Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen bei der Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu beantworten, indem sie die Untersuchung der kodierenden, nicht-kodierenden und viralen RNA-Expression ermöglicht, die an der Resonanz auf das Wirt-Amino-Response beteiligt ist, sowie wie ein Erreger die biologischen Funktionen des Wirts beeinflussen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie ein Protokoll präsentiert, das für die Verarbeitung von mRNA und nicht-kodierender RNA aus globinreduzierten RNAseq-Bibliotheken aus einer einzigen Vollblutprobe optimiert ist. Die Technik wird Sarah Anderson demonstrieren, eine Technikerin aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Zentrifugierung der Blutröhrchen bei 50 20 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wenn Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank arbeiten, fügen Sie nach dem Entfernen des Überstandes acht Milliliter RNase-freies Wasser in das Pellet ein. Schließen Sie die Rohre und wirbeln Sie das Pellet, bis es sichtbar gelöst ist, zentrifugieren Sie dann die Rohre bei 50 20 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um das Pellet zurückzugewinnen.
Arbeiten Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank, entsorgen Sie den Überstand und retten Sie das Pellet. Um die gesamte RNA zu isolieren, beginnen Sie mit der Pipettierung von 300 Mikroliterlysebindungspuffer an das Pellet. Nach dem Wirbeln das Gemisch aus jedem Rohr in ein neu beschriftetes 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen.
Fügen Sie 30 Mikroliter homogenaten Additiv aus dem miRNA Isolationkit hinzu. Wirbeln Sie die Rohre und legen Sie auf dem Eis für 10 Minuten. In einer Dunstabzugshaube arbeiten, die Schläuche vom Eis entfernen und 300 Mikroliter des Säurephenolchlorformreagenzes aus dem Kit hinzufügen und wieder wirbeln.
Nach zentrifugieren bei 10.000 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, vorsichtig wässrige Phase zu einem neuen Rohr entfernen. Basierend auf der Menge der wässrigen Erholung aus dem vorherigen Schritt, fügen Sie das 1,25-fache des Volumens von 100%Ethanol zu dem wässrigen Phagen in jedem Rohr und Pipette zu mischen. Bereiten Sie frische Sammelrohre vor, die eine Filterpatrone für jede Probe enthalten.
Pipetten Sie ca. 675 Mikroliter des Lysat-Ethanol-Gemischs auf die Filterpatrone. Zentrifuge kurz bei 10.000 mal G, um Flüssigkeit durch den Filter zu leiten. Entsorgen Sie den Durchfluss.
Wiederholen Sie das Lysat-Ethanol-Gemisch, das dem Filter und der Zentrifugation zufügt, bis es vollständig verwendet wurde. Fügen Sie 700 Mikroliter Waschlösung eins aus dem Kit in die Filterpatrone. Zentrifuge kurz, um die Lösung durch die Filter zu ziehen.
Entsorgen Sie den Durchfluss und bewahren Sie die gleichen Filterpatronen und Sammelrohre auf. Fügen Sie 500 Mikroliter Waschlösung zwei-drei zu jeder Filterpatrone. Nach dem zentrieren den Durchfluss abwerfen und den Waschschritt wiederholen.
Um Restflüssigkeit aus den Filterpatronen zu entfernen, drehen Sie sie zusätzlich 60 Sekunden. Übertragen Sie die Patronen in frische Sammelrohre. Fügen Sie 100 Mikroliter 95 Grad Celsius vorgeheiztes nukleasefreies Wasser in die Mitte jeder Filterpatrone hinzu.
Zentrifugieren Sie die Patronen ca. 20 bis 30 Sekunden lang an der Tischzentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit. Um die Hybridisierung mit Globinreduktionsoligos zu preformieren, denaturiert man zunächst die RNA, indem jede extrahierte Probe in ein 0,2 Milliliter dünnwandiges Nuklease-freies Reaktionsrohr eingebracht wird. Legen Sie die Rohre in einem thermischen Cycler bei 70 Grad Celsius für zwei Minuten.
Danach die Röhren sofort auf Eis legen, um eine optimale RNA-Qualität zu erhalten. Während die Rohre abkühlen, bereiten Sie 400 Mikroliter 10X Globin Reduktion Oligo-Mix und 10X Oligo Hybridisierung Puffer in einem Zwei-Milliliter-Rohr. Um den Hybridisierungsmix zu machen, fügen Sie sechs Mikrogramm RNA-Probe, zwei Mikroliter des 10X Globin-Reduktions-Oligo-Mix, einen Mikroliter 10X Oligo-Hybridisierungspuffer und nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 10 Mikrolitern zu jedem 0,2 Milliliter dünnwandigen, nukleasefreien Reaktionsrohr hinzu.
Legen Sie die Rohre in den thermischen Cycler bei 70 Grad Celsius für zwei Minuten. Danach sofort die Rohre auf Eis legen. Um die RNase H-Verdauung durchzuführen, verdünnen Sie zunächst 10X RNase H zu einem X RNase H mit einem X RNase H Puffer.
