Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick Stiftung, Dana Foundation, Gabrielle &#39;s Angel-Stiftung, und Hyundai Motors of America &quot;Hope-on-Wheels&quot;-Programm unterstützt.

1. Maus-Halter-Anordnung <ol><li> Überlagern Sie die Abdeckung eines 100-mm-Glas-Petrischale auf der Spitze eines 100-mm-Kunststoff-Petrischale Deckel nach unten zeigt. Das Glas sollte kaum berühren Sie den Mittelpunkt der Plastikschale. Mit dem Glas als Schablone, verfolgen eine Markierung auf der Plastikschale. </li><li> Verwenden Sie eine Handbohrmaschine (dh Dremel), um einen Teil eines 100-mm-Deckel Plastikschale, eine sichelförmige Plattform zu schaffen, zu entfernen. Diese sichelförmigen Kunststoffdeckel wird als Träger für den Oberkörper der Maus (1a) dienen. Bohren Sie zwei Löcher auf der halbmondförmigen Deckel, um die Gasmaske mit einem Metall Bindedraht zu sichern. Sichern Sie den Plastikdeckel an den Rand des Glases Petrischale mit Sekundenkleber oder eine gleich starke Klebstoff (Abbildung 1b). </li><li> Kleber die Deckel von zwei gewölbte Kappe PCR-Röhrchen (Schnitt im Scharnier) 1 cm voneinander entfernt auf die Mitte des Bodens Gericht für den zur Verankerung Kniekehle Hautlappen. </li></ol> 2. Maus-Vorbereitung <strong&gt; Hinweis: Bei ausreichender Übung, man sollte in der Lage sein, um die Maus Vorbereitung und des chirurgischen Schritte in 20-30 Minuten durchführen. <ol><li> Betäuben die Maus mit Isofluran (2 bis 2,5% für Induktion, 1,5 bis 2% für Chirurgie / Imaging) in 1:1 O 2 gemischt: Luft-Gemisch bei einer Fließgeschwindigkeit von 1L/min mit Hilfe eines anerkannten Verfahrens IACUC. Sobald sich die Maus betäubt, sichern eine Gasmaske über die Nase mit Klebeband. Bestimmen Sie, ob die Maus ist vollständig betäubt durch den Mangel an Reaktion auf Zehen-und / oder Schwanz drückt. Die Höhe der Isofluran kann entsprechend angepasst werden, um sicherzustellen, das Tier vollständig betäubt, mit einem stetigen, nicht gearbeitet Atemfrequenz zwischen 60-80 Atemzüge / min. </li><li> Verwenden Sie einen elektrischen Trimmer die Haare auf dem rechten Hinterbein und inguinalen Bereich der Maus zu entfernen. </li><li> Bürsten Sie losen Haare und üben Sie sanften einen bescheidenen Schicht Nair Lotion auf die rasierte Fläche mit einem Wattestäbchen. Nach einer Minute der ersten Anwendung, entfernen Sie den Nair und reinigen Sie die betroffene Haut mit einem feuchtenPapiertuch. Achten Sie darauf, die Maus ist sauber und trocken sein, bevor Sie fortfahren. </li><li> Machen Sie eine kleine 2 bis 3 mm Schnitt mit der Schere am rechten Knie, um die Strecksehne aussetzen. </li><li> Anwenden Vetbond entlang der Mittellinie der Maus Halter, in dem die Maus Körper und Beine angeordnet werden. Sorgfältig sichern die Maus auf den Halter, mit dem rechten Knie nach unten, um die richtige Kniekehle aussetzen. Sichern Sie das rechte Knie Sehne mit Vetbond zwischen den zwei Hautlappen Halter zur Stabilisierung des Bildfeldes. </li><li> Stretch-und Tape die Arme und das linke Bein auf der oberen Plattform des Halters. </li><li> Verwenden Sie einen Bindedraht, um die Gasmaske zu fixieren. </li><li> Platzieren Sie die Halterung unter dem Dissektionsmikroskop. Der LN muss unbedingt noch bleiben, unabhängig von der Atmung Bewegung der Maus. Daher müssen Vorkehrungen getroffen werden, während der Durchführung der Operation, um die Stabilität des Beines zu optimieren. Bestimmen der Position des Schwanzes (typischerweise über dem Kopf), die einen hohen beitragenStabilität auf dem rechten Bein und der Schwanz Band nach unten. </li></ol> 3. Chirurgie <ol><li> Während unter der Dissektion Umfang, pflegen Maus Körpertemperatur mit Hilfe eines Heizgerätes oder ein Heizkissen. Für eine erfolgreiche Bildgebung der Kniekehle LN, ist es wichtig, die richtige Körpertemperatur während der Operation sowie ermöglicht, um Feuchtigkeit der Gewebe durch die ständige Anwendung warmer PBS auf die freiliegende Gewebe zu erhalten. </li><li> Sterilisieren Sie die Haut mit Betadine. Mit einer sterilen Schere, machen Sie einen Medianschnitt durch die Haut an der rechten Seite zur Mitte der Wade, und weiter Schneiden vertikal bis zu den oberen Anteil des rechten Oberschenkels. </li><li> Machen Sie zwei