Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01 e R01 GM075200 HL083393 (LAT). Reconhecemos o apoio de bolsas para BAF do NIH T90 DA022871 e do Instituto de Radiologia Mallinckrodt, e para VDV da concessão 09PRE2060795 da Associação Americana do Coração.

1. Preparação Geral Experimental <ol><li> Prepare o meio de cultura de tecidos na capela de fluxo laminar. <ol><li> Dilua Medium Modified Dulbecco Águia (DMEM) (1 garrafa de 4,5 g L com / L de glicose, bicarbonato de sódio, e L-glutamina). Adicionar 10 mL de penicilina / estreptomicina / neomicina antibióticos. </li><li> Remova 100 mL de DMEM com uma pipeta de transferência estéril e substituir por 100 ml de soro pinto. </li><li> Alíquota a garota DMEM/10% de soro / antibióticos de 1% em 15 mL estéreis frascos cônicos e congelar. </li></ol></li><li> Prepare tampão fosfato salino (PBS), suplementado com cálcio e magnésio. Misturar 100 mL PBS 10X, 900 mL de água deionizada, e 1 mL de uma solução de cálcio e magnésio concentrado (100 mg / mL CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml MgCl 2 • 6H 2 O). </li><li> Incubar os ovos em uma orientação longitudinal para o estágio desejado, conforme definido pelo Hamburger e Hamilton 1 (ie 23-25 ​​horas para HH estágio 5, ou 42-48 Horas para estágios HH 11-12). </li><li> Remover embriões do ovo usando o método transportadora filtro de papel. <ol><li> Rachar o fundo do ovo ao lado da placa de Petri A150 mm. Separar a casca do fundo e esvaziar o conteúdo do ovo no prato. </li><li> Remova a mais espessa, viscosa do albúmen do ovo com a pinça romba. </li><li> Cortar círculos de Whatman # 2 papel de filtro 2-3 cm. de diâmetro. Usando um único furo furos, soco no meio do papel de filtro. Coloque um dos anéis de papel de filtro sobre a gema de uma forma que mantém o embrião visível através do furo central no ringue. </li><li> Corte em torno do diâmetro externo do papel de filtro com microtesoura. Remova o papel da gema com uma pinça fina. </li><li> Lave o embrião em PBS para remover partículas gema aderente. (HH5 embriões pode precisar de molho enquanto 15-20 minutos para remover gema residual). Remova o conjunto do papel de filtro do banho e colocá-lo lado ventral em um35 placa de cultura mm. Coloque um anel de papel filtro no topo segundo o primeiro, imprensando o embrião entre os anéis. Colocar um anel de metal do lado de fora do sanduíche de papel de filtro (≈ 1,5-2 cm de diâmetro) para proteger o embrião. </li><li> Submergir o embrião em meio de cultura. Verificar a morfologia adequada e estágio embrionário com um microscópio de campo claro. </li></ol></li><li> Use um extrator da pipeta para preparar agulhas de ponta fina de vidro (1,5 mm de diâmetro interno) (Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota FL) para dissecção do tecido subseqüentes e rotulagem. </li></ol> 2. DII Rotulagem de HH Stage 5 embriões utilizando partículas de ferro magnético <ol><li> Adicione algumas gotas de DII saturada em álcool a uma pequena quantidade de pó de ferro (ferro reduzido, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) em temperatura ambiente e deixe secar. (Isso geralmente faz com que as partículas de bolo juntos uma vez que o álcool tenha evaporado.) Use a ponta de uma micropipeta puxado para quebrar as partículas de ferro agregada,transferi-los para um tubo de microcentrífuga, e lave-os várias vezes e cubra com água deionizada. </li><li> Para identificar as células ectodérmicas em um estágio HH 5 embrião, coloque o embrião colhida (ou seja, o conjunto inteiro de papel filtro) lado dorsal em uma placa de cultura 35 milímetros coberto com uma camada generosa de meios de cultura e colocar o prato sob um microscópio de dissecação. Use uma agulha de vidro para remover a membrana vitelina e expor as células ectodérmicas. (Tome cuidado para não furar embrião.) </li><li> Desenhar uma coluna de partículas de ferro rotulada (em água deionizada) em uma pipeta Pasteur. Usando o microscópio de dissecação submergir, a ponta da pipeta sob a superfície de líquidos ea posição um pouco acima do embrião. Rolando a pipeta lentamente para trás e para frente entre as pontas dos dedos, empurram as partículas para fora do pipiette e polvilhe-os através do embrião. </li><li> Uma vez que o embrião é coberta com partículas, cuidadosamente colocá-lo em uma incubadora de 37 ° C por aproximadamente 10 minutos. Tome embrião fora da incubadora umd usar um forte ímã para remover as partículas. </li><li> Use um microscópio de fluorescência com câmera de vídeo conectada e apropriado configurações de filtro para adquirir tanto de campo claro e imagens fluorescentes do embrião, como mostrado na Figura 2A, B. </li><li> Observe a densidade de etiqueta. Se uma distribuição mais densa é desejado, use partículas adicionais (como descrito acima) para rotular o embrião novamente e estender o tempo de incubação em conformidade. Se os