Bereiten Sie den RNase H-Reaktionsmix vor, indem Sie zwei Mikroliter 10-fachen RNase-Puffer, einen Mikroliter RNase-Inhibitor und zwei Mikroliter einer X RNase H und fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern kombinieren. 10 Mikroliter des RNase H-Reaktionsmixes zu den Globin-Reduktions-Hybridisierungsproben hinzufügen und gründlich mischen. Diese Reaktion bei 37 Grad Celsius 10 Minuten verdauen und dann auf vier Grad Celsius abkühlen lassen.
Beenden Sie die Verdauung, indem Sie dem Rohr einen Mikroliter 0,5 Molaren EDTA hinzufügen, und übertragen Sie den gesamten Inhalt der Röhre in ein frisches 1,5-Milliliter-Rohr. Unmittelbar danach 80 Mikroliter RNase-freies Wasser, 350 Mikroliter Lysepuffer, dann 250 Mikroliter 100% Ethanol in jedes Rohr geben und durch Pipettieren gut vermischen. Übertragen Sie jede 700-Mikroliter-Probe in eine separate Elutionsfilterpatrone, die in ein Zwei-Milliliter-Sammelrohr gelegt wird, um den Durchfluss zu erfassen.
Zentrifugieren Sie 15 Sekunden lang bei 8.000 mal G oder mehr und entsorgen Sie dann den Durchfluss. Legen Sie die gleichen Elutionsfilterpatronen in neue Zwei-Milliliter-Sammelrohre. Um die Filterpatronenmembranen zu waschen, fügen Sie 500 Mikroliter des milden Waschpuffers für 15 Sekunden bei 8.000 mal G oder mehr in die Filterpatronen und Zentrifuge ein.
Entsorgen Sie den Durchfluss. Dann, mit den gleichen Sammelrohren, fügen Sie 500 Mikroliter 80% Ethanol zu den Filterpatronen. Zentrifuge für zwei Minuten bei 8 000 mal G und größer.
Entsorgen Sie sowohl die Durchfluss- als auch die Sammelrohre, und speichern Sie die Elutionspin-Säulen. Platzieren Sie jede Elutionspin-Spalte in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelrohr. Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit für fünf Minuten mit dem offenen Deckel auf Filterpatronen, um die Spinsäulenmembranen zu trocknen und Ethanol-Übertragung zu verhindern.
Nach dem Entsorgen der Sammelrohre jede getrocknete Filterpatrone in ein frisches 1,5-Milliliter-Sammelrohr geben. Fügen Sie 14 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt in die Mitte der Filterpatronenmembran. Um die RNA zu elute, zentrifugieren Sie die Röhren für 60 Sekunden bei voller Geschwindigkeit und dann mit der weiteren RNA-Bewertung und -Vorbereitung fortfahren.
Die globin-depleted Probe kann nun geteilt und zur Vorbereitung der kleinen, nicht-kodierenden RNA-Bibliotheken sowie der ribo-depleted mRNA und langen, nicht-kodierenden RNA-Bibliotheken verwendet werden. Nach der Vorbereitung von Expressionsbibliotheken der globin-depleted und ribo-depleted Vollblutproben mit diesem Protokoll, Electrophorese File Run Zusammenfassung zeigte eine globin-depleted Bibliothek Probe mit RNA-Integritätsnummern, die von 6,3 bis 9,2. Dies erwies sich als eine Verbesserung im Vergleich zu anderen Studien, die Globin-Depletion-Methoden verwendeten und nur bei oder bei sechs RIN-Zahlen erreichten.
Die Präglobin-Reduktion und die Post-Globin-Reduktion einer einzigen Schweine-Vollblutprobe zeigten, dass 260 bis 280 Nanometer Konzentrationsverhältnisse bei oder über zwei liegen. Mit diesem Protokoll wurden chipbasierte Elektropherogramme von globin- und ribo-erschöpften MRNA-Bibliotheksproben vor dem Pooling und der Sequenzierung erhalten. Für die mRNA-Bibliotheken hat das repräsentative Elektropherogramm einen Spitzenwert von etwa 280 Basenpaaren.
Für die kleinen ncRNAs enthalten repräsentative Chip-basierte Elektropherogramme eine Reihe von Peaks von ca. 100 bis 400 Basenpaaren. Spitzen bei etwa 143 Basenpaaren entsprechen miRNAs, und Spitzen bei etwa 153 Basenpaaren entsprechen piRNAs. Beim Versuch dieses Verfahrens, Ist es wichtig, sich daran zu erinnern, Eisröhren sofort zu erinnern, wo festgestellt.
Nach diesem Verfahren sollten andere Methoden wie die Sequenzierung der nächsten Generation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Differentialexpression, epigenetische Veränderungen und ihre Auswirkungen auf biologische Bahnen und Prozesse zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenol-Chlorform-Reagenz extrem gefährlich ist und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einer Dunstabzugshaube getroffen werden sollten. Auch beim Umgang mit Vollblut oder infektiösen Organismen sollten Arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank vor einer Aktivierung des infektiösen Organismus durchgeführt werden.
