Die Autoren bedanken sich bei Dr. Alain Trautmann, der uns zu Lymphknoten-Scheiben durchzuführen ermutigt danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Ligue Nationale Contre le Cancer, der Fondation pour la Recherche Médicale en France und die Association pour la recherche sur le Cancer unterstützt.

1. Vorbereitung Scheiben von Lymphknoten <ol><li> Bereiten Sie eine 4% niedriger Schmelzpunkt Agarose-Lösung für die Einbettung. Verdünnen Agarose in PBS und Mikrowelle dieser Lösung. Wenn der Agarose vollständig gelöst ist, warten die Lösung bei 37 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 6-well Gewebekulturplatte. Fügen Sie 1,1 ml RPMI komplettem Kulturmedium pro Vertiefung, und fügen Sie ein organotypischen Filter in jede Vertiefung. Legen Sie die 6-Well-Platte bei 4 ° C bis zu seiner Scheiben übertragen. </li><li> Legen Sie Unterlegscheiben aus Edelstahl, mit einem Innendurchmesser von 4 mm, in einer Plastikschale mit RPMI komplett gefüllt ist. Unterlegscheiben weiter verwendet werden, um die Zellen auf der Vibratom Anschnitt zu konzentrieren. </li><li> Sacrifice der Maus in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzvorschriften. Entfernen Sie vorsichtig den peripheren Lymphknoten aus dem umgebenden Gewebe und legen Sie sie in einer Plastikschale mit eiskaltem PBS. Es ist darauf zu achten, dass die Lymphknoten Struktur beschädigt werden, da diese Organe sehr weich sind. </li><li> Gießen Sie die 4%-igen Agarosegel in eine 35-mm-Kunststoff-Schale und zart Übertragung der Knoten in das Gel. Lassen Sie das Agarosegel auf Eis für 5 min zu verhärten. </li><li> Entfernen Sie den Block aus der Schale und schneiden Sie die Agar um 3-5 mm Gel um jeden Lymphknoten zu verlassen. </li><li> Befestigen Sie den eingebetteten Knoten auf der Probe Festplatte des Vibratom mit ungiftigen Gewebekleber. Installieren Sie die Probe Festplatte in das Fach mit eiskaltem PBS gefüllt. </li><li> Section der Agar-eingebetteten Gewebe bei 320 mu m Dicke mit dem Vibratom Geschwindigkeit auf einem langsamen Bereich eingestellt (0,3 mm / s) und die Schwingungsfrequenz auf einem mittleren Bereich (1,5 mm) eingestellt. </li><li> Sorgfältig Transfer Lymphknoten Scheiben, wie sie sein auf der organotypischen Kultur Inserts mit feinen Pinzetten geschnitten werden. Platz 3 Scheiben auf jeder Einsatz. Seien Sie sehr vorsichtig, als Scheiben leicht beschädigt werden kann. Eine typische periphere Lymphknoten wird Ausbeute 5 Abschnitte, wenn sie bei 320 um geschnitten. Entsorgen Sie die erste und letzte Scheiben, als sie enthalten nur oberflächliche Gewebe. </li><li> Legen Sie Unterlegscheiben aus Edelstahl auf jedem einzelnen Stück. Stellen Sie sicher, Unterlegscheiben sind auf dem Agarose umgebende Gewebe positioniert. </li><li> Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bis ready-to-Plate-T-Zellen. </li></ol> 2. Isolating T-Zellen aus der Maus Lymphknoten <ol><li> Isolieren T-Zellen nach dem zuvor veröffentlichten JoVE Artikel 3. </li><li> Verwenden Sie T-Zellen sofort und gehen zum nächsten Abschnitt. Andernfalls könnte Lymphozyten über Nacht in komplettem RPMI-Medium mit 10 ng / ml IL-7 ergänzt kultiviert werden. </li></ol> 3. Kennzeichnung von isolierten T-Zellen <ol><li> Wash-Zellen in HBSS. Resuspendieren sie in dem gleichen Puffer bei 10 