rótulos são muito denso, adicione uma pequena quantidade de partículas de ferro não marcado para o tubo de microcentrífuga cheio de partículas já etiquetados e misturar o conteúdo do tubo. Repita o processo de etiquetagem com um novo embrião e, novamente, nota densidade rótulo. </li></ol> 3. Rotulagem de poliestireno Microesfera de Tomografia de Coerência Óptica (OCT) Imaging da HH11-12 embriões <ol><li> Prepare uma solução de preto 10 mM diâmetro microesferas (Polysciences Inc., Warrington, PA) em PBS numa placa de Petri 35 mm. (Beads deve ser grande o suficiente para gerar contraste para outubroimagem, mas pequena o suficiente de modo que o tamanho do grânulo é da ordem de células individuais. Valores específicos variam de acordo com a resolução do seu sistema de outubro e os tecidos em estudo). Uma gota da solução-mãe (2,6% de sólidos de látex) por mL de PBS é geralmente suficiente. Puxe esta solução para uma seringa 10cc usando uma agulha de calibre 22. Vortex da solução por 30 segundos para assegurar uma distribuição uniforme do grânulo. </li><li> Bevel as pontas de suas agulhas de vidro puxado através de um disco rígido do computador 2. Diâmetro da ponta deve ser grande o suficiente para que contas podem caber através da abertura, mas, ao mesmo tempo, tão pequeno quanto possível para minimizar ferindo o tecido durante a injeção. </li><li> Preencher uma agulha de vidro chanfrado com a solução de talão utilizando a seringa. Levemente o filme micropipeta para garantir que a solução atingiu a ponta. </li><li> Usando um micromanipulador, coloque a agulha de vidro no mesmo campo de visão como o embrião. Contas devem estar fluindo para fora da ponta da pipeta. <ol><li> Se não beads sair da micropipeta, pode haver uma obstrução. Neste caso, repita os passos de 3,2-3,4 com uma agulha de vidro novo. </li><li> Se contas muitas nuvens o seu campo de visão, a sua ponteira pode ser muito grande. Repita os passos 3,2-3,4 com uma pipeta nova e um novo embrião. </li></ol></li><li> Inserir a ponta da pipeta para o lúmen do tubo cérebro. Cuidado para não furar o chão ventral do tecido. Você verá um inchaço transitório do tecido como contas de e fluido entrar no lúmen. Isso indica uma intubação bem sucedida, agora, remover rapidamente a agulha de vidro. </li><li> Verificar uma densidade suficiente talão na luz interna do tubo cérebro usando um microscópio de campo claro. Deixe as contas para resolver 20 - 30 minutos antes de proceder à Sect. 4. </li></ol> 4. Aquisição de Dados * Os seguintes métodos são adequados para a técnica de fluorescência de rotulagem descritos acima. No entanto, com a técnica de rotulagem microesfera, contas pode desalojar na transferência de amostrasentre incubadoras de empresas e sistemas de imagem. Neste caso o melhor é avançar para o passo 4.2 (o que evita a amostra movimento / agitação completamente). Em ambos os métodos, os embriões são cultivados ao mesmo tempo submerso em meio de cultura líquido. Se o embrião não é completamente submerso (como é o caso de algumas técnicas de cultura de tecido convencional), a geometria do tecido é grandemente alterada pela anormalmente cargas de superfície de alta tensão e distribuições tensão vai deixar de capturar com precisão morfogênese 3-D normal 3, 4. Além disso, submergindo o tecido impede o contraste brilhante observada na interface líquido-gás durante outubro de imagens de obscurecer a morfologia embrionária e as coordenadas do marcador. <ol><li> Cultura de embriões (geral) <ol><li> Depois de adquirir o seu primeiras imagens (de campo claro, fluorescência, ou outubro), colocar até sete pratos 35 milímetros de cultura (com embriões) em uma placa de Petri 150 mm e coloque o conjunto inteiro em um saco plástico pequeno. Adicione algumas gotas de água deionizada para a bolsa de umidificaçãoe encher o saco com um 95% O 2 / 5% CO 2 da mistura. Coloque os embriões na incubadora a 37 ° C (Queue Stabiletherm, Asheville, Carolina do Norte) para o tempo desejado até a próxima imagem timepoint. Usando este método, experimentos podem ser realizados em embriões múltiplos no mesmo dia. </li></ol></li><li> Time-lapse cultura (automatizado) <ol><li> Coloque seu embriões rotulados em um prato T Delta (35 mm de diâmetro externo, 23 mm de abertura central, com parede lateral cônico, 0,17 milímetro de espessura de vidro; Bioptechs, Butler, PA), contendo 1,2 mL de meio de cultura. </li><li> Cubra o prato com uma tampa de vidro mantida a 37 ° C usando um controlador Bioptechs Delta Dish T4 Cultura (para evitar a condensação). Superfuse o embrião com um 95% O 2 / 5% CO 2 fornecido mistura de gás de um dispositivo de fluxo Mini-Bomba Variável (Fisher Scientific). Antes de atingir o embrião, o calor e umidificar o gás por borbulhamento através de água deionizada em um quente (&lt;100 ° C) chapa quente. Um esquema deste s experimentalet-up é mostrado na Figura 1. </li><li> Configurar