie in 1A gezeigt. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die die gesetzten Einsätze in den 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Befestigung zu fördern. </li><li> Sobald die Zellen an den Einsätzen befestigt sind, verwenden Zange, um die Einsätze an der Aufnahmeplatte nach den Anweisungen des Herstellers übertragen. Angle jeder Einsatz, wenn Sie diese in den Receiver auch um eine Blasenbildung zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch Überstand zu verhindern. Inkubieren des Empfängerplatte mit Einlagen für 20 h in einem 37 ° C Brutschrank. HINWEIS: Blasen zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch supernatan Überprüfen Sie die Unterseite der Aufnahmeplattet. Sind Blasen sichtbar, entfernen Sie die spezifische Einsätze und legen Sie sie wieder in den Empfänger gut, bis keine Luftblasen vorhanden sind. </li><li> Nach 20 h Verwendung einer Pinzette, um die Einsätze von der Aufnahmeplatte zu entfernen. Unter Verwendung der Verfahren in Schritten von 3,6 bis 3,7 durchgeführt BLI für Bild in die Zellen, die in migriert und auf den Boden der Aufnahmeplatte Brunnen angeschlossen haben. </li></ol></li><li> Migration in Richtung Knochengewebefragmenten. HINWEIS: Führen Sie Versuche in dreifacher Ausfertigung, dass 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe werden in 3 verschiedene Inserts platziert und 3 Glasperlen werden in 3 verschiedene Einsätze als Kontrollen gelegt. <ol><li> Bereiten Sie die Aufnahmeplatte durch Pipettieren von 0,9 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung. Legen Sie sie in den Brutschrank, während der Vorbereitung der Einsätze. </li><li> Um die Einsätze Saatgut, kehren sie auf der Oberfläche eines Kunststoffmikrozentrifugenröhrchen Box, die einen Deckel hat. Pipettieren Sie 50 ul Zellsuspension Tropfen DMEM-10% FBS, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen direkt auf die äußere, untere Fläche jedes Einsatzes Membran (zugewandte auf der invertierten Einsätze). Bedecken Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Box mit dem Deckel aufgeschlagen und übertragen sie an die 37 ° C-Inkubator Gewebe für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. </li><li> Übertragen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Feld, um die Gewebekultur Kapuze, und verwenden Sie Pinzette, um die gesetzten Einsätze rechten Seite nach oben drehen und sie in die Vertiefungen der Aufnahmeplatte. Pipette 0,450 ml DMEM-10% FBS in jede Einsatzschale. Mit einer Pinzette, übertragen Sie einen Knochengewebe Fragment (ca. 3 mm) in jede vorbereitete Einsatzschale. Optional können Sie mit Glasperlen als negative Kontrollen in weitere Bohrungen. Die Platte wird in einem Gewebekultur-Inkubator für 20 Stunden. </li><li> Um die Migration zu messen, bereiten Sie einen Standard-24-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml DMEM-10% FBS pro Vertiefung. Entfernen Sie die Aufnahmeplatte aus dem Inkubator und verwenden Pinzette, um die Knochenfragmente und Perlen aus jeweils in separate Vertiefungen der Standardplatte übertragen einfügen. Luciferin hinzufügenSubstrat in jede Vertiefung (um eine Endkonzentration von 300 ug / ml zu erreichen) und führen BLI unter Verwendung der Verfahren in den Schritten 3,6-3,7. </li></ol></li></ol> 6. Zusätzliche Pre- und Post-experimentellen Analysen <ol><li> Analyse gespült Mark. <ol><li> Übertragen einer Knochenfragment in eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb an der Spitze einer konischen 50 ml-Röhrchen gegeben. Verwenden einer 10 ml-Spritze mit einer 25 G Nadel, um kräftig zu spülen das Fragment mit 10 ml PBS, um eine Suspension von Knochenmarkzellen in der konischen Röhre zu erhalten. Zentrifuge wurde die Zellsuspension 3 Minuten bei 300 × g und 21 ° C, saugt den Überstand und Resuspendieren der pelletierten Zellen in PBS oder andere gewünschte Lösung für die Durchflusszytometrie. HINWEIS: Resuspension Volumen wird in Abhängigkeit von der Größe der Zellpellet nach der Zentrifugation und der Anwendung variieren. </li><li> Für Lebensfähigkeitstests ~ 75-300 ul-Volumina von PBS angemessen sind, und diese Suspensionen können analysiert werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen fluorescence basierend Lebensfähigkeitstests nach den Anweisungen des Herstellers, pipettiert in einen herkömmlichen Hämozytometer und mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop gezählt. </li><li> Für die Durchflusszytometrie oder Sortierung basierend auf der Erfassung GFP-positiven Brustkrebszellen, Zellpellet in 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS, 2 mM EDTA und 10 mM HEPES, so dass die Konzentration 1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E-Färbung und Immunhistochemie. <ol><li> Um die Fragmente für Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung und / oder Immunhistochemie Dabei legen die Fragmente in Plastikkassetten mit einer Nummer 2 Bleistift markiert, und tauchen in einen Behälter mit 10% gepuffertem Formalin für 24 Stunden aufgefüllt. </li><li> Prozess-Gewebe für Paraffineinbettung, Schneiden und Färben Verwendung von Routineprotokollen, die eine Entkalkung Schritt für die mineralisierten Nadeln in jedem Fragment Konto gehören. </li></ol></li></ol>