x 10 6 pro ml. </li><li> Fügen Sie das gleiche Volumen HBSS mit 1 uM Zelle Tracker grünen CMFDA eine endgültige Konzentration von 0,5 uM. </li><li> Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 ° C während 5 min. Wash Zellen zweimal mit komplettem RPMI-Medium. </li><li> Die Zellen in einer Endkonzentration von 10 x 10 6 pro ml in komplettem RPMI-Medium. Diese markierten Zellen werden auf die Scheiben beschichtet werden. </li></ol> Andere fluoreszierende Farbstoffe als CMFDA könnte auch genutzt werden, aber bedenken Sie, dass diese Moleküle potentiell toxischen oberhalb bestimmter Konzentrationen sind. 4. Plating markierten T-Zellen auf Lymphknoten-Scheiben <ol><li> Entfernen Sie überschüssiges Medium in den inneren Teil der Scheibe mit einer Pipette enthalten. Nicht in das Gewebe trocken werden, die Arbeit schnell bei diesem Schritt. </li><li> Gently verzichten 10 bis 20 ul markierten T-Zellen, die 1 bis 2 x 10 5 Zellen in den inneren Teil der Scheibe entspricht. Vorsicht ist geboten, um das Gewebe mit der Spitze der Pipette berühren. Achten Sie darauf, dass der Rückgang der Zellsuspension in Ort und Stelle bleibt. </li><li> Legen Sie die Schnitte mit Zellen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für mindestens 30 min, damit Lymphozyten in das Gewebe zu migrieren. </li></ol> 5. Imaging-T-Zellen im Lymphknoten Scheiben In diesem Video-Beitrag, wir Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben mit einem Weitfeld inversen Mikroskop und einem konfokalen Mikroskop aufrecht. <ol><li> Stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C. Unsere Mikroskope sind mit kontrollierter Temperatur Kammern ausgestattet. </li><li> Installieren Sie eine Perfusion System ermöglicht kontinuierliche Perfusion des Lymphknotens Scheibe mit Sauerstoff (5% CO 2, 95% O 2) Phenolrot-freiem RPMI-Medium. In unserem System gibt perfundierten Medien in der Imaging-Kammer von einer Seite durch die Schwerkraft. Das Medium wird mit einer Pumpe verbunden zu einer Sammelstelle Kolben gesaugt. Legen Sie die Medien Durchfluss auf 1 ml / min. </li><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig herausnehmen Scheibe aus dem 6-Well-Platte und tauchen die Vorbereitung in erwärmt Sauerstoff RPMI-Medium für ein paar Sekunden, um loszuwerden, fluoreszierende Zellen nicht in das Gewebe infiltriert. </li></ol> ImaGing T-Zellen mit einem Weitwinkel-inversen Mikroskop <ol start="4"><li> Platzieren Sie die Scheibe nach oben auf eine maßgeschneiderte Imaging Kammer, die von Nylonfäden auf den inneren Teil einer Glasboden Teller geklebt besteht. In dieser Kammer, heben die Nylonfäden die Scheibe aus dem Glas und aktivieren Sie die Sauerstoff-Lösung in das Gewebe diffundieren. Dies ist erforderlich, da T-Zell-Migration in den Lymphknoten ist stark abhängig von Sauerstoff. Befestigen Sie die Scheibe, indem auf sie ein Edelstahl-Unterlegscheibe. Unter diesen Bedingungen liegt die Scheibe wenige Mikrometer über dem Boden der Schale, die Erneuerung der Perfusionslösung erleichtert. </li><li> Um eine Aufnahme zu großes Sehfeld (800 x 800 um etwa ein Drittel des Knotens Scheibenoberfläche), sammeln Sie Bilder mit einem 10x-Objektiv trocken. Wir fanden, dass die 10x Nikon S fluor 0,5 nA am besten geeignet für unsere Analysen war. </li></ol> Ein typisches