o software para adquirir automaticamente imagens em intervalos de tempo especificados pelo usuário. Para o nosso microscópio de fluorescência, usamos Openlab software (PerkinElmer, Waltham, MA), e para o nosso sistema de outubro, usamos varreu fonte Thorlabs software (Newton, NJ). Como esse método é atualmente apenas capaz de lidar com uma experiência de lapso de tempo em um tempo, muitas vezes é melhor para permitir que estes tipos de culturas para executar durante a noite. Pode-se contornar essa limitação através da instalação de um palco automatizado traduzíveis compatível com o hardware eo software do sistema de imagens 5. </li></ol></li></ol> 5. Resultados representativos: Etiquetas são rastreadas automaticamente (usando Volocity, PerkinElmer) ou manualmente (usando o plugin manual Rastreamento em ImageJ, NIH) em cada experimento. Na técnica de fluorescência, usamos o gridfit rotina Matlab para caber superfícies 2D através das coordenadas do marcador, o que permite<html> cepas superfície morfogenética a ser calculada 6, 7. Equações padronizadas são usadas para transformar esses valores em um sistema de coordenadas relevantes embrionárias. Alternativamente, na técnica de outubro, as superfícies são geradas a partir de volumes imagem segmentada (obtido via software padrão, como Matlab ou Caret 8) e as tensões podem ser calculadas na direção de curvatura máximo ou mínimo da amostra 9. Usamos a nossa técnica de partículas de ferro para rotular e controlar o movimento de células ectodérmicas durante a formação da cabeça vezes no embrião de galinha cedo. Como mostrado na Figura 2A, células fluorescente etiquetado foram distribuídos em todo o embrião inteiro. Campo claro e imagens fluorescentes do embrião foram capturados em diferentes intervalos durante a cultura ovo ex. Os movimentos dos rótulos rastreados (Fig. 2B, C) foram então usados ​​para calcular as distribuições morfogenética evoluindo tensão durante a formação da cabeça dobra (Fig. 2D-F). t &quot;&gt; Da mesma forma, a nossa técnica de microesferas de poliestireno foi utilizada para rastrear os movimentos dos tecidos na fronteira meados de rombencéfalo do cérebro pinto cedo. Conforme mostrado na Figura 3 BD, movimentos talão foram monitorados por 6 horas e tensões que caracterizam a deformação dos tecidos na longitudinal e direções circunferenciais foram calculados a partir das coordenadas do marcador. Note que este método é capaz de lidar nitidamente 3-D deformações como contas tendem a se ater a todos os lados do lúmen interno do cérebro (Fig. 3A). <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquemático de set-up para o lapso de tempo de cultura de tecidos. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Quantificar 2-D deformações do tecido no embrião de galinha cedo rastreados usando marcadores fluorescentes. (A) imagem brilhante Merged campo / fluorescente de HH embrião estágio 5 após a remoção de partículas de ferro. DII-labeled células ectodérmicas (vermelho) são distribuídos em todo o embrião inteiro. (B, C) O movimento de células marcadas foi monitorado usando ImageJ. Deslocamentos rótulo foram calculados em coordenadas embrião (X, Y). Note-se que A e B são a mesma imagem. (DF) parcelas Contour de evoluir distribuições deformação longitudinal durante a formação da cabeça desistir. Cepas longitudinal de Lagrange foram calculados em relação ao HH estágio 5 (ie, A e B) depois (D) 75 min, (E) 120 min, e (F) 165 min de incubação. Essas cepas caracterizar a variação do comprimento dos elementos da linha originalmente orientada ao longo do eixo Y (no embrião estágio 5). Mais detalhes sobre o uso do rótulo rastreado coordenadas para calcular cepas morfogenéticos podem ser encontrados em Filas et al (2007). 6 e Varner et al. (2010) 7. Note-se que C e F são a mesma imagem. Barra de escala = 500 mm. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Quantificação de tecido 3-D deformations no cérebro pinto cedo. (A) de poliestireno microesferas que aderem à (seta preta) dorsal e ventral (seta branca) os lados do tubo do cérebro são facilmente discerníveis a partir de tecidos circundantes em vista transversal cruz section.Ventral de reconstruções outubro mostram locais micro perto do limite rombencéfalo mid- em (B) H12 e depois (C) 6 h de incubação (M: mesencéfalo, H: rombencéfalo). Vários grupos de contas são apresentadas para realçar a deformação total do tecido. (D) Longitudinal (E zz) e circunferencial (E θθ) cepas de Lagrange foram calculados a partir dessas deformações. Positivos e negativos longitudinal cepas circunferencial na fronteira meados de rombencéfalo refletem um crescimento axial e encurtamento circunferencial da região durante a cultura. Mais detalhes sobre o cálculo de tensões morfogenéticos para superfícies complexas durante a morfogênese pode ser encontrado em Filas et al. (2008) 9. Barra de escala = 200 mM.