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Mehra et al. Wurden bereits beschrieben die Obduktion Sammlung und Analyse von Knochenproben von metastasierendem Prostatakrebs-Patienten zum Zeitpunkt der Autopsie entnommen und enthüllt hochwertigen Gewebe und Validierung der Verwendung von menschlichen Knochenproben, um die metastatischen Prozess 47 zu studieren. Hier haben wir Protokolle zur Erhebung, Verarbeitung und Nutzung von menschlichen verworfen Femurköpfe folgenden THR Operation in einer kurzfristigen Co-Kultursystem, um Brustzellmigrat...

Die Tumor-Mikroumgebung wird weithin als ein kritischer Faktor für die Krebszelle Verhalten bei Brustkrebs Progression und Metastasen erkannt verteilt 1-3. Das Ziel der hier vorgestellten Verfahren ist die Untersuchung von Brustkrebs-Zellen in der Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe, die häufigste Stelle der Brustkrebsmetastase 4-6 erleichtern. Knochen von mineralisierten und Mark Fächer 7-9, die beide beherbergen Zellen sezerniert Faktoren bei metastasierendem Progression 10,11 verwickelt zusammen. Obwohl weit verbreitet in vivo Mausmodellen zu erleichtern systemische Studien des metastatischen Prozesses 12-15, Zell-Wechselwirkungen innerhalb des Skeletts sind nicht für die Beobachtung und direkten Störung leicht zugänglich. Modellsysteme für die Untersuchung und Kultivierung von Maus-Knochengewebe und Knochenmarkzellen der Maus einen besseren Zugang und haben viele Erkenntnisse über Sprechen und Mechanismen, die Brustkrebs-Zell m ergabetastasis der murinen Gerüst 16-22. Studien haben jedoch ergeben, dass es artspezifische Muster osteotropism für Knochengewebe 23,24 sein. Diese Muster inhärent speziesspezifische Unterschiede in der Knochengewebeeigenschaften, von Differenzen aus veränderten Knochenmarkspopulationen in immundefizienten Mäusen 11 und / oder der relativ jungen Alter der Mäuse in Experimenten verwendet, von denen alle voraussichtlich Determinanten des Knochens beziehen könnte Mikroumgebung. In vitro-Ansätzen zur Untersuchung Brustkrebszellen in menschlichen Knochen Kokulturen wurden typischerweise auf bestimmten Knochenzelltypen wie Mark abgeleiteten Osteoblasten oder Stromazellen als Monolayer kultiviert oder in konstruierte 3-dimensionale Modellsysteme 25-35 konzentriert. Obwohl 2-dimensionalen Zellkulturmodellen haben die Hauptstütze der in vitro gebildeten Ansätze für die Krebsforschung ist seit langem bekannt, dass das Zellverhalten ist grundsätzlich in m verändertonolayer Kultursystemen 18,36,37. Dies hat zur Entwicklung von technisch Mikroumgebungen, die die Komplexität von 3-dimensionalen lebenden Geweben, einschließlich Matrix- und Gerüst basierende Modelle von natürlichen Materialien wie Collagen nachahmen geführt, oder synthetische Polymere geimpft mit spezifischen Zelltypen, die gewebeartige Mikroumgebungen zu schaffen 36-41. Engineered Ansätze haben auch die Verwendung von Bioreaktor Plattformen zu kontrollieren und zu untersuchen das hormonelle Milieu der Mikro 18,19,41-43. Obwohl biomimetische Modelle und Bioreaktoren bieten viele Elemente eines komplexen Gewebemikroumgebung, in einer kontrollierten Umgebung und wurden erfolgreich angewendet, um die Studie von Brustkrebs Metastasen in Knochen 18,19,35,42,43 voranzubringen, müssen entwickelt Modellsysteme in der Regel nicht übernehmen das gesamte Spektrum von Zelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten innerhalb der nativen Knochen Umwelt vorhanden. Bis vor kurzem BrustkrebsZellen wurden nicht innerhalb der nativen intakten, 3-dimensional-Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe untersucht worden. Vor kurzem berichteten wir die Entwicklung eines Co-Kultur-Modell mit menschlichen Knochengewebefragmenten aus Hüft isoliert (THR) Chirurgie Proben 44. Diese Proben bergen sowohl die Mineralisierung und Knochenmark Fächer notwendig, Mechanismen Mikrometastasen in Kurzzeitkultur zugrunde zu studieren. In früheren Arbeiten haben wir Proof-of-Prinzip für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), die Proliferation von Luciferase-exprimierenden Brustkrebszellen (MDA-MB-231-Fluc) co-kultiviert mit Knochenfragmente 44 zu überwachen. Hier haben wir für das Studium der Brust Zellkrebs Proliferation, Kolonisierung und Migration im Rahmen der nativen Mikroumgebung mit menschlichen Knochen Gewebeexplantaten Gehende bestehende experimentelle Protokolle. Zuerst ein Protokoll für Co-Kultivierung Brustkrebszellen neben Knochenfragmenten an Brust messen präsentieren wirZellproliferation mit BLI. In diesem Abschnitt werden die Brustzellsuspensionen Zellflecken in 6-well Platten angrenzend an Knochenfragmente, die durch Stücke