Diese Methode ermöglicht es den Forschern, Gewebeinteraktionen zwischen dem basalen Vorderhirn und dem Gesicht zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das basale Vorderhirn für die Beurteilung isoliert und eine Kontamination mit Neuralleistenzellen verhindert, die die Analyse verfälschen würde. Der schwierige Teil dieser Technik ist die Entnahme des Vorderhirns aus dem Wirt und der Ersatz durch das Spendergewebe.
Das Verfahren wird von Diane Hu, einer Forscherin aus dem Labor von Dr. Ralph Marcucio, demonstriert. Bereiten Sie zunächst DMEM-Medien mit neutralem Rot, einer Glastransferpipette und geschärftem Wolfram vor. Entfernen Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel 0,5 Milliliter Albumin vom spitzen Ende der Eierschale.
Machen Sie mit der Scherenspitze ein kleines Loch auf der Oberseite der Schale. Legen Sie dann ein Stück Klebeband über das Loch und schneiden Sie eine kreisförmige Öffnung, um den Embryo freizulegen. Färben Sie den Embryo mit neutralem Rot.
Entnahme von Gewebetransplantaten aus der linken Seite des basalen Vorderhirns von Embryonen im siebten oder achten Stadium. Verwenden Sie gebogene, geschärfte Wolframnadeln, um ein Stück des Vorderhirns vorsichtig einzuschneiden. Um das darunterliegende Endoderm nicht einzuschließen, schieben Sie die Nadel unter das Vorderhirn und parallel zur Achse des Neuralrohrs.
Nehmen Sie das Transplantat mit der Glastransferpipette vom Spenderembryo auf und übertragen Sie es zwei Minuten lang in DMEM, das neutrales Rot enthält, um es zu färben. Legen Sie dann das gefärbte Transplantat in DMEM, das kein neutrales Rot enthält, bis es für die Transplantation bereit ist. Befruchtete Eier von weißen Leghorn-Hühnern bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer bis zum Hamburger-Hamilton-Stadium sieben bis acht bebrüten.
Legen Sie die Embryonen frei, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie die Transplantatstelle mit geschärften Wolframnadeln vor, indem Sie ein 0,3 x 0,2 Millimeter großes Stück des basalen Vorderhirns abschneiden und dann entfernen, um das Transplantat aufzunehmen. Vermeiden Sie eine übermäßige Zerstörung des darunter liegenden Endoderms, die offensichtlich wird, da Dotterkörner durch jeden entstandenen Riss austreten.
Nachdem Sie das Transplantat auf den Wirt übertragen haben, positionieren Sie das Transplantat so, dass es das exstirpierte basale Vorderhirn des Wirts ersetzt. Legen Sie Klebeband fest über das Loch und bringen Sie die Embryonen in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator zurück, bis sie für die Analyse bereit sind. Ursprünglich wurden Chimären durch die Transplantation von Wachtelgewebe in Kükenembryonen erzeugt.
Mit Hilfe des QCPN-Antikörpers wurden Wachtelzellen sichtbar gemacht und vom Wirtsgewebe unterschieden. Das Wachtel-Küken-System bestätigte, dass das gesamte Transplantat nur aus Nervengewebe bestand und nicht mit anderen Zelltypen kontaminiert war. Die Transplantation von Wachtelgewebe in Entenembryonen führte aufgrund eines sich schneller entwickelnden Wachtelgehirns zu stark deformierten Chimären.
Dazu wurde eine Transplantation von Entengewebe in Hühnerembryonen durchgeführt. Die daraus resultierenden Enten-Küken-Chimären deuten darauf hin, dass das Gehirn an der Regulierung der Morphologie beteiligt ist. Die Whole-Mountain-C2-Hybridisierung wurde verwendet, um die Expression von Sonic hedgehog in Chimären zu untersuchen.
Ähnlich wie bei der Morphologie schien der Ausdruck des Sonic Hedgehog auf der Entenseite der Chimäre eher entenartig zu sein. Das Vorbereiten des Host-Standorts erfordert Übung. Eine große Anzahl von Embryonen überlebt nicht, so dass die Schaffung einer großen Anzahl von Chimären dazu beitragen kann, dass die richtigen Proben für die Analyse geeignet sind.
Mit dieser Methode konnte beurteilt werden, wie Signale aus dem Gehirn die Sonic hedgehog-Expressionsdomäne in der frontonasalen ektodermalen Zone formen.
