Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R01 GM075200 y HL083393 R01 (LAT). Reconocemos el apoyo de becas para BAF de los NIH T90 DA022871 y el Instituto de Radiología Mallinckrodt, y VDV desde la concesión 09PRE2060795 de la Asociación Americana del Corazón.

1. Preparación Experimental generales <ol><li> Preparar el medio de cultivo de tejidos en la campana de flujo laminar. <ol><li> Diluir medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) (1 botella de L con 4,5 g / l de glucosa, bicarbonato de sodio, y L-glutamina). Añadir 10 ml de penicilina / estreptomicina / antibióticos neomicina. </li><li> Tomar 100 ml de DMEM con una pipeta de transferencia estéril y reemplazar con 100 ml de suero de pollo. </li><li> Alícuota del DMEM/10% de pollo suero / 1% de los antibióticos en 15 viales estériles ml y congelar. </li></ol></li><li> Preparar tampón fosfato salino (PBS) suplementado con calcio y magnesio. Mezclar 100 ml de PBS 10X, 900 ml de agua desionizada, y 1 ml de una solución concentrada de calcio y magnesio (100 mg / mL de CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml de MgCl 2 • 6H 2 O). </li><li> Incubar los huevos en una orientación longitudinal a la etapa deseada según la definición de Hamburger y Hamilton 1 (es decir 23 a 25 horas para la etapa HH 5, o 42-48 Horas para las etapas HH 11-12). </li><li> Eliminar los embriones de los huevos con el método del papel soporte del filtro. <ol><li> Romper la parte inferior del huevo en el lado de la A150 mm placa de Petri. Separar la cáscara de la parte inferior y vaciar el contenido del huevo en el plato. </li><li> Retire la más gruesa, viscosa albúmina del huevo con unas pinzas romas. </li><li> Cortar círculos de Whatman # 2 el papel de filtro 2-3 cm. de diámetro. El uso de un solo taladro, agujeros en el centro del papel de filtro. Coloque uno de los anillos de papel de filtro en la yema de un modo que mantiene el embrión visible a través del agujero central en el ring. </li><li> Corte alrededor del diámetro exterior del papel de filtro con micro tijeras. Retire el papel de la yema de huevo con unas pinzas finas. </li><li> Enjuague suavemente el embrión en PBS para eliminar las partículas adheridas yema de huevo. (HH5 embriones puede necesitar para disfrutar el tiempo de 15-20 minutos para eliminar la yema residual). Retire el conjunto del filtro de papel del baño y se coloca con la parte ventral en un35 mm placa de cultivo. Coloque un segundo anillo de papel de filtro encima de la primera, intercalando el embrión entre los anillos. Poner un anillo de metal alrededor de la parte exterior del sándwich de papel de filtro (≈ 1,5 a 2 cm de diámetro) para obtener el embrión. </li><li> Sumerja el embrión en el medio de cultivo. Verificar la morfología adecuada y la etapa embrionaria con un microscopio de campo claro. </li></ol></li><li> Use un extractor de pipeta para preparar finas agujas de vidrio punta (1,5 mm de diámetro interior) (Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota FL) para las disecciones de tejidos posterior y el etiquetado. </li></ol> 2. DII Etiquetado de HH Etapa 5 embriones con partículas de hierro magnético <ol><li> Añadir unas gotas de DII saturadas en alcohol a una pequeña cantidad de polvo de hierro (hierro reducido, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey) a temperatura ambiente y dejar secar. (Esto generalmente hace que las partículas de pastel juntos una vez que el alcohol se haya evaporado.) Use la punta de una micropipeta tiró para romper las partículas de hierro agrupada,transferirlos a un tubo de microcentrífuga, y enjuague varias veces y cubrir con agua desionizada. </li><li> Para etiquetar las células ectodérmicas en una etapa de HH 5 embrión, el embrión lugar cosechada (es decir, todo el conjunto de papel de filtro) dorso en una placa de cultivo de 35 mm cubierto con una capa generosa de medios de cultivo y poner el plato bajo un microscopio de disección. Use una aguja de vidrio para eliminar la membrana vitelina y exponer a las células ectodérmicas. (Tenga cuidado de no perforar embrión). </li><li> Dibuja una columna de partículas de hierro marcado (en agua desionizada) en una pipeta de Pasteur. Usando el microscopio de disección, sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del líquido y la posición justo por encima del embrión. Al girar la pipeta lentamente hacia adelante y hacia atrás entre las yemas de los dedos, se empujan las partículas fuera de la pipiette y espolvorear todo el embrión. </li><li> Una vez que el embrión está cubierto de partículas, que lo coloque en una incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 10 minutos. Tome embrión de la incubadora unad uso de un potente imán para eliminar las partículas. </li><li> Utilizar un microscopio de fluorescencia con cámara de vídeo conectada y adecuada configuración de los filtros para adquirir el campo claro y las imágenes fluorescentes del embrión, como se muestra en la Figura 2, B. </li><li> Tenga en cuenta la densidad de la etiqueta. Si una distribución más densa se desea, utilice partículas adicionales (como se describió anteriormente) para etiquetar el embrión una vez más y extender el tiempo de incubación en consecuencia. Si las etiquetas son demasiado densas, añadir