horizontalen Hautschnitte an der Spitze der vertikalen Schnittführung zu Hautlappen auf beiden Seiten zu schaffen. </li><li> Einfahren und kleben Sie beide Hautlappen mit Vetbond. Durch Ziehen an der Haut straff vor dem Auftragen Vetbond wird weiter zu fördern Bein Stabilität, aber stellen Sie sicher, dass die Spannung der Haut nicht verschließen Blutfluss (dh Veränderungen in der Vessel Farbe oder Durchmesser). Weiter die Verklebung anderen Bereichen der Haut, um die Stabilität des Schenkels vor dem Freilegen der LN zu gewährleisten. Die Größe der Maus wird bestimmen, wie viel zusätzliche Haut zu kleben benötigt wird, nach unten. Typischerweise wird größer Mäuse erfordern mehr Haut auf den Inhaber geklebt werden. </li><li> Der LN muss innerhalb der Kniekehle liegen entweder nach rechts oder links von der V. poplitea, abhängig von der Platzierung der Maus an der Halterung. Sie vorsichtig die LN aus den umliegenden Fettgewebe und Muskeln mit Mikro-Pinzetten und Zangen sezieren. Um Blutungen und Traumata zu minimieren, verwenden Sie die Spreizung Techniken mit Mikro-Pinzetten sezieren, um getrennte Gewebe. Vorsichtig setzen die Kniekehle LN, ohne dabei die Integrität der zu-und abführenden Blutgefäße und die afferenten Lymphgefäße. </li><li> Für zusätzliche Stabilität Gewebe kann ein Quadrat Deckglas über die feuchte LN positioniert werden, nur berühren kaum den LN bei gleichzeitiger Vermeidung Gefäßverschluss. Das Deckglas kann secur seinED-Modelle aus Ton auf beiden Seiten der Maus. </li><li> Fluoreszierende Farbstoffe Behälter verschiedener Größen (zB TRITC-Dextran, mindestens 70 kDa) kann intravenös an dieser Stelle eingeführt werden, um die strukturellen Beziehungen zu markieren und die Integrität des LN während der Bildgebung. </li></ol> 4. 2-Photonen-Imaging Acquisition ** <ol><li> Sobald die LN ausreichend ausgesetzt ist und die Stabilität erreicht wird, unverzüglich versetzen die gesamte Maus-Anordnung auf dem Mikroskoptisch mit einem programmierbaren Temperatur Rückkopplung gesteuerten Heizkissen in einer Umwelt Mikroskop Kammer bei 37 ° C angebracht Fügen Sie genug sterile warme (37 ° C) PBS oder HBSS zu tauchen LN. Das Volumen ändert sich je nach Größe und Platzierung der Maus. Alternativ kann warmer PBS oder HBSS direkt an dem zerschnittenen LN aufgebracht werden durch ein feines Glaspipette ausgestattet mit einer Peristaltikpumpe und mit Klebeband an der Spalte der Immersionslinse Ziel. Die Strömung der Flüssigkeit sollte sein, dass einStabile Wasser Spalte zwischen der Linse und dem Gewebe gehalten werden. </li><li> Pflegen Sie die PBS oder HBSS Temperatur bei 37 ° C mit einem Heizkissen mit einem Feedback-Sonde. Eine separate Temperaturfühler muss in der Maus Halter platziert werden, um die Temperatur des PBS im Bereich von 36,5 bis 37,5 zu bestätigen ° C Eine rektale Sonde kann auch verwendet werden, um die Körperkerntemperatur des experimentellen Maus in der Imaging-Sitzung zu überwachen. </li><li> Verwenden Sie einen epi-Leuchtstofflampe zu Führung LN Platzierung unter dem Ziel zu helfen. Erwerben Sie Fluoreszenzbildstapeln mit Zeitintervallen, die für den gewünschten zellulären Interaktionen (typischerweise 10 Sekunden bis 1 Minute zwischen jedem xyz Bildstapel) sind. </li><li> Überwachen Sie den Status des Tieres in der Kammer Mikroskop häufig durch eine Sichtprüfung oder durch Verwendung eines Tieres Monitoring-System. Bestimmen Sie, ob die Maus ist vollständig betäubt durch den Mangel an Reaktion auf Zehen-und / oder Nagel drückt, und eine stetige, nicht gearbeitet Atemfrequenz zwischen 60-80 breaths / min. Die Höhe der Isofluran kann entsprechend angepasst werden, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert. Mit geeigneter Monitoring-und Flüssigkeitszufuhr, Tiere können für 4-6 Stunden abgebildet werden, oder möglicherweise länger. </li><li> Nach der Imaging-Experiment, einschläfern das Tier in einer CO 2-Kammer unter Verwendung IACUC zugelassenen Euthanasie Protokoll. Das Tier darf nicht aus der Narkose vor der Euthanasie auftauchen werden. </li></ol> ** Dieses chirurgische Verfahren kann auch nützlich sein für andere Formen der Bildgebung intravitalen andere als 2P-LSM. 5. Repräsentative Ergebnisse Verschiedene zirkulierenden