Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick Stiftung, Dana Foundation, Gabrielle &#39;s Angel-Stiftung, und Hyundai Motors of America &quot;Hope-on-Wheels&quot;-Programm unterstützt.

1. Maus-Halter-Anordnung <ol><li> Überlagern Sie die Abdeckung eines 100-mm-Glas-Petrischale auf der Spitze eines 100-mm-Kunststoff-Petrischale Deckel nach unten zeigt. Das Glas sollte kaum berühren Sie den Mittelpunkt der Plastikschale. Mit dem Glas als Schablone, verfolgen eine Markierung auf der Plastikschale. </li><li> Verwenden Sie eine Handbohrmaschine (dh Dremel), um einen Teil eines 100-mm-Deckel Plastikschale, eine sichelförmige Plattform zu schaffen, zu entfernen. Diese sichelförmigen Kunststoffdeckel wird als Träger für den Oberkörper der Maus (1a) dienen. Bohren Sie zwei Löcher auf der halbmondförmigen Deckel, um die Gasmaske mit einem Metall Bindedraht zu sichern. Sichern Sie den Plastikdeckel an den Rand des Glases Petrischale mit Sekundenkleber oder eine gleich starke Klebstoff (Abbildung 1b). </li><li> Kleber die Deckel von zwei gewölbte Kappe PCR-Röhrchen (Schnitt im Scharnier) 1 cm voneinander entfernt auf die Mitte des Bodens Gericht für den zur Verankerung Kniekehle Hautlappen. </li></ol> 2. Maus-Vorbereitung <strong&gt; Hinweis: Bei ausreichender Übung, man sollte in der Lage sein, um die Maus Vorbereitung und des chirurgischen Schritte in 20-30 Minuten durchführen. <ol><li> Betäuben die Maus mit Isofluran (2 bis 2,5% für Induktion, 1,5 bis 2% für Chirurgie / Imaging) in 1:1 O 2 gemischt: Luft-Gemisch bei einer Fließgeschwindigkeit von 1L/min mit Hilfe eines anerkannten Verfahrens IACUC. Sobald sich die Maus betäubt, sichern eine Gasmaske über die Nase mit Klebeband. Bestimmen Sie, ob die Maus ist vollständig betäubt durch den Mangel an Reaktion auf Zehen-und / oder Schwanz drückt. Die Höhe der Isofluran kann entsprechend angepasst werden, um sicherzustellen, das Tier vollständig betäubt, mit einem stetigen, nicht gearbeitet Atemfrequenz zwischen 60-80 Atemzüge / min. </li><li> Verwenden Sie einen elektrischen Trimmer die Haare auf dem rechten Hinterbein und inguinalen Bereich der Maus zu entfernen. </li><li> Bürsten Sie losen Haare und üben Sie sanften einen bescheidenen Schicht Nair Lotion auf die rasierte Fläche mit einem Wattestäbchen. Nach einer Minute der ersten Anwendung, entfernen Sie den Nair und reinigen Sie die betroffene Haut mit einem feuchtenPapiertuch. Achten Sie darauf, die Maus ist sauber und trocken sein, bevor Sie fortfahren. </li><li> Machen Sie eine kleine 2 bis 3 mm Schnitt mit der Schere am rechten Knie, um die Strecksehne aussetzen. </li><li> Anwenden Vetbond entlang der Mittellinie der Maus Halter, in dem die Maus Körper und Beine angeordnet werden. Sorgfältig sichern die Maus auf den Halter, mit dem rechten Knie nach unten, um die richtige Kniekehle aussetzen. Sichern Sie das rechte Knie Sehne mit Vetbond zwischen den zwei Hautlappen Halter zur Stabilisierung des Bildfeldes. </li><li> Stretch-und Tape die Arme und das linke Bein auf der oberen Plattform des Halters. </li><li> Verwenden Sie einen Bindedraht, um die Gasmaske zu fixieren. </li><li> Platzieren Sie die Halterung unter dem Dissektionsmikroskop. Der LN muss unbedingt noch bleiben, unabhängig von der Atmung Bewegung der Maus. Daher müssen Vorkehrungen getroffen werden, während der Durchführung der Operation, um die Stabilität des Beines zu optimieren. Bestimmen der Position des Schwanzes (typischerweise über dem Kopf), die einen hohen beitragenStabilität auf dem rechten Bein und der Schwanz Band nach unten. </li></ol> 3. Chirurgie <ol><li> Während unter der Dissektion Umfang, pflegen Maus Körpertemperatur mit Hilfe eines Heizgerätes oder ein Heizkissen. Für eine erfolgreiche Bildgebung der Kniekehle LN, ist es wichtig, die richtige Körpertemperatur während der Operation sowie ermöglicht, um Feuchtigkeit der Gewebe durch die ständige Anwendung warmer PBS auf die freiliegende Gewebe zu