Name: 비디오: Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s

저자는이 프로젝트의 지원 ThorLabs 감사하고 싶습니다. AJN은 NSF 대학원 원정대의 지원을 인정하고자합니다. 이 작품은 부분적으로 NIH 원장의 새로운 혁신 보너스 프로그램을 통해 국립 보건원, OD007096 - 01 DP2 부여 번호 1 후원했다. 새로운 혁신 보너스 프로그램에 대한 정보는에 있습니다 <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . 저자는 하버드 전자 연구실 사용에 대한 톰 헤이스 감사하고 싶습니다.

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	<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 985-985 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li><li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics.">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li><li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging.">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li><li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration.">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation.">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li><li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+(Cell-viZio)+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation.">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li><li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+confocal+laser+endomicroscopy.">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li><li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy.">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li><li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li></ol>

이 비디오이 비디오 생산은 Thorlabs 주식 회사가 후원했습니다

이 비디오 속도 이미징 시스템은 약 8 kHz에서에서 공진 갈바 노 미러 작동을 사용합니다. 최대 전력으로 실행하면 공진 거울은 아주 크게 될 수 있으며, 높은 피치는 충분한 노출 시간 귀찮은 심지어 위험할 수 있습니다. 여기 증명하지지만, 그것은 상당히 시스템 볼륨 및 / 또는 귀마개 적절한 청력 보호 장비를 착용을 줄이기 위해 투명 케이스 내부의 공진 갈바 노 미러를 방어막을 권장합니다. 공진 갈바 노 미러는 sinusoidal 패턴에서 검색합니다. 그러나, framegrabber 카드 신호가 수평 및 수직 방향 모두에서 완전히 선형 스위프 속도를 가정에 참조하십시오. sinusoidal 청소는 검사의 가장자리에 속도가 느려집니다 때문에, 이미지 압축 아티팩트가 빠른 (가로) 이미지 축을 따라 볼 수 있습니다. 이 문제를 최소화하기 위해 한 가지 방법은 의도적으로 공진 갈보 미러 스캔 범위를 드라이브보다 훨씬 큰릴레이 렌즈 직경. 이렇게에서 sinusoidal 스캔 패턴은 거의 선형 스위프 중앙 이​​미지 왜곡을 최소화, 샘플을 트래버스합니다. 또 다른 방법은 빠른 축을 linearize에 게시 프로세스 이미지 수집하는 것입니다. 이것은 이미지로 알려진 형광 패턴 (예 : 격자 등) 완성하고 수집된 이미지를 unwarps 처리 스크립트를 만들 수있는 알려진 패턴 크기를 사용하실 수 있습니다. 이 특정 스캔 시스템은 종종 수직 지향 비디오 속도 현미경을 필요로 생체내 이미징에의 목적을 위해 설계되었습니다. 세포 이미징 실험을 위해, 거꾸로 현미경 더 일반적으로 사용됩니다. 여기에 제시 디자인은 쉽게 그러한 거꾸로 현미경을 구축하기 위해 변경할 수 있으며 필요하다는 것을 모두가 마지막 2 &quot;직경 미러의 회전이다. 대신 아래 스캔 광선을 직접하기 위해 거울을 orienting의 거울 위쪽으로 광선을 직접하실 수 있습니다. 목적 렌즈 배치t 샘플 무대와 함께 미러에서 동일한 거리는 반전 도형에 이미지를 허용합니다. 이미징 시스템 microendoscopic 이미징에 대해 전적으로 건설하는 경우, 전혀 수직 현미경의 디자인을 &quot;접는&quot;이유가 없습니다. 대신, 전체 검사 시스템은 광학 테이블에 객관적인 렌즈 지향 병렬로 단일 수평 브레드 보드에 만들 수 있습니다. 이것은 대부분의 상용 공촛점 현미경에서 찾을 수로보다 다양한 시스템을 desiring 사용자가 변수 핀홀를 통합하는 것이 좋습니다, 그 위대한 빌드 단순과 정렬의 편의를 위해 제공하고 있지만,이 빌드의 현미경은 고정 핀홀 구성을 사용합니다. 사용자가 방출 강도 변화의 샘플을 보완할 수있는 핀홀의 크기를 조정할 수 있도록함으로써, 이것은 사용자가 더 주어진 샘플에 대한 신호 강도와 해결 사이의 거래와를 최적화 할 수 있습니다. 채널현미경에 대해 선택한 이미지 섬유 oice은 중요하다. 우리가 그들의 가까운 섬유 코어 간격과 낮은 상대 autofluorescence로 인해 스미토모 일관된 이미지 섬유를 사용하는 것이 좋습니다. Fujikura 제조한 이미지 섬유 샘플에서 약한 형광 신호를 압도하고 microendoscope의 궁극적인 감도를 제한할 수 있습니다 autofluorescence 10 높은 금액을 가지고 발견되었습니다. 이와 특별한 설정에 사용되는 8 - 30N으로 스미토모 제조 섬유, 자신의 Fujikura 등가물보다 훨씬 낮은 수준 autofluorescence 있습니다. leeched 섬유 번들이 microendoscopy에 대한 매력적인 것으로 간주 수도 있지만, 그들의 디자인은 일반적으로 섬유 코어 띄엄띄엄 샘플 개체, 잠재적인 이익의 상당 지역을 떠나는 것을 의미합니다 너무 멀리 떨어져 각각의 광섬유 코어를 배치합니다. 