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	<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive.">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li><li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+experimental+conditions:+the+effects+of+extraembryonic+forces.">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li><li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia.">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li><li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+fiber+formation:+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters.">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li><li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart.">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li><li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+head+fold+formation:+investigating+tissue-level+forces+during+early+development.">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex.">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li><li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis.">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li><li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging.">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis.">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li><li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tectonics:+morphogenetic+strain+rates,+cell+shape+change+and+intercalation.">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Duas técnicas de rotulagem de tecido são apresentados para a cultura ex ovo de embriões de galinha cedo. O primeiro usa corantes fluorescentes lipofílico entregues via partículas de ferro magnético para simultaneamente rótulo centenas de células. No entanto, este método não é compatível com tomografia de coerência óptica, como corantes fluorescentes mostram geralmente pouco contraste dos tecidos adjacentes utilizando 10 de outubro. Por isso, vamos mostrar uma técnica alternativa utiliz...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM - glicose alta </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina / Neomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td> Chicken Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline Dulbecco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1408 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Whatman # 2 Papel Filtro </td><td> Whatman </td><td> 1002 090 </td><td> 90 milímetros de diâmetro </td></tr><tr><td> Micropipetas de vidro </td><td> Precision mundoInstrumentos (WPI) </td><td> TW150-6 </td><td> Diâmetro interno 1,5 milímetros </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-282 </td><td></td></tr><tr><td> Redução de ferro </td><td> Mallinckrodt Baker Inc. </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10 M Diâmetro Microesferas (preto) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td> Delta T Dish (para a cultura do lapso de tempo) </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td> 0,17 milímetros de espessura, preto </td></tr><tr><td> Delta Controlador Dish T4 Cultura </td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Bomba Dispositivo de Fluxo Variável </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tracking morphogenetic tissue deformations in the early chick embryo