von Knochenwachs immobilisiert werden ausgesät. Kontrollvertiefungen enthalten Knochenwachs, aber keine Knochenfragment. Sobald Zellflecken zu befestigen, ist Medium gegeben und die Platte wird für 24 Stunden, nach der Biolumineszenz-Signalintensität (mit Zellzahl assoziiert) mit BLI gemessen kultiviert. Im nächsten Schritt stellen wir Verfahren zur Co-Kultivierung Brustkrebszellen direkt auf Knochenfragmente beimpft, um Ansiedlung und Vermehrung zu studieren. Hier werden die Brustzellsuspensionen werden direkt auf die Knochengewebefragmenten, die in Kultur durch BLI und Fluoreszenzmikroskopie über die Zeit überwacht werden, um Kolonisation und Zellzahl verfolgen pipettiert. In diesem Verfahren wird der Markraum kann von den Knochenfragmenten zu jedem Zeitpunkt für die Analyse von kolonisierten Brustkrebszellen durch Durchflusszytometrie gespült werden oder Mark-Lebensfähigkeitstests. Darüber hinaus haben wir deSchreiber zwei verschiedene Ansätze zur Messung von Brustkrebszellmigration. Im ersten Verfahren wird zur Messung der Migration in Richtung Knochengewebekulturüberständen Schritten beschrieben. In diesem Protokoll die Brustkrebszellen ausgesät werden, auf die inneren, oberen Flächen der Transwell einfügen Membranen mit einer 8 um Porengröße (wie in 1A gezeigt). Die Einsätze werden dann in einer Aufnahmeplatte mit Vertiefungen, die Knochengewebe Überstand oder Kontrollmedium platziert. Im Laufe von 20 Stunden Inkubationszeit eine kleine Anzahl von Brustkrebszellen wandern durch den Einsatz Membranen in die unteren Gewebekulturvertiefungen, wo sie für den Nachweis durch BLI befestigen. In der zweiten Migrations-Verfahren die Brustkrebszellen werden auf die untere Außenflächen Transwell-Einsatz Membranen ausgesät. Knochengewebefragmente werden in die Einsatzschalen gelegt und die Brustkrebszellen wandern nach oben durch die Membranen an den Knochenfragmenten zu kolonisieren (wie in 1B dargestellt), diewerden dann aufgenommen mit BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Bone ist die häufigste Stelle der Metastasierung von Brustkrebs. Obwohl es allgemein, dass der Mikro Einflüsse Krebszellverhalten akzeptiert wird, wird wenig über Brustkrebszell Eigenschaften und Verhaltensweisen in der nativen Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe bekannt. Wir haben Ansätze zu verfolgen, zu quantifizieren und zu modulieren menschlichen Brustkrebszellen in der Mikroumgebung des entwickelten kultivierten menschlichen Knochengewebefragmenten aus gebrauchten Femurköpfe nach Hüft-TEP Operationen isoliert. Verwendung Brustkrebszellen für Luciferase konstruiert und verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) Expression sind wir in der Lage, reproduzierbar zu quantifizieren Migration und Proliferation Muster mit Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), Spur Zell-Wechselwirkungen innerhalb der Knochenfragmente mittels Fluoreszenzmikroskopie und auszuwerten Brustzellen nach Besiedlung mit Durchflusszytometrie. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind: 1) eine native, architektonisch intaktem Gewebe MicroEnvironment relevanten Zelltypen des Menschen beinhaltet, und 2) direkten Zugriff auf die Mikroumgebung, die eine schnelle quantitative und qualitative Überwachung und Störung der Brust und Knochenzelleigenschaften, Verhaltensweisen und Interaktionen ermöglicht. Eine Haupteinschränkung, derzeit ist die finite Lebensfähigkeit der Gewebefragmente, die das Fenster der Studie, um Kurzzeitkultur beschränkt. Anwendungen des Modellsystems umfassen die Untersuchung der Grundlagen der Biologie von Brustkrebs und anderen Knochensuchmalignomen in der metastatischen Nische, und die Entwicklung therapeutischer Strategien zur zielgerichteter Brustkrebszellen in Knochengewebe.

Isolieren von Gewebefragmenten aus Hüftköpfe Kugelköpfe wurden aus einer gleichen Anzahl von männlichen und weiblichen Patienten (44-90 Jahre) nach elektiven Hüft-Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Jedes verworfen Hüftkopf enthält einen kleinen Teil des oberen Oberschenkel, die trabekuläre Knochengewebe des mineralisierten Nadeln und Mark zusammen birgt. Dieses Gewebe ist durch die chirurgisch freiQuerSchn...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine.  Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben. 

Serie: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Forschung

Medizin

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

Der Einsatz von Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) an Protein Expression Variation innerhalb der einzelnen Renal Cell Cancers erkunden

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...