Immunzellen an die LN mit unterschiedlicher Geschwindigkeit nach adoptiven Transfer rekrutiert. Für CD4 + und CD8 +-Lymphozyten, beginnen diese Zellen in der LN durch die hohen endothelialen Venole (HEV) Minuten nach iv Transfer mit einer beträchtlichen Zahl der Ankunft in der Kniekehle LN nach 2 bis 4 Stunden 6,17-18 ankommen. Für B cells, wird eine erhebliche Anzahl nach 8 bis 24 Stunden 19 ansammeln. Aktivierte DCs sollten beginnen, in den ableitenden poplitealen LN 8 bis 16 Stunden nach der Injektion Wegelagerer 3,11,16-17 erscheinen. Abbildung 2a zeigt, dass auch ohne andere Sehenswürdigkeiten, Bauwerke wie B-Zell-Follikel leicht durch die runde kugelförmige Ansammlung Zelle sichtbar unter 2P-LSM 19 zu erkennen. Mit Hilfe eines endogenen fluoreszierenden Reporter wie die Ubiquitin-GFP Splenozyten (Abbildung 2, Supplemental Videos 1 und 2), kann man diese Lymphozyten-Migrationen und Verhaltensweisen für Tag verfolgen, bis zu einer Woche unter nicht-stimulatorischen physiologischen Bedingungen. Mit Multi-Channel hochempfindlichen Detektoren ist es möglich, ein Multiplex-Imaging-Dataset, das strukturelle Informationen sowie Interaktionsdynamiken umfasst unter mehreren zellulären Partnern 17,19 zu erwerben. Wenn die chirurgischen Techniken korrekt ausgeführt werden und die Umgebungsbedingungen sorgfältig überwacht, lymphocyTES sollte zeigen charakteristische Geschwindigkeit der Migration, wie in Abbildung 2c, 2d und anderswo 13-14,16 demonstriert. Lymphozyten können zeigen auch Unterschiede in der Migrations-Geschwindigkeit in Abhängigkeit von den Teilregionen des LN Bildgebung unterzogen, so wird zusätzliche Attraktionen, wie Blutgefäße (wie durch die Einführung des Schiffes Farbstoffen markiert) dazu beitragen, den gesamten Imaging-Qualität (dh richtige Temperierung bestimmen , minimale Traumatisierung LN, etc.) 3,6,20. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bau einer Halterung für Maus Maus poplitealen LN Imaging a) Schematische Darstellung der Maus Halterbaueinheit;. B) repräsentative intravitalen Maus Vorbereitung, c) Abgeschlossene Maus Halterbaueinheit, d) Nahaufnahmen von der Kniekehle LN nach chirurgischer Freilegung. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> Abbildung 2. Migration Analyse von GFP +-Lymphozytenin der Kniekehle LN. (a) 3D-Momentaufnahme von 2P-LSM Bildgebungssequenz der Kniekehle LN in einer C57BL / 6 Empfängermaus getroffen adoptiv mit 1x10 7 GFP +-Lymphozyten 1 Tag vor Bildgebung übertragen. Dash Linie zeigt die Grenze des B-Zell-Follikel, (b) Tracks von Lymphozytenmigration während 1 Stunde kontinuierlicher Bildgebung; c) Verteilung der insgesamt Lymphozytenmigration Geschwindigkeit. Die mittlere Geschwindigkeit = 10,04 ± 4,26 um / min (insgesamt 15.125 Tracks analysiert), d) Differentielle zelluläre Migration Geschwindigkeit Verteilung der Zellen in der B-Zell-Follikel gefunden (offene Balken; mittlere Geschwindigkeit = 8,79 ± 3,90 um / min; insgesamt 1.525 Tracks analysiert ) und T-Zell-Zone (gefüllte Balken; mittlere Geschwindigkeit = 13,77 ± 5,93 um / min; insgesamt 1.250 Spuren ausgewertet). Balken = 50 um. Zusätzliche Video 1. Zeitraffer-intravitale 2P-LSM Bildgebung einer Maus poplitealen LN wie in 2 beschrieben. Insgesamt wurden 1x10 7-Lymphozyten wurden isoliert from ein Ubiquitin-GFP + Donor-Maus und adoptiv intravenös in einer C57BL / 6 Empfängermaus 24 Stunden vor dem bildgebenden übertragen. Eine Reihe von XY (750 um x 750 um) Fluoreszenz-Bilder wurden durch feste Z-Stapel (5 um Schritte, 13 Schritte) getroffen, um eine Zuordnung beim Imaging-Stapel (750 um x 750 um x 65 um), die alle 20 Sekunden wiederholt wurde nachgeben für insgesamt 60 Minuten, was zu einer xyzt Bildgebungssequenz für Geschwindigkeit Analyse (Figuren 2c, 2d). Abspiel-Geschwindigkeit = 450x. Balken = 50 um. Zeitstempel = min: sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um zusätzliche Video anzuschauen</a> . Zusätzliche Video 2 vergrößerten Ansicht der Bildgebungssequenz in Supplemental Video 1 an der B-Zell-Follikel -. T-Zell-Zone Grenze. Abspiel-Geschwindigkeit = 450x. Balken = 25 um. Zeitstempel = min: Sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>lecken Sie hier, um ergänzende Video zu sehen.