Embrionárias epitélios sofrem deformações complexos (por exemplo, dobrar, torcer, dobrar, e alongamento) para formar os órgãos primitivo do embrião em estágio inicial. Rastreamento de marcadores fiduciais na superfície dessas folhas celular é um método bem estabelecido para estimar quantidades morfogenéticos, tais como crescimento, cisalhamento contração, e. No entanto, nem todas as técnicas de rotulagem de superfície são facilmente adaptáveis ​​às modalidades de imagem convencional e possui diferentes vantagens e limitações. Aqui, descrevemos dois métodos de rotulagem e ilustrar a utilidade de cada técnica. No primeiro método, centenas de etiquetas fluorescentes são aplicadas simultaneamente para o embrião usando partículas de ferro magnético. Esses rótulos são então usadas para quantidade deformações 2-D durante a morfogênese do tecido. No segundo método, poliestireno microesferas são usadas como agentes de contraste em não-invasivo tomografia de coerência óptica de imagem (OCT) para acompanhar as deformações do tecido 3-D. Estas técnicas têm sido bem sucedidasly implementados em nosso laboratório para estudo The mecanismos físicos de dobra a cabeça no início, o coração, eo desenvolvimento do cérebro, e deve ser adaptável a uma ampla gama de processos morfogenéticos.

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Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Este artigo descreve a rotulagem de superfície e<em&gt; Ex ovo</em&gt; Cultura de tecidos no embrião de galinha cedo. Técnicas passíveis de lapso de tempo de campo claro, fluorescência e tomografia de coerência óptica de imagem são apresentados. Etiquetas de rastreamento de superfície com resolução espaço-temporal permite alta quantidades cinemáticas, como cepas morfogenética (deformações), a ser calculado de duas e três dimensões.

Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

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Research

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Biology

12.9K visualizações.  Washington University. Este artigo descreve a rotulagem de superfície e Ex ovo Cultura de tecidos no embrião de galinha cedo. Técnicas passíveis de lapso de tempo de campo claro, fluorescência e tomografia de coerência óptica de imagem são apresentados. Etiquetas de rastreamento de superfície com resolução espaço-temporal permite alta quantidades cinemáticas, como cepas morfogenética (deformações), a ser calculado de duas e três dimensões.

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Transfecção única célula em embriões de galinha

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...