마지막으로, 그것은 현미경 여기서 설명하는 동안 체외 및 생체내 applicati의 다양한 유용하게 사용될 수 있다고 지적한다기능하며 완벽한 기능을 갖춘 상용 시스템의 비용의 일부에 대해 만들 수 있습니다, 그것은 전송 빛 감지, 볼 접안 렌즈, 또는 비 공촛점 widefield epifluorescence에 대한 빔 경로 같은 기능을 가지고 있지 않습니다. 그것이 처음부터 이러한 기능을 가진 시스템을 구축 할 수 있지만, 그러한 시스템을 desiring 독자들의 요구를 충족보다는 완전히 새로운 빌드 시작하는 기존의 상용 시스템을 수정하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 부품 이름 </td><td> 제조 업체 </td><td> 항목 번호 </td><td> 사양 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 515 NM 밴드 패스 필터 </td><td> 채도 </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 수색 성의 이중어 렌즈 25.4mm의 디아. X 50mm FL, MgF2 코팅 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> NT49 - 766 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 수색 성의 이중어 렌즈 25.4mm의 디아. X 76.2mm FL, MgF2 코팅 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> NT49 - 768 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 수색 성의 이중어 렌즈 25.4mm의 디아. X 88.9mm FL, MgF2 코팅 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> NT49 - 769 </td><td></td><td> 이 </td></tr><tr><td> 수색 성의 이중어 렌즈 50mm 디아. X 300mm FL, MgF2 코팅 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> NT45 - 179 </tD&gt; <td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 8 kHz에서 R은 고주파 광 스캐너 </td><td> 전기 광학 제품 공사 (EOPC) </td><td> SC - 30 </td><td> 8 kHz에서 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> AGC 드라이버 </td><td> 전기 광학 제품 공사 (EOPC) </td><td> ACG : 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422 - PA Photosensor 모듈 </td><td> 하마 마츠 </td><td> H7422 - PA </td><td> 현재 권장 제한 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> M9012 전원 공급 장치 </td><td> 하마 마츠 </td><td> M9012 </td><td> H7422 - PA와 함께 사용하기위한 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS 목표 </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> Solios EA / XA Framegrabber 카드 </td><td> 에서 Matrox </td><td> Solios EA / XA </td><td> MIL 소프트웨어 필요; OEM 권장 인터커넥트 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 12V 전원 공급 </td><tD&gt; Meanwell </td><td> LPV - 100-12 </td><td> +12 V, 8.5A </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 배 현미경 목표 렌즈 </td><td> 뉴 포트 </td><td> M - 5 배 </td><td> 0.10 NA, 25.4 mm 초점 거리 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 코히어런트 이미지 섬유 </td><td> 스미토모 </td><td> 8 - 30N </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 캡 스크류 및 하드웨어 키트 </td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT2 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 100 μm의가 핀홀을 탑재 </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td> 공간 필터를 건물에 적합 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 30mm의 케이지 큐브 클램프 </td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 30mm의 케이지 시스템 큐브, 4 웨이 </td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 406 NM, 5 MW, B 핀 코드, SM 섬유 Pigtailed 레이저 다이오드, FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS - 406 - FC </td><td> 오래된 제품, LP405 - SF10로 대체 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 5 분 에폭시, 1 온스 </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 6 축 운동학 광학 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 8-32 모자 스크류 및 하드웨어 키트 </td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT1 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 8-32 Setscrew 및 하드웨어 키트 </td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT3 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 