una pequeña cantidad de partículas de hierro no-marcados con el tubo de microcentrífuga lleno de partículas ya etiquetados y mezclar el contenido del tubo. Repita el proceso de etiquetado con un nuevo embrión y una vez más en cuenta la densidad de la etiqueta. </li></ol> 3. Etiquetado de microesferas de poliestireno de tomografía de coherencia óptica (OCT) de imágenes de HH11-12 embriones <ol><li> Prepare una solución de negro de 10 micras de diámetro microesferas (Polysciences Inc., Warrington, PA) en PBS en una placa de Petri de 35 mm. (Cuentas debe ser lo suficientemente grande como para generar contraste para octubreimagen, pero lo suficientemente pequeño tal que el tamaño de grano es del orden de las células individuales. Valores específicos pueden variar dependiendo de la resolución de su sistema de octubre y los tejidos en estudio). Una gota de la solución madre (2,6% de sólidos de látex) por ml de PBS es suficiente. Tire de esta solución en una jeringa de 10 cc con una aguja de calibre 22. Vortex la solución durante 30 segundos para asegurar una distribución uniforme de cuentas. </li><li> Bisel las puntas de las agujas de vidrio tirado con un disco duro del ordenador 2. Diámetro de la punta debe ser lo suficientemente grande que las cuentas pueden tener acceso desde la apertura, pero al mismo tiempo, lo más pequeño posible para minimizar la herida de tejido durante la inyección. </li><li> Llene una aguja de cristal biselado con la solución de cuentas con la jeringa. Ligera película de la micropipeta para asegurarse de que la solución se ha llegado a la punta. </li><li> El uso de un micromanipulador, colocar la aguja de vidrio en el mismo campo de visión como el embrión. Cuentas debe ser que sale de la punta de la pipeta. <ol><li> Si no beads salir de la micropipeta, puede haber una obstrucción. En este caso, repita los pasos 3.2-3.4 con una aguja de vidrio nuevo. </li><li> Si demasiados collares nublar tu campo de visión, la punta de la pipeta puede ser demasiado amplio. Repita los pasos 3.2 a 3.4 con una pipeta nueva y un nuevo embrión. </li></ol></li><li> Inserte la punta de la pipeta en el lumen del tubo de cerebro. Asegúrese de no perforar el piso ventral del tejido. Usted verá una inflamación transitoria de los tejidos como los granos y líquidos entrar la luz. Esto indica una intubación exitosa, ahora, rápidamente saque la aguja de vidrio. </li><li> Verificar una densidad suficiente de cuentas en la luz interior del tubo del cerebro usando un microscopio de campo claro. Deje que las cuentas se conforme con 20 - 30 minutos antes de proceder a la secta. 4. </li></ol> 4. Adquisición de Datos * Los siguientes métodos son adecuados para la técnica de fluorescencia de etiquetado se ha descrito anteriormente. Sin embargo, con la técnica de etiquetado de las microesferas, las cuentas se pueden desprender cuando la transferencia de muestrasentre las incubadoras y sistemas de imágenes. En este caso lo mejor es continuar con el paso 4.2 (lo que evita el movimiento de la muestra / agitación en total). En ambos métodos, los embriones son cultivados mientras está sumergido en un medio de cultivo líquido. Si el embrión no está completamente sumergida (como es el caso de algunas de las técnicas de cultivo convencionales de tejidos), la geometría del tejido está muy alterado debido a la deformación altas cargas de tensión superficial y la distribución de la tensión se logran captar con precisión lo normal en 3-D morfogénesis 3, 4. Por otra parte, sumergiendo el tejido impide el contraste brillante observada en la interfase líquido-gas en octubre de imágenes de oscurecer la morfología embrionarias y las coordenadas del marcador. <ol><li> Embrión de Cultura (general) <ol><li> Después de la adquisición de su primera imagen (campo claro, fluorescencia, o PTU), poner un máximo de siete placas de 35 mm de la cultura (los embriones) en un 150 mm placa de Petri y el lugar todo el conjunto en una pequeña bolsa de plástico. Añadir un par de gotas de agua desionizada a la bolsa para la humidificacióny llenar la bolsa con un 95% O 2 / 5% mezcla de CO 2. Colocar los embriones en la incubadora a 37 ° C (cola Stabiletherm, Asheville, Carolina del Norte) durante el tiempo deseado hasta el siguiente punto de tiempo de imágenes. El uso de este método, los experimentos se pueden realizar en varios embriones en el mismo día. </li></ol></li><li> Time-lapse cultura (automatizada) <ol><li> Coloque los embriones etiquetados en un plato de Delta T (35 mm de diámetro exterior, 23 mm de abertura central con pared lateral cónica, de vidrio grueso 0.17mm; Bioptechs, Butler, PA) que contiene 1,2 ml de medio de cultivo. </li><li> Cubra el plato con una tapa de vidrio se mantuvo a 37 ° C con un Bioptechs Delta T4 controlador de placa de cultivo (para evitar la condensación). Superfuse el embrión con un 95% O 2 / 5% CO 2 mezcla de gas suministrado desde un dispositivo variable Mini-bomba (Fisher Scientific). Antes de alcanzar el embrión, calentar y humidificar el gas por burbujeo a través del agua desionizada en un ambiente cálido (&lt;100 ° C) plato caliente. Un esquema de este s experimentalet-up se muestra en la Figura 1. </li><li> Configurar el software para adquirir automáticamente las imágenes a intervalos de tiempo especificados por el usuario. Para nuestro microscopio de fluorescencia, se utiliza Openlab software (PerkinElmer, Waltham, MA), y para nuestro sistema de octubre, se utiliza barrido fuente Thorlabs software (Newton, NJ). Debido a que este método es en la actualidad sólo capaz de manejar un lapso de tiempo en el experimento un tiempo, a menudo es mejor permitir que este tipo de culturas que durante la noche. Se podría sortear esta limitación mediante la instalación de un escenario automatizado traducible compatible con el hardware y el software del sistema de imagen 5. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos: Las etiquetas se realiza un seguimiento de forma automática (mediante Volocity, PerkinElmer) o manualmente (con el plug-in Manual de seguimiento en ImageJ, NIH) en cada experimento. En la técnica de marcaje fluorescente, se utiliza la rutina de Matlab gridfit para adaptarse a las superficies de 2D a través de las coordenadas marcador, lo que permite<html> cepas morfogenéticos superficie que se calcula 6, 7. Ecuaciones estándar se utilizan para transformar estos valores en un sistema de coordenadas embrionarias correspondientes. Por otra parte, en la técnica de octubre, las superficies se generan a partir de los volúmenes de la imagen segmentada (obtenido a través de software estándar, como Matlab o Caret 8) y las cepas se puede calcular en la dirección de curvatura máximo o mínimo de la muestra 9. Utilizamos nuestra técnica de partículas de hierro para marcar y seguir el movimiento de las células ectodérmicas durante la formación de la cabeza veces en el embrión de pollo temprano. Como se muestra en la Figura 2A, las células de la etiqueta fluorescente se distribuyeron en todo el embrión completo. Campo claro y las imágenes fluorescentes de los embriones fueron capturados en diferentes intervalos durante el cultivo in ovo ex. Los movimientos de las etiquetas de seguimiento (Fig. 2B, C) se utilizaron para calcular la distribución de la evolución de la tensión morfogenéticos durante la formación de cabeza doble (Fig. 2D-F). t &quot;&gt; Del mismo modo, la técnica de microesferas de poliestireno se utiliza para rastrear los movimientos de los tejidos en la frontera a mediados de cerebro posterior del cerebro de pollo temprano. Como se muestra en la Figura 3 BD, movimientos de cuentas fueron rastreadas durante 6 horas y las tensiones que caracterizan la deformación del tejido en sentido longitudinal y direcciones circunferenciales se calcula a partir de las coordenadas del marcador. Tenga en cuenta que este método es capaz de manejar claramente en 3-D deformaciones como cuentas tienden a adherirse a todos los lados de la luz interna del cerebro (Fig. 3). <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema de puesta a punto para el cultivo de tejidos de lapso de tiempo. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Cuantificación de 2-D deformaciones de tejido en el embrión de pollo temprano con un seguimiento etiquetas fluorescentes. (A) brillante combinados de campo / fluorescentes de imágenes de la etapa 5 HH de embriones después de la eliminación de partículas de hierro. DII-etiquetaed células ectodérmicas (rojo) se distribuyen en todo el embrión completo. (B, C) El movimiento de las células marcadas se siguió utilizando ImageJ. Desplazamientos etiqueta se calcularon las coordenadas de embriones (X, Y). Tenga en cuenta que A y B son la misma imagen. (DF) parcelas de contorno de la evolución de la distribución longitudinal tensión durante la formación de cabeza doble. Longitudinal cepas de Lagrange se calculan en relación con HH etapa 5 (es decir, A y B) después (D) 75 min, (E) 120 min, y (F) 165 minutos de incubación. Estas cepas caracterizan los cambios de longitud de los elementos de la línea originalmente orientado a lo largo del eje Y (en la etapa 5 del embrión). Más detalles sobre el uso de la etiqueta seguimiento de coordenadas para el cálculo de las cepas morfogenéticos se pueden encontrar en Filas et al. (2007) 6 y Varner et al. (2010) 7. Tenga en cuenta que C y F son la misma imagen. Barra de escala = 500 micras. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Cuantificación de 3-D del tejido deformations en el cerebro de pollo temprano. (A) microesferas de poliestireno que se adhieren a la (flecha negro) dorsal y ventral (flecha blanca) lados del tubo del cerebro son fácilmente discernibles de los tejidos circundantes de puntos de vista transversal cruz section.Ventral reconstrucciones de octubre muestran la ubicación de las microesferas cerca de la frontera a mediados de rombencéfalo en (B) HH12 y después (C) 6 horas de incubación (M: mesencéfalo, H: cerebro posterior). Varios grupos de cuentas se resumen para destacar la deformación total del tejido. (D) longitudinal (E zz) y circunferencial (E θθ) de las cepas de Lagrange se calcula a partir de estas deformaciones. Cepas positivas y negativas circunferencia longitudinal en el límite de mediados de los hindbrain reflejan un alargamiento axial y acortamiento circunferencial de la región durante el cultivo. Más detalles sobre el cálculo de las cepas morfogenética de superficies complejas durante la morfogénesis se puede encontrar en Filas et al. (2008) 9. Barra de escala = 200 micras.

