この作品は、NIHの助成金R01 GM075200とR01 HL083393（LAT）によってサポートされていました。我々は、NIH T90 DA022871と放射線のMallinckrodt研究所からBAFのための奨学金支援を認める、と米国心臓協会からの助成金09PRE2060795からVDV用。

1。一般的な実験の準備<ol><li>層流フードの組織培養の培地を準備。 <ol><li>ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（4.5グラム/ Lグルコース、重炭酸ナトリウム、およびL -グルタミンと1リットルの瓶）を希釈する。 10 mLのペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン抗生物質を追加。 </li><li>無菌トランスファーピペットでDMEM 100mLのを削除し、ニワトリ血清100mLで置き換えます。 </li><li>滅菌済み15 mLコニカルバイアルと凍結に一定分量DMEM/10％ニワトリ血清/ 1％の抗生物質を。 </li></ol></li><li>カルシウムとマグネシウムを添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 100 mLの10X PBS、900mLの脱イオン水、及び濃カルシウムとマグネシウム溶液（100 mg / mLの塩化カルシウム2•2H 2 O、100mg/mLのMgCl 2•6H 2 O）1 mLを混和します。 </li><li>ハンバーガーとハミルトン1（すなわち、23から25 HHステージ5のための時間、または42で定義されているように、目的のステージに縦向きに卵をインキュベートHHステージ11〜12）は、-48時間。 </li><li>ろ紙キャリア方式を使用して卵から胚を削除します。 <ol><li> A150ミリメートルペトリ皿の側面に卵の底を割れる。下からシェルを離れて引いて、皿に卵の中身を空にします。 </li><li>鈍鉗子を使用して、卵からの厚い、粘性のある卵白を削除します。 </li><li>ワットマン＃2濾紙2〜3センチメートルの円をカット。直径インチろ紙の中央に単穴パンチ、パンチ穴を使用する。リングの中央の穴を通して見える胚を保つ方法で卵黄上にろ紙のいずれかのリングを置きます。 </li><li> microscissorsとろ紙の外径の周りにカット。細かいピンセットを用い、卵黄から用紙を取り除きます。 </li><li>ゆっくりと接着卵黄の粒子を除去するためにPBSで胚をすすいでください。 （HH5胚は残存卵黄を除去するために15〜20分限り、浸漬する必要がある場合があります）。お風呂からろ紙のアセンブリを取り外し、それ腹側を上に置く35mmの培養皿。リング間胚を挟んで、最初の頂上番目のフィルタ紙のリングを置きます。胚を保護するために - 濾紙のサンドウィッチ（2 cmの直径≈1.5）の外側の周りに金属リングを置く。 </li><li>培地に浸す胚を。明視野顕微鏡との適切な形態と胚の段階を確認してください。 </li></ol></li><li>その後の組織の解剖と標識のために先端の細いガラス針（1.5内径）（世界の精密機器、サラソタFL）を準備するためにピペットプラーを使用してください。 </li></ol> 2。 HHステージのDII標識磁性鉄粒子を用いて5胚<ol><li>室温で鉄粉の少量（鉄の減少、Mallinckrodtベイカー、（株）、ニュージャージー州フィリップスバーグ）にアルコールで飽和DIIの数滴を追加し、乾燥させる。 （これは通常、アルコールが蒸発した後に一緒にケーキにパーティクルが発生します。）凝集鉄粒子を分割するプルマイクロピペットの先端を使用して、マイクロ遠心チューブに転送し、それらを数回すすぎ、脱イオン水でカバー。 </li><li> HHステージ5胚の外胚葉の細胞を標識するために、培地の寛大な層で覆われた35mmの培養皿で収穫された胚（すなわち、全体のろ紙のアセンブリ）背側を上に置き、解剖顕微鏡下で皿を置く。卵黄膜を除去し、外胚葉の細胞を露出するガラス針を使用してください。 （ピアスの胚ではないに注意してください。） </li><li>パスツールピペットにラベル付け鉄粒子（脱イオン水で）の列を描画します。解剖顕微鏡、水没だけ胚上記液面との位置の下にピペットチップを使用する。指先との間でゆっくり前後にピペットをローリング、pipietteから粒子をゆすりますと胚全体でそれらを振りかける。 </li><li>胚の粒子で覆われると、慎重に約10分間37℃のインキュベーターに入れてください。インキュベーターから胚を取り出しD粒子を除去する強力な磁石を使用してください。 </li><li>図2A、Bに示すように、明視野および胚の蛍光画像の両方を取得するために接続されたビデオカメラと適切なフィルタ設定を使用して蛍光顕微鏡を使用して、 </li><li>ラベルの密度に注意してください。