외부 RMS 스레드와 내부 SM1의 스레드와 어댑터 </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 형용사. FC / PC와 FC / APC 콜리 메 이터, F = 2.0 mm, ARC : 400-600 NM </td><td> ThorLabs </td><td> CFC - 2X - A </td><td> F = 2.0 mm </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 조정 광섬유 콜리 메 이터 어댑터, 스레드 SM1 </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 알루미늄 브레드 보드, 12 &quot;X 18&quot;X 1 / 2 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20은 스레드 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> Benchtop 레이저 다이오드 / TEC 컨트롤러 </td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 일 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm의 긴 패스 이색성 거울 </td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;광학에 대한 운동학 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> ThorLabs 섬유 - Pigtailed 레이저 다이오드에 대한 LD / TEC 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> Ø18 mm 광학 렌즈 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td> 한 유지 링 포함 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 2 &quot;광학 렌즈 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td> 리테이너 링 포함, 내부 및 외부 스레딩과 함께 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 미니 시리즈 케이지 어셈블리로드, 6 &quot;길고 Ø4 mm, 수량 1. </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;받침대 기둥 포스트, 동경 8-32 탭, 1&quot;롱 </td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;기둥 포스트 확장, 길이 = 0.5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;기둥 포스트 확장, 길이 = 0.75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;보호된 실버 미러, 두꺼운 3.2 mm </td><td> ThorLabs </td><td> ME1 - P01 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 회전 조절 초점 요소, L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </tD&gt; <td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> O2 &quot;보호된 실버 미러, 두꺼운 3.2 mm </td><td> ThorLabs </td><td> ME2 - P01 </td><td></td><td> 이 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 μm의가 핀홀을 탑재 </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 폴라리스 낮은 드리프트 Ø1 &quot;동적 미러 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> 폴라리스 - K1 </td><td> 낮은 드리프트 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> SM1 렌즈 튜브, L = 1 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L - 10 </td><td> 한 유지 링 포함 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 스레드 30mm의 케이지 플레이트, 0.35 &quot;두꺼운 </td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 이 </td></tr><tr><td> SM1에 M25 광학 구성 요소 스레딩 어댑터 </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td> 외부 SM1 스레드와 내부 M25.5x0.5 스레드 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 소형 빔 Diameter 갈보 시스템 </td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> 작은 클램핑 포크 </td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 25분의 1 &quot;은 보편를 슬롯 counterbored </td><td> 15 </td></tr><tr><td> 공간 필터 시스템 </td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td> 핀홀은 별도 판매 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 5.6 &amp; 9mm 레이저에 대한 TE - 냉각 마운트 </td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 일 </td></tr><tr><td> Breadboards에 대한 수직 브라켓 </td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td> 각각의 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 계획 - 고차 색지움 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 일 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