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</ol>

Die Autoren haben noch nichts offen zu legen.

Jüngste Fortschritte in der hochauflösenden in-situ-Bildgebung, insbesondere 2P-LSM, wurden von einem wachsenden Interesse an der Untersuchung von dynamischen zellulären Verhaltens in vivo begleitet worden. Das 4D-Bildgebung auf der Kniekehle LN einer lebenden Maus erlaubt solche Analysen in das dynamische Verhalten von Immunzellen im Gewebe ungestörten Mikro-Umgebung. Die Verwendung von 2P-LSM mit mehreren Detektoren, die den gesamten sichtbaren Spektrum ermöglicht die gleichzeitige Bilddaten Sammlung mehrerer Zellpopulationen. Dies kann nun durch die Verwendung von In-vivo-Zelle, fluoreszierenden Reporter-Mäuse (zB Ubiquitin-eGFP, RFP-, oder-eCFP) unter Verwendung der adoptive Transfer von unterschiedlich markierten Zellpopulationen unter Verwendung von organischen Farbstoffen kombiniert fluoreszierende Zelle erreicht werden (zB CFSE , SNARF-1, and Cell Tracker Orange), zelluläre Mechanismen und Funktion innerhalb der LN zu untersuchen. Zusätzlich zu der direkten Beobachtung der Wechselwirkungen zwischen differentiell erfasst cell Populationen kann das Multiplex-Bilddatenstatz weiteren Analyse mit kommerziell erhältlichen Bildverarbeitung Software-Programme (zB Imaris, Bitplane Inc.) zu weiteren Aufklärung des Verhaltens von Zellen und Funktion zu unterziehen. Ein breiter Fächer von Möglichkeiten existiert, um zelluläre Mechanismen für die Interaktion mit diesen in vivo und in-silico-Techniken zu studieren. Die wichtigste Einschränkung der experimentellen hier beschriebene Ansatz ist die technische Vielschichtigkeit der Chirurgie Ansatz. Diese Technik erfordert hartes Training, um sich mit der Anatomie und die genauen technischen Verfahren und Fähigkeiten durch dieses Protokoll benötigt. Weitere erschwerende Faktoren wie die Schwierigkeit, bei der Minimierung von Gewebeschäden während LN Erforschung, Optimierung Gewebe Stabilität während der Bildgebung und Verhinderung von thermischer und Laser Verletzungen des LN vor und während der Bildgebung Experimentieren. Störung an einem dieser Faktoren wird in weniger als optimalen Lymphe führenocyte Motilität und wird daher mit der richtigen Interpretation der daraus resultierenden Bilddaten Analysen stören.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isofluran, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nair - Haarentfernung Lotion</td&gt;<td&gt; Nair</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21 bis 040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Heizkissen</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Heiz-Pad-Controller</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Luft-und O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Temperaturfühler</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzetten Dumont # 5</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzetten, Graefe Iris, 7 cm gebogen</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Scheren</td&gt;<td&gt; Roboz Surgical Instrument Co., Inc.</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cover von 100x20 mm Glas Zellkulturschale</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cover von 100x20 mm Polystyrol Zellkulturschale</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine Lösung (10% Providine-Jod Topical Solution)</td&gt;<td&gt; Purdue Products, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