高密度の分布が必要な場合は、再び胚をラベル付けし、それに応じてインキュベーション時間を延長する（上述のように）追加の粒子を使用してください。ラベルがあまりにも密な場合は、すでにラベルの粒子を充填したマイクロ遠心チューブにラベルのない鉄粒子の少量を追加し、チューブの中身を混ぜる。新しい胚とラベリングのプロセスを繰り返し、再度ラベルの密度に注意してください。 </li></ol> 3。 HH11 - 12胚の光コヒーレンストモグラフィー（OCT）イメージングのためのポリスチレン微小ラベリング<ol><li> 35ミリメートルのペトリ皿にPBSで黒10μmの直径ミクロスフェア（Polysciences社、ウォリントン、ペンシルバニア州）の溶液を調製します。 （ビーズは、OCTのコントラストを生成するために十分な大きさが必要ですイメージング、しかし十分に小さいビーズの大きさは個々のセルの順になっていることなど。特定の値）をOCTシステムの解像度によって異なりますし、組織が検討されて。 PBSのmL当たり原液の一滴（2.6％固体ラテックス）は、一般的に十分です。 22ゲージの針を使用して10ccのシリンジにこのソリューションを引き出します。均一なビーズ分布を確保するために30秒間ボルテックスソリューション。 </li><li>ベベルコンピュータのハードドライブ2を使用して、引っ張らガラス針の先端。先端の直径は、ビーズが開口部を通って合うことができる十分な大きさでなければなりませんが、同時に、可能な限り小さく注入時の組織の傷を最小限に抑えます。 </li><li>シリンジを用いてビーズ溶液と傾斜のガラス針を埋める。軽くソリューションは、先端に達したことを保証するためにマイクロピペットをフリック。 </li><li>マイクロマニピュレータを用いて、胚とビューの同じフィールドにガラス針を配置。ビーズは、ピペットの先端部から外れ通過している必要があります。 <ol><li>ないBEAの場合dsはマイクロピペットを終了、詰まりがあるかもしれません。この場合、繰り返しは、新しいガラスの針で3.2から3.4を繰り返します。 </li><li>あまりにも多くのビーズが視界を曇らせる場合、あなたのピペットチップは広すぎる可能性があります。新しいピペットと新しい胚と手順3.2から3.4を繰り返します。 </li></ol></li><li>脳のチューブの内腔にピペットの先端を挿入します。ではない組織の腹床を貫通することを確認してください。ビーズと流体が内腔を入力するときは、組織の一時的な腫れが表示されます。これが成功した挿管を示し、現在、急速にガラスニードルを取り外します。 </li><li>明視野顕微鏡を用いて脳の管の内腔で十分なビーズの密度を確認してください。セクトに進む前に30分 - ビーズが20のために解決しましょう​​。 4。 </li></ol> 4。データ収集 *以下の方法がよく、上記の蛍光標識法に適しています。サンプルを転送するときしかし、ミクロスフェアの標識法と、ビーズが吹き飛ばされることがあるインキュベータとイメージングシステムの間で。このケースでは4.2（これは完全にサンプルの移動/撹拌を避ける）のステップに進むために最善の方法です。液体培地に浸漬しながら両方の方法では、胚を培養している。胚が完全に（いくつかの従来の組織培養技術の場合と同様に）水中ではない場合、組織の形状が大幅に異常に高い表面張力の負荷とひずみ分布によって変更される正確に通常の3 - D形態形成3、4をキャプチャするために失敗します。また、組織を沈めると、胚の形態およびマーカーの座標を妨げOCT画像の間に気液界面で観測された明るいコントラストを防ぎます。 <ol><li>胚培養（一般） <ol><li>最初の画像（明視野、蛍光、またはOCT）を取得した後、150mMのペトリ皿で​​7 35mmの培養皿（胚を含む）まで入れて、小さなビニール袋で全体のアセンブリを配置します。加湿用の袋に脱イオン水の滴をいくつか追加そして95％O 2 / 5％CO 2混合物でバッグを埋める。 37℃インキュベーターに胚を置く° C、次の撮影タイムポイントまでの希望時間（キューStabiletherm、アッシュビル、ノースカロライナ州）。この方法を使用して、実験は同じ日に複数の胚で行うことができます。 </li></ol></li><li>タイムラプス文化（自動） <ol><li>培養液1.2 mLを含む、デルタTディッシュ（Bioptechs、バトラー、ペンシルバニア州35ミリメートル、外径、テーパーのサイドウォール、0.17ミリメートル厚のガラスと23ミリメートルの中央開口部）にラベルされた胚を置きます。 </li><li> ° C BioptechsデルタT4培養皿のコントローラを（結露を防ぐために）使用して37℃に保たガラス蓋付き皿に蓋をする。ミニポンプ可変流量デバイス（フィッシャーサイエンティフィック）から供給される95％O 2 / 5％CO 2ガスの混合物で胚を表面かん流する。前の胚、熱に達すると暖かい（&lt;100℃）、ホットプレート上で脱イオン水を介してそれをバブリングすることによりガスを加湿する。