공촛점 현미경은 빠르게, 높은 감도, 복잡한 시스템의 고해상도 광학 sectioning을 지원, 생물학과 생물 의학 과학에서 귀중한 도구가되고있다. 공촛점 현미경은 정기적으로 세포 2-4 생활에서 특정 세포 목표 1, 모니터 역학을 공부하고, 전체 생물 5,6의 입체 진화를 시각화하는, 예를 들어, 사용됩니다. 같은 공촛점 microendoscopes 같은 공촛점 이미징 시스템의 확장은 생체내 7 고해상도 이미징을 허용하고 현재 임상 설정 8,9에서 질병 이미징 및 진단에 적용되고있다. 공촛점 현미경은 간단한 기하학적 광학를 사용하여 소위 &quot;광학 섹션&quot;을 만들어 입체적인 해상도를 제공합니다. 표준 넓은 필드 현미경에서는 시료에서 발생하는 형광는 객관적인 렌즈에 의해 수집되고 검출기에 직접 전달. 수락 동안영상 얇은 샘플 수, 두꺼운 샘플은 객관적 초점 비행기 위 아래에 생성된 형광에 의해 흐려된다. 대조적으로, 공촛점 현미경은 거부하고, 샘플을 가상, 광학 sectioning 수 밖 초점 샘플 고해상도 입체 표현을 빌드하는 빛을. 공촛점 현미경은 검출 빔 경로에 공촛점 조리개를 사용하여이 위업을 달성. 목적으로 샘플의 수집 형광은 스캐닝 미러 통해 기본 이색성 거울, 조심스럽게 이상 스톡스 - 이동 형광 방출을 통과하는 동안에는 레이저 여기 빔과 같은 짧은 파장을 반영하기 위해 선택한 거울을 통해 다시 릴레이입니다. 이 긴 파장 형광 신호는 다음 목적 렌즈의 초점 비행기와 정확하게 활용 비행기에 위치하는 핀홀의 양쪽에 렌즈 한 켤레에 전달됩니다. 객체의 초점 볼륨에서 수집 광자는 collimated 아르객관적인 렌즈로하며 핀홀을 통해 공촛점 렌즈에 의해 초점이 있습니다. 초점 평면 위나 아래에 생성된 형광 따라서 제대로 collimated되지 않습니다, 그리고 현미경 초점에서 단 표시등이 표시되는 광학 섹션을 만들고, 공촛점 핀홀 하나 통과되지 않습니다. (그림 1). 따라서 핀홀 효과적으로 한 제한된 공간 위치 감지 방출 confining, 초점 비행기에서 가상 조리개 역할을합니다. 현대 상업 공촛점 현미경은 비교적 간단하고 접근 이전에 복잡한 이미징 절차를 만드는 사용자에게 완전 자동화된 작업을 제공합니다. 이러한 시스템의 유연성과 전력에도 불구하고, 상업 공촛점 현미경 잘 같은 생체내 이미징 애플 리케이션에서 많은 같은 모든 공촛점 이미징 작업에 적합하지 않습니다. 그들의 요구를 충족하기 위해 맞춤형 이미징 시스템을 만들 수있는 능력이 없다면, 중요한 실험 reac 밖으로 남아있을 수많은 과학자에 H. 이 문서에서는, 우리는 기본 구성 요소에서 사용자 지정, 비디오 속도 공촛점 이미징 시스템의 전체 구조에 대한 단계별 방법을 제공합니다. 직립 현미경은 표준 속도 공진 갈바 노 미러 느린 축 스캔되지만, 빠른 스캔 축을 제공하기 위해 공진 갈바 노 미러를 사용하여 구축됩니다. 목적 렌즈 초점이 정확한 스캔 빔을 만들려면 다음과 거울 네 개의 릴레이 렌즈를 사용하여 소위 telecentric 비행기에 위치합니다. 공촛점 감지는 표준 재고품 photomultiplier 튜브 (PMT)를 사용하여 달성되며, 이미지 캡처와에서 Matrox의 framegrabber 카드 및 포함된 소프트웨어를 사용하여 표시됩니다.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