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	<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive.">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li><li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+experimental+conditions:+the+effects+of+extraembryonic+forces.">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li><li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia.">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li><li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+fiber+formation:+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters.">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li><li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart.">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li><li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+head+fold+formation:+investigating+tissue-level+forces+during+early+development.">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex.">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li><li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis.">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li><li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging.">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis.">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li><li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tectonics:+morphogenetic+strain+rates,+cell+shape+change+and+intercalation.">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Dos técnicas de etiquetado de los tejidos se presentan para el cultivo ex ovo de embriones de pollo temprano. El primero utiliza tintes fluorescentes lipofílicos entregado a través de partículas de hierro magnético para etiquetar simultáneamente cientos de células. Sin embargo, este método no es compatible con la tomografía de coherencia óptica, como los tintes fluorescentes en general, poco contraste de los tejidos circundantes con 10 de octubre. Por lo tanto, se muestra una técnica alter...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM - altos de glucosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina / Neomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de pollo </td><td> Invitrogen </td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco solución salina tamponada </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1408 </td><td> 10 veces </td></tr><tr><td> Whatman # 2 Filtro de papel </td><td> Whatman </td><td> 1002 090 </td><td> 90 mm de diámetro </td></tr><tr><td> Micropipetas de vidrio </td><td> World PrecisionInstrumentos (IPM) </td><td> TW150-6 </td><td> Diámetro interior de 1,5 mm </td></tr><tr><td> Dii </td><td> Invitrogen </td><td> D-282 </td><td></td></tr><tr><td> Hierro reducido </td><td> Mallinckrodt Baker Inc. </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10 micras de diámetro microesferas (negro) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td> Delta T plato (para la cultura de lapso de tiempo) </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td> Espeso, negro, 0,17 mm </td></tr><tr><td> Delta Cultura T4 controlador de plato </td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td> Mini-bomba de caudal variable de dispositivos </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tracking morphogenetic tissue deformations in the early chick embryo