Lymphknoten (LK) sind sekundären lymphatischen Organen, die strategisch im ganzen Körper befinden, um zum Einfangen und Präsentation von fremden Antigenen aus peripheren Geweben, um die adaptive Immunantwort zu entlüften lassen. Gegenübergestellt zwischen angeborenen und adaptiven Immunantwort ist die LN ein idealer Ort, um Immunzellen Wechselwirkungen 1,2 studieren. Lymphozyten (T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen), umfassen dendritische Zellen (DCs), Makrophagen und den Großteil der Knochenmark-abgeleitete zellulären Elemente des LN. Diese Zellen sind strategisch positioniert in der LN, um eine effiziente Überwachung der Selbst-Antigene und potentielle fremde Antigene 5.3 zu ermöglichen. Der Prozess, durch den Lymphozyten erfolgreich begegnen verwandten Antigenen ist ein Gegenstand intensiver Forschung in den letzten Jahren, und eine Integration der molekularen Kontakte einschließlich Antigen-Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle, Chemokine, und Stroma-Strukturen, wie das Fibro-retikuläre Netzwerk 2,6-12 . </p&gt; Vor der Entwicklung von hochauflösenden Echtzeit-Fluoreszenz-in-vivo-Bildgebung, Ermittler auf statischen Bildern verlassen, die nur bietet Antworten zur Morphologie, Lage und Architektur. Während diese Fragen grundlegend für unser Verständnis von Immunzellen Verhalten sind, wird die intrinsische Einschränkungen mit dieser Technik nicht zulassen Analyse zu entziffern Lymphozyten-Handel und Umwelt Hinweise, die dynamische Verhalten von Zellen beeinflussen. Vor kurzem hat die Entwicklung der intravitalen Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2P-LSM) hat es Ermittlern, um die dynamischen Bewegungen und Interaktionen der einzelnen Zellen innerhalb von Live-LNs in situ 12-16 zu sehen. Insbesondere haben wir und andere diese Technik, um Bild zellulären Verhalten und die Interaktionen innerhalb der Kniekehle angewendet LN, wo die kompakte, dichte Natur bietet den Vorteil der Multiplex-Datenerfassung über einen großen Bereich mit verschiedensten Gewebe Gewebe Sub-Strukturen 11,17-18 . Es iist wichtig zu beachten, dass diese Technik zusätzliche Vorteile über explantierten Gewebe bildgebenden Verfahren, die Störung der Blut-, Lymph-Fluss, und letztlich die zellulären Dynamik des Systems erfordern bietet. Darüber hinaus haben explantierten Gewebes eine sehr begrenzte Zeitfenster, in dem das Gewebe bleibt lebensfähig Bildgebung nach Explantat. Mit ausreichende Flüssigkeitszufuhr und die Überwachung des Tieres Umgebungsbedingungen kann die Belichtungszeit wesentlich mit dieser intravitalen Technik erweitert werden. Hier stellen wir eine detaillierte Verfahren zur Herstellung von Maus poplitealen LN für die Ausübung ihrer intravitalen Bildgebung.