この実験的なsの概略図ETアップを図1に示されています。 </li><li>自動的にユーザーが指定した時間間隔で画像を取得するためにソフトウェアを設定します。私たちの蛍光顕微鏡の場合、我々は（パーキンエルマー、ウォルサム、マサチューセッツ州）オープンラボソフトウェアを使用して、そして私たちのOCTシステムのために、我々は掃引源Thorlabsソフトウェア（ニュートン、NJ）を使用してください。このメソッドは現在のところに一つタイムラプス実験を扱うことができるだけなので時間は、それは文化のこれらのタイプは、夜間に実行できるようにするのが最善の方法です。一つは、イメージングシステム5のハードウェアとソフトウェアの両方と互換性のある自動翻訳の段階をインストールすることにより、この制限を回避可能性があります。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果： ラベルは、各実験で自動的に追跡（Volocityを使用して、パーキンエルマー社）または手動（ImageJので手動トラッキングプラグインを使用して、NIH）されています。蛍光標識法では、我々は可能なマーカーの座標、を介して2Dサーフェスに合わせてMatlabのルーチンのgridfitを使用してください<html>形態形成の表面の株は6,7を算出する。標準的な方程式は、関連する胚の座標系にこれらの値を変換するために使用されています。また、OCTの技術で、表面はセグメント化された画像のボリュームから生成されます（このようなMatlabやキャレット8など標準的なソフトウェアを介して取得）と株は、試料9の最大値または最小曲率の方向に計算することができます。 我々は初期のニワトリ胚の頭部倍形成中胚葉細胞の動きにラベルを付けたり、追跡するために私達の鉄の粒子の技術を使用していました。図2Aに示すように、蛍光標識した細胞は、全体の胚全体に分布していた。明視野と胚の蛍光画像は 、ex 卵培養中に異なる間隔で捕獲された。追跡されたラベル（図2B、C）の動きは、その後、ヘッド倍に形成した（図2D - F）の間に進化して形態形成のひずみ分布を計算するために使用されていました。 tは&quot;&gt;同様に、私たちのポリスチレンマイクロスフェア技術は初期のニワトリ脳の半ばに後脳境界で組織の動きを追跡するために使用された。図3 BDに示すように、ビーズの動きは、縦とで組織の変形を特徴づける6時間と株のために追跡された円周方向は、マーカーの座標から計算した。この方法は、ビーズのようなはっきりと3 - D変形を扱うことができることに注意して脳の内腔（図3A）のすべての辺に固執する傾向がある。 <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。タイムラプス組織培養のためのセットアップの概略図。 <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。追跡蛍光ラベルを使用して初期のニワトリ胚での2次元組織の変形を定量化。 （）鉄の粒子を除去した後の明視野/ HHステージ5胚の蛍光像を合併。 DII -ラベルED外胚葉細胞（赤色）が全体の胚全体に分散されます。 （B、C）標識細胞の動きは、ImageJを用いて追跡した。ラベルの変位は、胚の座標（X、Y）で計算した。 AとBが同じ画像であることに注意してください。 （DF）ヘッド倍形成の間に長手方向のひずみ分布を進化の等高線プロット。長手方向のラグランジュ株は、（D）75分、（E）120分、およびインキュベーションの（F）165分後にHHステージ5（すなわち、AとB）と比較して計算された。これらの菌株はY軸（ステージ5胚で）に沿って元々指向の線要素の長さの変化を特徴付ける。追跡ラベルを使用すると、形態形成の菌株を計算する座標の詳細については、Filas ら （2007）6、Varner ら （2010）7で見つけることができます。 CとFが同じ画像であることに注意してください。スケールバー= 500μmの。 <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="図3"/> 図3 3次元組織Dの定量初期のニワトリ脳内eformations。背側に付着（黒矢印）と脳の管の腹側（白い矢印）の側面は、OCTの再建の横断section.Ventralビューで周辺組織から容易に識別できるものは半ば後脳境界付近の微小球の位置を示す（A）ポリスチレン微小球（B）HH12時と後に（C）インキュベーションの6時間（M：中脳、H：後脳）。ビーズのいくつかのグループが組織の全体的な変形を強調するために概説されています。 （D）縦（E ZZ）と円周は（Eθθ）ラグランジュの菌株は、これらの変形から計算した。半ば後脳の境界で正の縦と負の周方向の株が培養中にこの地域の延長軸方向と円周方向の短縮を反映している。形態形成の間に複雑な表面のために形態形成の系統の計算に関する詳細は、Filas ら （2008）9で見つけることができます。スケールバー= 200μmの。