사용자 정의, 실시간 공촛점 스캐닝 이미징 시스템의 전체 구조는 설명합니다. 쉽게 동영상 속도 현미경 및 microendoscopy 사용할 수있는이 시스템은, 비용의 일부로 표준 상용 공촛점 시스템을 사용하여 액세스할 수 없습니다 이미징 형상 및 응용 프로그램의 배열을 허용합니다.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.7K 조회수.  Harvard University. 사용자 정의, 실시간 공촛점 스캐닝 이미징 시스템의 전체 구조는 설명합니다. 쉽게 동영상 속도 현미경 및 microendoscopy 사용할 수있는이 시스템은, 비용의 일부로 표준 상용 공촛점 시스템을 사용하여 액세스할 수 없습니다 이미징 형상 및 응용 프로그램의 배열을 허용합니다.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

연구

생체공학

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture cellular behaviors involved in developmental processes.&#160; The ability to track and follow cell movements is limited by sample movements that occur due to drift of the sample or, in some cases, growth during image acquisition. Tracking cells in datasets affected by drift and/or growth will incorporate these movements into any analysis of cell position. This may result in the apparent movement of static structures within the sample. Therefore prior to cell tracking, any sample drift should be corrected. Using the open source Fiji distribution 1 &#160;of ImageJ 2,3 and the incorporated LOCI tools 4, we developed the Correct 3D drift plug-in to remove erroneous sample movement in confocal datasets. This protocol effectively compensates for sample translation or alterations in focal position by utilizing phase correlation to register each time-point of a four-dimensional confocal datasets while maintaining the ability to visualize and measure cell movements over extended time-lapse experiments.

Time-lapse microscopy allows the visualization of developmental processes. Growth or drift of samples during image acquisition reduces the ability to accurately follow and measure cell movements during development. We describe the use of open source image processing software to correct for three dimensional sample drift over time.

4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 다음 샘플 편차 수정

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

멀티 모달 이미징 및 비 침습적에 대한 분광학 섬유 다발 Microendoscopy 플랫폼,<em&gt; 생체</em&gt; 조직 분석

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

음경 골의 해부, MicroCT 스캔 및 형태 학적 분석

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. Unfortunately, many researchers spend large amounts of time and resources developing and optimizing workflows that are only relevant to their own experiments. In this article, we describe a protocol that can be used by those with access to a widefield high-content analysis system (WHCAS) to image any slide-mounted tissue, with options for customization within pre-built modules found in the associated software. Not originally intended for slide scanning, the steps detailed in this article make it possible to acquire slide scanning images in the WHCAS which can be imported into the associated software. In this example, the automated segmentation of brain tumor slides is demonstrated, but the automated segmentation of any fluorescently-labeled nuclear or cytoplasmic marker is possible. Furthermore, there are a variety of other quantitative software modules including assays for protein localization/translocation, cellular proliferation/viability/apoptosis, and angiogenesis that can be run. This technique will save researchers time and effort and create an automated protocol for slide analysis.

Here we describe a protocol for the automated segmentation of fluorescently labeled tissues on slides using a widefield high-content analysis system (WHCAS). This protocol has wide-ranging applications in any field which involves the quantitation of fluorescent markers in biological tissues including the biological sciences, medical engineering, and health sciences.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big challenge with the state-of-the-art retinal imaging modalities because they would require z-stacking to compile a volumetric dataset. Newer optical coherence tomography (OCT) and OCT angiography (OCTA) systems overcome these restrictions to provide three-dimensional (3D) anatomical and vascular images, but the dye-free nature of OCT cannot visualize leakage indicative of vascular dysfunction. This protocol describes a novel oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO) technique that provides 3D volumetric fluorescence retinal imaging. The setup of the imaging system generates the oblique scanning by a dove tail slider and aligns the final imaging system at an angle to detect fluorescent cross-sectional images. The system uses the laser scanning method, and therefore, allows an easy incorporation of OCT as a complementary volumetric structural imaging modality. In vivo imaging on rat retina is demonstrated here. Fluorescein solution is intravenously injected to produce volumetric fluorescein angiography (vFA).

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Here, we present a protocol to get a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence and OCT retinal image by using a novel imaging multimodal platform. We will introduce the system setup, the method of alignment, and the operational protocols. In vivo imaging will be demonstrated, and representative results will be provided.

복합 체적 망막 이미징 오블리크 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy (오슬로) 및 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...