erhalten. </li><li> Sterilisieren Sie die Haut mit Betadine. Mit einer sterilen Schere, machen Sie einen Medianschnitt durch die Haut an der rechten Seite zur Mitte der Wade, und weiter Schneiden vertikal bis zu den oberen Anteil des rechten Oberschenkels. </li><li> Machen Sie zwei horizontalen Hautschnitte an der Spitze der vertikalen Schnittführung zu Hautlappen auf beiden Seiten zu schaffen. </li><li> Einfahren und kleben Sie beide Hautlappen mit Vetbond. Durch Ziehen an der Haut straff vor dem Auftragen Vetbond wird weiter zu fördern Bein Stabilität, aber stellen Sie sicher, dass die Spannung der Haut nicht verschließen Blutfluss (dh Veränderungen in der Vessel Farbe oder Durchmesser). Weiter die Verklebung anderen Bereichen der Haut, um die Stabilität des Schenkels vor dem Freilegen der LN zu gewährleisten. Die Größe der Maus wird bestimmen, wie viel zusätzliche Haut zu kleben benötigt wird, nach unten. Typischerweise wird größer Mäuse erfordern mehr Haut auf den Inhaber geklebt werden. </li><li> Der LN muss innerhalb der Kniekehle liegen entweder nach rechts oder links von der V. poplitea, abhängig von der Platzierung der Maus an der Halterung. Sie vorsichtig die LN aus den umliegenden Fettgewebe und Muskeln mit Mikro-Pinzetten und Zangen sezieren. Um Blutungen und Traumata zu minimieren, verwenden Sie die Spreizung Techniken mit Mikro-Pinzetten sezieren, um getrennte Gewebe. Vorsichtig setzen die Kniekehle LN, ohne dabei die Integrität der zu-und abführenden Blutgefäße und die afferenten Lymphgefäße. </li><li> Für zusätzliche Stabilität Gewebe kann ein Quadrat Deckglas über die feuchte LN positioniert werden, nur berühren kaum den LN bei gleichzeitiger Vermeidung Gefäßverschluss. Das Deckglas kann secur seinED-Modelle aus Ton auf beiden Seiten der Maus. </li><li> Fluoreszierende Farbstoffe Behälter verschiedener Größen (zB TRITC-Dextran, mindestens 70 kDa) kann intravenös an dieser Stelle eingeführt werden, um die strukturellen Beziehungen zu markieren und die Integrität des LN während der Bildgebung. </li></ol> 4. 2-Photonen-Imaging Acquisition ** <ol><li> Sobald die LN ausreichend ausgesetzt ist und die Stabilität erreicht wird, unverzüglich versetzen die gesamte Maus-Anordnung auf dem Mikroskoptisch mit einem programmierbaren Temperatur Rückkopplung gesteuerten Heizkissen in einer Umwelt Mikroskop Kammer bei 37 ° C angebracht Fügen Sie genug sterile warme (37 ° C) PBS oder HBSS zu tauchen LN. Das Volumen ändert sich je nach Größe und Platzierung der Maus. Alternativ kann warmer PBS oder HBSS direkt an dem zerschnittenen LN aufgebracht werden durch ein feines Glaspipette ausgestattet mit einer Peristaltikpumpe und mit Klebeband an der Spalte der Immersionslinse Ziel. Die Strömung der Flüssigkeit sollte sein, dass einStabile Wasser Spalte zwischen der Linse und dem Gewebe gehalten werden. </li><li> Pflegen Sie die PBS oder HBSS Temperatur bei 37 ° C mit einem Heizkissen mit einem Feedback-Sonde. Eine separate Temperaturfühler muss in der Maus Halter platziert werden, um die Temperatur des PBS im Bereich von 36,5 bis 37,5 zu bestätigen ° C Eine rektale Sonde kann auch verwendet werden, um die Körperkerntemperatur des experimentellen Maus in der Imaging-Sitzung zu überwachen. </li><li> Verwenden Sie einen epi-Leuchtstofflampe zu Führung LN Platzierung unter dem Ziel zu helfen. Erwerben Sie Fluoreszenzbildstapeln mit Zeitintervallen, die für den gewünschten zellulären Interaktionen (typischerweise 10 Sekunden bis 1 Minute zwischen jedem xyz Bildstapel) sind. </li><li> Überwachen Sie den Status des Tieres in der Kammer Mikroskop häufig durch eine Sichtprüfung oder durch Verwendung eines Tieres Monitoring-System. Bestimmen Sie, ob die Maus ist vollständig betäubt durch den Mangel an Reaktion auf Zehen-und / oder Nagel drückt, und eine stetige, nicht gearbeitet Atemfrequenz zwischen 60-80 breaths / min. Die Höhe der Isofluran kann entsprechend angepasst