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	<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive.">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li><li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+experimental+conditions:+the+effects+of+extraembryonic+forces.">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li><li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia.">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li><li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+fiber+formation:+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters.">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li><li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart.">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li><li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+head+fold+formation:+investigating+tissue-level+forces+during+early+development.">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex.">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li><li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis.">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li><li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging.">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis.">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li><li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tectonics:+morphogenetic+strain+rates,+cell+shape+change+and+intercalation.">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

二つの組織の標識技術は、初期のニワトリ胚の元OVO文化のために表示されている。最初は同時に細胞の数百をラベル付けする磁性鉄微粒子を介して配信蛍光親油性色素を使用しています。蛍光染料は一般的に10月10日を使って周囲の組織から少しコントラストを示すようにしかし、この方法は、現在、光コヒーレンストモグラフィーと互換性がありません。したがって、我々は?...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> 材料/試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM - 高グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td>鶏血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D1408 </td><td> 10X </td></tr><tr><td>ワットマン＃2濾紙</td><td>ワットマン紙</td><td> 1002 090 </td><td> 90ミリメートルの直径</td></tr><tr><td>ガラスのマイクロピペット</td><td>世界の精密楽器（WPI） </td><td> TW150 - 6 </td><td> 1.5ミリメートル、内径</td></tr><tr><td> DII </td><td>インビトロジェン</td><td> D - 282 </td><td></td></tr><tr><td>鉄の減少</td><td> Mallinckrodtベイカー（株） </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10μmの直径ミクロスフェア（黒） </td><td> Polysciences株式会社</td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td>デルタTディッシュ（タイムラプス培養用） </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td>黒、厚さ0.17ミリメートル</td></tr><tr><td>デルタT4培養皿コントローラ</td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td>ミニポンプ可変流量デバイス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tracking morphogenetic tissue deformations in the early chick embryo

胚上皮は、初期胚の原始的な器官を形成するために複雑な変形を（例えば、ねじり、曲げ折り、そしてストレッチ）を行います。これらの細胞の板の表面上で基準マーカを追跡することはそのような成長、収縮、およびせん断などの形態形成量を見積もるための十分に確立された方法です。しかし、すべての面の標識技術は、従来の画像診断法に迅速に適用可能であり、異なる利点と限界を有していない。ここで、我々は2つ​​の標識方法を説明し、各手法の有用性を示しています。最初の方法では、蛍光ラベル、数百は、磁性鉄粒子を用いて胚に同時に適用されます。これらのラベルは、形態形成時の2次元組織の変形量に使用されます。第二の方法、ポリスチレン微小球で3次元組織の変形を追跡するために非侵襲的光コヒーレンストモグラフィー（OCT）画像で造影剤として使用されています。これらの技術は成功しているLYは、初期の頭の倍、心臓、および脳の発達の物理的メカニズムをstudytheに私たちのラボで実施され、広い範囲の形態形成のプロセスに適応可能でなければなりません。

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Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

この記事では、表面のラベルを説明し、<em&gt; EX卵</em初期鶏胚における&gt;組織培養。タイムラプス明視野、蛍光、および光コヒーレンストモグラフィのイメージングへの従順の技術が提示されます。高い時空間分解能で追跡表面のラベルは、2次元および3次元の両方で計算される形態形成株（変形）として運動量を可能にします。

初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.9K ビュー.  Washington University. この記事では、表面のラベルを説明し、 EX卵組織培養。タイムラプス明視野、蛍光、および光コヒーレンストモグラフィのイメージングへの従順の技術が提示されます。高い時空間分解能で追跡表面のラベルは、2次元および3次元の両方で計算される形態形成株（変形）として運動量を可能にします。

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

ニワトリ胚の網膜におけるOVOエレクトロポレーションに

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...