Epitelios embrionarios sufren deformaciones complejas (por ejemplo, flexión, torsión, plegado y estiramientos) para formar los órganos primitiva del embrión temprano. Seguimiento de los marcadores de referencia en las superficies de estas hojas de celular es un método bien establecido para la estimación de cantidades morfogenéticos tales como el crecimiento, la contracción, y de corte. Sin embargo, no todas las técnicas de etiquetado de la superficie son fácilmente adaptables a las técnicas de imagen convencionales y poseen distintas ventajas y limitaciones. Aquí se describen dos métodos de etiquetado y de ilustrar la utilidad de cada técnica. En el primer método, cientos de etiquetas fluorescentes se aplican simultáneamente para el embrión utilizando partículas de hierro magnético. Estas etiquetas se utilizan para la cantidad de 2-D deformaciones de tejido durante la morfogénesis. En el segundo método, microesferas de poliestireno se utilizan como agentes de contraste no invasivo en la coherencia de tomografía óptica (OCT) para realizar un seguimiento de imágenes 3-D deformaciones de tejido. Estas técnicas han tenido éxitomente a cabo en nuestro laboratorio para studythe mecanismos físicos de veces la cabeza principios, el corazón y el desarrollo del cerebro, y debe ser adaptable a un amplio rango de procesos morfogenéticos.

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Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

En este artículo se describe el etiquetado y la superficie<em&gt; Ovo ex</em&gt; Cultivo de tejidos en el embrión de pollo temprano. Técnicas susceptibles de campo de lapso de tiempo brillante, fluorescencia e imágenes de tomografía de coherencia óptica se presentan. Seguimiento de las etiquetas de la superficie con una resolución espacio-temporal de alta permite cantidades cinemáticas tales como cepas morfogenética (deformaciones) que se calcula en dos y tres dimensiones.

El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

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Research

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12.9K vistas.  Washington University. En este artículo se describe el etiquetado y la superficie Ovo ex Cultivo de tejidos en el embrión de pollo temprano. Técnicas susceptibles de campo de lapso de tiempo brillante, fluorescencia e imágenes de tomografía de coherencia óptica se presentan. Seguimiento de las etiquetas de la superficie con una resolución espacio-temporal de alta permite cantidades cinemáticas tales como cepas morfogenética (deformaciones) que se calcula en dos y tres di...

Video: Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensayo de inducción neural en el embrión de pollo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Transfección de células individuales en embriones de pollo

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

En electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...