werden, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert. Mit geeigneter Monitoring-und Flüssigkeitszufuhr, Tiere können für 4-6 Stunden abgebildet werden, oder möglicherweise länger. </li><li> Nach der Imaging-Experiment, einschläfern das Tier in einer CO 2-Kammer unter Verwendung IACUC zugelassenen Euthanasie Protokoll. Das Tier darf nicht aus der Narkose vor der Euthanasie auftauchen werden. </li></ol> ** Dieses chirurgische Verfahren kann auch nützlich sein für andere Formen der Bildgebung intravitalen andere als 2P-LSM. 5. Repräsentative Ergebnisse Verschiedene zirkulierenden Immunzellen an die LN mit unterschiedlicher Geschwindigkeit nach adoptiven Transfer rekrutiert. Für CD4 + und CD8 +-Lymphozyten, beginnen diese Zellen in der LN durch die hohen endothelialen Venole (HEV) Minuten nach iv Transfer mit einer beträchtlichen Zahl der Ankunft in der Kniekehle LN nach 2 bis 4 Stunden 6,17-18 ankommen. Für B cells, wird eine erhebliche Anzahl nach 8 bis 24 Stunden 19 ansammeln. Aktivierte DCs sollten beginnen, in den ableitenden poplitealen LN 8 bis 16 Stunden nach der Injektion Wegelagerer 3,11,16-17 erscheinen. Abbildung 2a zeigt, dass auch ohne andere Sehenswürdigkeiten, Bauwerke wie B-Zell-Follikel leicht durch die runde kugelförmige Ansammlung Zelle sichtbar unter 2P-LSM 19 zu erkennen. Mit Hilfe eines endogenen fluoreszierenden Reporter wie die Ubiquitin-GFP Splenozyten (Abbildung 2, Supplemental Videos 1 und 2), kann man diese Lymphozyten-Migrationen und Verhaltensweisen für Tag verfolgen, bis zu einer Woche unter nicht-stimulatorischen physiologischen Bedingungen. Mit Multi-Channel hochempfindlichen Detektoren ist es möglich, ein Multiplex-Imaging-Dataset, das strukturelle Informationen sowie Interaktionsdynamiken umfasst unter mehreren zellulären Partnern 17,19 zu erwerben. Wenn die chirurgischen Techniken korrekt ausgeführt werden und die Umgebungsbedingungen sorgfältig überwacht, lymphocyTES sollte zeigen charakteristische Geschwindigkeit der Migration, wie in Abbildung 2c, 2d und anderswo 13-14,16 demonstriert. Lymphozyten können zeigen auch Unterschiede in der Migrations-Geschwindigkeit in Abhängigkeit von den Teilregionen des LN Bildgebung unterzogen, so wird zusätzliche Attraktionen, wie Blutgefäße (wie durch die Einführung des Schiffes Farbstoffen markiert) dazu beitragen, den gesamten Imaging-Qualität (dh richtige Temperierung bestimmen , minimale Traumatisierung LN, etc.) 3,6,20. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bau einer Halterung für Maus Maus poplitealen LN Imaging a) Schematische Darstellung der Maus Halterbaueinheit;. B) repräsentative intravitalen Maus Vorbereitung, c) Abgeschlossene Maus Halterbaueinheit, d) Nahaufnahmen von der Kniekehle LN nach chirurgischer Freilegung. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> Abbildung 2. Migration Analyse von GFP +-Lymphozytenin der Kniekehle LN. (a) 3D-Momentaufnahme von 2P-LSM Bildgebungssequenz der Kniekehle LN in einer C57BL / 6 Empfängermaus getroffen adoptiv mit 1x10 7 GFP +-Lymphozyten 1 Tag vor Bildgebung übertragen. Dash Linie zeigt die Grenze des B-Zell-Follikel, (b) Tracks von Lymphozytenmigration während 1 Stunde kontinuierlicher Bildgebung; c) Verteilung der insgesamt Lymphozytenmigration Geschwindigkeit. Die mittlere Geschwindigkeit = 10,04 ± 4,26 um / min (insgesamt 15.125 Tracks analysiert), d) Differentielle zelluläre Migration Geschwindigkeit Verteilung der Zellen in der B-Zell-Follikel gefunden (offene Balken; mittlere Geschwindigkeit = 8,79 ± 3,90 um / min; insgesamt 1.525 Tracks analysiert ) und T-Zell-Zone (gefüllte Balken; mittlere Geschwindigkeit = 13,77 ± 5,93 um / min; insgesamt 1.250 Spuren ausgewertet). Balken = 50 um. Zusätzliche Video 1. Zeitraffer-intravitale 2P-LSM Bildgebung einer Maus poplitealen LN wie in 2 beschrieben. Insgesamt wurden 1x10 7-Lymphozyten wurden isoliert from ein Ubiquitin-GFP + Donor-Maus und adoptiv intravenös in einer C57BL / 6 Empfängermaus 24 Stunden vor dem bildgebenden übertragen. Eine Reihe von XY (750 um x 750 um) Fluoreszenz-Bilder wurden durch feste Z-Stapel (5 um Schritte, 13 Schritte) getroffen, um eine Zuordnung beim Imaging-Stapel (750 um x 750 um x 65 um), die alle 20 Sekunden wiederholt wurde nachgeben für insgesamt 60 Minuten, was zu einer xyzt Bildgebungssequenz für Geschwindigkeit Analyse (Figuren 2c, 2d). Abspiel-Geschwindigkeit = 450x. Balken = 50 um. Zeitstempel = min: sec. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um zusätzliche Video anzuschauen</a> . Zusätzliche Video 2 vergrößerten Ansicht der Bildgebungssequenz in Supplemental Video 1 an der B-Zell-Follikel -. T-Zell-Zone Grenze. Abspiel-Geschwindigkeit = 450x. Balken = 25 um. Zeitstempel = min: Sek. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>lecken Sie hier, um ergänzende Video zu sehen.

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Die Autoren haben noch nichts offen zu legen.

Jüngste Fortschritte in der hochauflösenden in-situ-Bildgebung, insbesondere 2P-LSM, wurden von einem wachsenden Interesse an der Untersuchung von dynamischen zellulären Verhaltens in vivo begleitet worden. Das 4D-Bildgebung auf der Kniekehle LN einer lebenden Maus erlaubt solche Analysen in das dynamische Verhalten von Immunzellen im Gewebe ungestörten Mikro-Umgebung. Die Verwendung von 2P-LSM mit mehreren Detektoren, die den gesamten sichtbaren Spektrum ermöglicht die gleichzeitige Bilddaten Sammlung mehrerer Zellpopulationen. Dies kann nun durch die Verwendung von In-vivo-Zelle, fluoreszierenden Reporter-Mäuse (zB Ubiquitin-eGFP, RFP-, oder-eCFP) unter Verwendung der adoptive Transfer von unterschiedlich markierten Zellpopulationen unter Verwendung von organischen Farbstoffen kombiniert fluoreszierende Zelle erreicht werden (zB CFSE , SNARF-1, and Cell Tracker Orange), zelluläre Mechanismen und Funktion innerhalb der LN zu untersuchen. Zusätzlich zu der direkten Beobachtung der Wechselwirkungen zwischen differentiell erfasst cell Populationen kann das Multiplex-Bilddatenstatz weiteren Analyse mit kommerziell erhältlichen Bildverarbeitung Software-Programme (zB Imaris, Bitplane Inc.) zu weiteren Aufklärung des Verhaltens von Zellen und Funktion zu unterziehen. Ein breiter Fächer von Möglichkeiten existiert, um zelluläre Mechanismen für die Interaktion mit diesen in vivo und in-silico-Techniken zu studieren. Die wichtigste Einschränkung der experimentellen hier beschriebene Ansatz ist die technische Vielschichtigkeit der Chirurgie Ansatz. Diese Technik erfordert hartes Training, um sich mit der Anatomie und die genauen technischen Verfahren und Fähigkeiten durch dieses Protokoll benötigt. Weitere erschwerende Faktoren wie die Schwierigkeit, bei der Minimierung von Gewebeschäden während LN Erforschung, Optimierung Gewebe Stabilität während der Bildgebung und Verhinderung von thermischer und Laser Verletzungen des LN vor und während der Bildgebung Experimentieren. Störung an einem dieser Faktoren wird in weniger als optimalen Lymphe führenocyte Motilität und wird daher mit der richtigen Interpretation der daraus resultierenden Bilddaten Analysen stören.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isofluran, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nair - Haarentfernung Lotion</td&gt;<td&gt; Nair</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21 bis 040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Heizkissen</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Heiz-Pad-Controller</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Luft-und O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Temperaturfühler</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzetten Dumont # 5</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzetten, Graefe Iris, 7 cm gebogen</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Scheren</td&gt;<td&gt; Roboz Surgical Instrument Co., Inc.</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cover von 100x20 mm Glas Zellkulturschale</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cover von 100x20 mm Polystyrol Zellkulturschale</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine Lösung (10% Providine-Jod Topical Solution)</td&gt;<td&gt; Purdue Products, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