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Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit ermöglichte<em&gt; In</em&gt; Situ Darstellung von lebendem Gewebe in Tiermodellen, wodurch die Fähigkeit, das Zellverhalten sowohl physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Hier skizzieren wir die Vorbereitungen erforderlich, um die Bildgebung des Maus-Kniekehlen-Lymphknoten durchzuführen.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.3K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit ermöglichte In Situ Darstellung von lebendem Gewebe in Tiermodellen, wodurch die Fähigkeit, das Zellverhalten sowohl physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Hier skizzieren wir die Vorbereitungen erforderlich, um die Bildgebung des Maus-Kniekehlen-Lymphknoten durchzuführen.

Serie: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

Biologie

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to draining lymph nodes (LNs). Interruption of lymph flow is an important method when studying the function of lymphatic vessels. The afferent lymphatic vessels from the murine footpad to the popliteal lymph nodes (pLNs) are well-defined as the only routes for lymph drainage into the pLNs. Suturing these afferent lymphatic vessels can selectively prevent lymph flow to the pLNs. This method allows for interference in lymph flow with minimal damage to the lymphatic endothelial cells in the draining pLN, the afferent lymphatic vessels, as well as other lymphatic vessels around the area. This method has been used to study how lymph impacts high endothelial venules (HEV) and chemokine expression in the LN, and how lymph flows through the adipose tissue surrounding the LN in the absence of functional lymphatic vessels. With the growing recognition of the importance of lymphatic function, this method will have broader applications to further unravel the function of lymphatic vessels in regulating the LN microenvironment and immune responses.

A protocol to block lymph flow by surgical suturing of afferent lymphatic vessels is presented.

Blockierung des Lymphflusses durch Suieren von afferenten Lymphgefäßen bei Mäusen

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Medizin

Popliteal Vascular Lymph Node Resection in the Rabbit Hindlimb for Secondary Lymphedema Induction

Lymphedema is a common condition often associated with cancer and its treatment, which leads to damage to the lymphatic system, and current treatments are mostly palliative rather than curative. Its high incidence among oncologic patients indicates the need to study both normal lymphatic function and pathologic dysfunction. To reproduce chronic lymphedema, it is necessary to choose a suitable experimental animal. Attempts to establish animal models are limited by the regenerative capacity of the lymphatic system. Among the potential candidates, the rabbit hindlimb is easy to handle and extrapolate to the human clinical scenario, making it advantageous. In addition, the size of this species allows for better selection of lymphatic vessels for vascularized lymph node resection.
In this study, we present a procedure of vascular lymph node resection in the rabbit hindlimb for inducing secondary lymphedema. Anesthetized animals were subjected to circumferential measurement, patent blue V infiltration, and indocyanine green lymphography (ICG-L) using real-time near-infrared fluorescence, a technique that allows the identification of single popliteal nodes and lymphatic channels. Access to the identified structures is achieved by excising the popliteal node and ligating the medial and lateral afferent lymphatics. Special care must be taken to ensure that any lymphatic vessel that joins the femoral lymphatic system within the thigh without entering the popliteal node can be identified and ligated. 
Postoperative evaluation was performed at 3, 6, and 12 months after induction using circumferential measurements of the hindlimb and ICG-L. As demonstrated during follow-up, the animals developed dermal backflow that was maintained until the 12th month, making this experimental animal useful for novel long-term evaluations in the management of lymphedema. In conclusion, the approach described here is feasible and reproducible. Additionally, during the time window presented, it can be representative of human lymphedema, thus providing a useful research tool.

<meta charset="utf8"></head><body>Resektion des poplitealen vaskulären Lymphknotens in der Hintergliedmaße des Kaninchens zur Induktion eines sekundären Lymphödems

Here, the surgical induction of stable acquired lymphedema in the rabbit hindlimb is described. This experimental animal can be used to further investigate the effect of lymphedema treatment by microsurgical techniques.

Resektion des poplitealen vaskulären Lymphknotens in der Hintergliedmaße des Kaninchens zur Induktion eines sekundären Lymphödems

Lymphedema is a common condition often associated with cancer and its treatment, which leads to damage to the lymphatic system, and current treatments are ...

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Zusammenfassung

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Resektion des poplitealen vaskulären Lymphknotens in der Hintergliedmaße des Kaninchens zur Induktion eines sekundären Lymphödems