Zeitraffer-Imaging-Experiment erfasst 5 optischen Flächen überspannt eine Gesamttiefe von 50 um in axialer (z) Dimension. Fluorescent T-Zellen sind in der Regel in Abständen zwischen 10 bis 30 Sekunden, während 10 bis 20 min belichtet. Imaging-T-Zellen mit einem konfokalen Mikroskop aufrecht Das konfokale Mikroskop im Sinne dieses Protokolls ist ein Leica SP5 mit einem 20x Wasser Immersionsobjektiv (Olympus, 20x/0.95 NA) ausgestattet. <ol start="6"><li> Befestigen Sie die Scheibe auf die Bildgebung des Mikroskops. Hinweis: Wir in der Regel statt einer Scheibe auf die Vorbereitung, um es zu fixieren. </li><li> Set ein bildgebendes Sitzung durch das Sammeln von einer Reihe von Bildern entlang der z-Achse. Um Bild-T-Zellen in intaktem Gewebe-Struktur, ist die Startposition in der Regel bei 5 bis 10 mu m unterhalb der ersten markierten T-Zellen gesetzt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Durch Einhalten dieses video-Protokoll sollten Sie erwarten, dass eine große Anzahl von fluoreszierenden T-Zellen in der T-Zone des Knotens, ein Phänomen, das normalerweise in diesem besonderen Umfeld, in vivo (Abbildung 1) angesammelt zu visualisieren. Insbesondere sollte T-Zellen aus B-Zell-Zonen, die in der Regel sind nur unter der Kapsel ausgeschlossen werden. Ein erfolgreiches Experiment wird auch in T-Zellen in das Gewebe (Abbildung 2) rekrutiert Ergebnis und zeigt eine sehr bewegliche Verhalten (Abbildung 3) im Einklang mit publizierten Ergebnissen in intakten Lymphknoten 4 erhalten. Im Durchschnitt sollte die mittlere Geschwindigkeit der einzelnen T-Zellen innerhalb von Scheiben in der Nähe von 10 pm / min (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. T-Zellen reichern sich in einem Lymphknoten in Scheiben schneiden. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen (CMFDA, grün) zu einem Lymphknoten Scheibe 30 min vor der Bildaufnahme (Bild oben) wurden hinzugefügt. Das Bild ist die maximale Projektion von 5 Bilder für mehr als 50 mu m in z-Richtung. Die Hellfeldbild ist in unten dargestellt. Die Bilder wurden mit einem Weitfeld-Mikroskop aufgenommen. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. T-Zellen werden in einem Lymphknoten Scheibe rekrutiert. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen (CMFDA, grün) zu einem Lymphknoten Scheibe 30 min vor der Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop wurden hinzugefügt. Die Bilder wurden an der Schnittfläche (Bild oben) und 40 um unten (Bild unten) erfasst. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. T-Zellen sind sehr beweglich in einem Lymphknoten in Scheiben schneiden. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen während 12 min mit einem Weitfeld-Mikroskop wurden abgebildet. Flugbahnen der einzelnen T-Zellen werden als farbcodierte Tracks angezeigt zu erhöhen Verschiebungen von blau (geringe bewegliche Zellen) bis rot (hoch bewegliche Zellen) repräsentieren. Tracks wurden mit Imaris Software. Die weiße Linie folgt der Kante des Knotens, während die gestrichelten Oval begrenzt die vermeintliche B-Zell-Zone. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Innerhalb einer Lymphknoten-Scheibe, wird die T-Zell-Geschwindigkeit in der Nähe von 10 pm / min. Die Geschwindigkeiten wurden mit Imaris Software von Tracks in Abbildung 3 dargestellt.