Lymphknoten (LK) sind sekundären lymphatischen Organen, die strategisch im ganzen Körper befinden, um zum Einfangen und Präsentation von fremden Antigenen aus peripheren Geweben, um die adaptive Immunantwort zu entlüften lassen. Gegenübergestellt zwischen angeborenen und adaptiven Immunantwort ist die LN ein idealer Ort, um Immunzellen Wechselwirkungen 1,2 studieren. Lymphozyten (T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen), umfassen dendritische Zellen (DCs), Makrophagen und den Großteil der Knochenmark-abgeleitete zellulären Elemente des LN. Diese Zellen sind strategisch positioniert in der LN, um eine effiziente Überwachung der Selbst-Antigene und potentielle fremde Antigene 5.3 zu ermöglichen. Der Prozess, durch den Lymphozyten erfolgreich begegnen verwandten Antigenen ist ein Gegenstand intensiver Forschung in den letzten Jahren, und eine Integration der molekularen Kontakte einschließlich Antigen-Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle, Chemokine, und Stroma-Strukturen, wie das Fibro-retikuläre Netzwerk 2,6-12 . </p&gt; Vor der Entwicklung von hochauflösenden Echtzeit-Fluoreszenz-in-vivo-Bildgebung, Ermittler auf statischen Bildern verlassen, die nur bietet Antworten zur Morphologie, Lage und Architektur. Während diese Fragen grundlegend für unser Verständnis von Immunzellen Verhalten sind, wird die intrinsische Einschränkungen mit dieser Technik nicht zulassen Analyse zu entziffern Lymphozyten-Handel und Umwelt Hinweise, die dynamische Verhalten von Zellen beeinflussen. Vor kurzem hat die Entwicklung der intravitalen Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2P-LSM) hat es Ermittlern, um die dynamischen Bewegungen und Interaktionen der einzelnen Zellen innerhalb von Live-LNs in situ 12-16 zu sehen. Insbesondere haben wir und andere diese Technik, um Bild zellulären Verhalten und die Interaktionen innerhalb der Kniekehle angewendet LN, wo die kompakte, dichte Natur bietet den Vorteil der Multiplex-Datenerfassung über einen großen Bereich mit verschiedensten Gewebe Gewebe Sub-Strukturen 11,17-18 . Es iist wichtig zu beachten, dass diese Technik zusätzliche Vorteile über explantierten Gewebe bildgebenden Verfahren, die Störung der Blut-, Lymph-Fluss, und letztlich die zellulären Dynamik des Systems erfordern bietet. Darüber hinaus haben explantierten Gewebes eine sehr begrenzte Zeitfenster, in dem das Gewebe bleibt lebensfähig Bildgebung nach Explantat. Mit ausreichende Flüssigkeitszufuhr und die Überwachung des Tieres Umgebungsbedingungen kann die Belichtungszeit wesentlich mit dieser intravitalen Technik erweitert werden. Hier stellen wir eine detaillierte Verfahren zur Herstellung von Maus poplitealen LN für die Ausübung ihrer intravitalen Bildgebung.

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Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit ermöglichte<em&gt; In</em&gt; Situ Darstellung von lebendem Gewebe in Tiermodellen, wodurch die Fähigkeit, das Zellverhalten sowohl physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Hier skizzieren wir die Vorbereitungen erforderlich, um die Bildgebung des Maus-Kniekehlen-Lymphknoten durchzuführen.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.2K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit ermöglichte In Situ Darstellung von lebendem Gewebe in Tiermodellen, wodurch die Fähigkeit, das Zellverhalten sowohl physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Hier skizzieren wir die Vorbereitungen erforderlich, um die Bildgebung des Maus-Kniekehlen-Lymphknoten durchzuführen.

Serie: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...