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	<li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li><li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL21+mediates+CD4++T-cell+costimulation+via+a+DOCK2/Rac-dependent+pathway.">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li></ol>

Wir haben eine einfache, schnelle und robuste Technik zur Erzeugung von Lymphknoten Scheiben, die verwendet werden, um das Verhalten der eingeführten T-Zellen zu untersuchen beschrieben sind. In den letzten Jahren wurde diese Methode erfolgreich angewendet mit Thymus-und Lymphknoten-Scheiben an die extrazelluläre Faktoren, die T-Zell-Positionierung und Beweglichkeit 1,5 identifizieren. Es wurde auch verwendet, um Ca 2 + Antworten in Thymozyten messen während positive Selektion und in T-Zellen auf Antigen-Erkennung 2,6. Die Overlay-Scheibe-Test zeigt Vor-und Nachteile, die diskutiert werden sollten. Zu beachten ist, erlaubt dieses System den Zugriff auf das Gewebe, nützlich, wenn man braucht, um Scheiben pharmakologisch zu manipulieren, um mit der molekularen Kontrolle der Zellmigration stören. Im Anschluss an Bildgebung, können die Scheiben für die Immunhistochemie verarbeitet werden, um weitere Informationen über die Strukturen, die abgebildet sind zu sammeln. Darüber hinaus kann die Beobachtung mit einem traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop vorgenommen werden. Obwohl die Auflösung nicht so gut wie mit einem konfokalen oder ein Zwei-Photonen-Mikroskop und daß Phototoxizität ist grundsätzlich schwerer mit Ein-Photonen als mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, hat es den Vorteil der Einfachheit, niedrigere Kosten und größere Auswahl von Anregungswellenlängen. Die Abbildung von T-Zellen in einer intakten Lymphknoten erfordert intravenöse Injektion von markierten Lymphozyten, die anschließend nach Hause zu lymphatischen Organen. Wie wir bereits 1 gezeigt haben, ist die Scheibe Assay vollkommen kompatibel mit adoptiven Transfer zu experimentieren. Allerdings kann die Länge der Zeit für T-Zellen nach Hause in die Lymphknoten notwendig erschweren den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, dass eine Tendenz zur Undichtigkeit aus den Zellen im Laufe der Zeit haben. Dies ist der Fall der Ca 2 + Farbstoff Fura-2. Mit der schnellen Rekrutierung (&lt;30 min) von T-Zellen in das Gewebe, bietet die Scheibe Test die Möglichkeit, solche Farbstoffe verwendet werden. Schließlich hat diese Methode den großen Vorteil, auf T-Zell-Funktionen in verschiedenen menschlichen Geweben analysieren am Leben gehalten. Dieses experimentelle System stellt auch Einschränkungen, die man im Auge behalten werden müssen. Schaden mit dem Schneiden verbundenen beeinflussen können T-Zell-Funktion, vor allem im oberflächennahen Bereich des Gewebes in der Nähe der Schnittfläche. Um Zelltod innerhalb der Schicht zu beurteilen, haben wir den Fluoreszenzfarbstoff SYTOX grün, dass die Zellen dringt mit eingeschränkter Plasmamembran verwendet. Unsere Experimente zeigen, dass etwa 20% der gesamten Knotenpunkt Zellen, meist im oberflächennahen Bereich des Gewebes lokalisiert, fluoreszierend wurden mit diesem nuklearen Farbstoff markiert. Ein weiteres mögliches Problem mit dem Test wird die Fähigkeit der Scheiben, um wichtige lösliche Faktoren wie Chemokine zu behalten. Obwohl wir keinen Hinweis darauf, dass unsere Daten von solchen Problemen betroffen waren, da T-Zellen eine gute Beweglichkeit Anzeige innerhalb der Schicht haben, möchten wir die Bedeutung der bildgebenden T-Zellen in gesunde Regionen an mehreren zehn Mikrometern aus der Schnittfläche befindet Stress. Während diese mit traditionellen Mikroskopen (Weitfeld-oder konfokalen) wie in diesem Protokoll getan werden könnte, ist es wahrscheinlich, dass die Lymphknoten Scheibe Vorbereitung mit Zwei-Photonen-Imaging wird die räumliche Auflösung in der Tiefe zu erhöhen und die Phototoxizität kombiniert.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Feine Pinzetten </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mm Kultur-Einsätze </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> Vollständige RPMI-Medium wird durch Zugabe von 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum und Penicillin / Streptomycin gemacht </td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Low Geliertemperatur Agarose, Typ VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butyl Sekundenkleber, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Unterlegscheiben aus Edelstahl, 4 mm Innendurchmesser </td><td> Baumarkt </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zell-Tracker grünen CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging of t cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes

Naive T-Zellen kontinuierlich Verkehr zu sekundären lymphatischen Organen, einschließlich der peripheren Lymphknoten, um seltene Ausdruck Antigene. Die Migration von T-Zellen in Lymphknoten ist ein komplexer Prozess, der sowohl zelluläre und chemische Faktoren, einschließlich Chemokinen handelt. Kürzlich hat sich der Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie erlaubt T-Zellen in intakten Lymphknoten zu verfolgen und daraus einige quantitative Informationen über ihr Verhalten und ihre Interaktionen mit anderen Zellen. Zwar gibt es offensichtliche Vorteile einer in-vivo-System sind, erfordert dieser Ansatz eine komplexe und teure Instrumente und bietet nur begrenzten Zugang zu dem Gewebe. Zur Analyse des Verhaltens von T-Zellen innerhalb von murinen Lymphknoten, haben wir ein Stück Assay 1, ursprünglich von Neurobiologen gesetzt und vor kurzem auf murine Thymus transponierten 2. entwickelt. In dieser Technik werden fluoreszenzmarkierten T-Zellen nicht auf eine akut vorbereitet Lymphknoten Scheibe beschichtet. In diesem Video-Beitrag werden die Lokalisierung und die Migration von T-Zellen in das Gewebe in Echtzeit mit einem Weitfeld und einem konfokalen Mikroskop analysiert. Die Technik, die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet einen effektiven Ansatz zur Bild-T-Zellen in ihrer natürlichen Umgebung und Mechanismen, die T-Zell-Migration aufzuklären ergänzt.

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Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben eingeführt. Die Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen der T-Zell-Migration mit traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopen.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

16.7K Aufrufe.  Université Paris Descartes, CNRS (UMR 8104). Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben eingeführt. Die Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen der T-Zell-Migration mit traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopen.

Serie: Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.