Name: Video: Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s

Gli autori desiderano ringraziare Thorlabs per il loro sostegno di questo progetto. AJN desidera ringraziare per il supporto di una Graduate Fellowship NSF. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Institutes of Health tramite il programma New Innovator il direttore NIH Award, il numero di sovvenzione 1 DP2 OD007096-01. Informazioni sul nuovo programma Innovator Award è a <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . Gli autori desiderano ringraziare Tom Hayes per l&#39;uso del laboratorio di Elettronica di Harvard.

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La produzione di questo video-questo video è stato sponsorizzato da Thorlabs, Inc.

Questo video-rate sistema di imaging si avvale di un sistema operativo risonante specchio galvanometrica a circa 8 kHz. Specchi di risonanza può essere molto forte quando viene eseguito a piena potenza, e il loro tono alto può essere fastidioso o addirittura pericolose, a volte l&#39;esposizione sufficiente. Anche se non dimostrato qui, si raccomanda di proteggere lo specchio di risonanza galvanometrico all&#39;interno di una custodia trasparente per ridurre significativamente il volume di sistema e / o di indossare attrezzature di protezione dell&#39;udito adeguati, come i tappi per le orecchie. Lo specchio di risonanza galvanometrico scansioni in un andamento sinusoidale. Tuttavia, le schede framegrabber letto segnale assumendo un tasso di scansione completamente lineare in entrambe le direzioni orizzontale e verticale. Dal momento che uno sweep sinusoidale rallenta ai bordi della scansione, gli artefatti di compressione delle immagini si può osservare lungo il digiuno (orizzontale) dell&#39;immagine. Un modo per minimizzare questo problema è quello di guidare volutamente la risonanza gamma specchio galvo scansione significativamente più grandi dellente diametro relè. In questo modo, solo lo sweep quasi lineare centrale del pattern di scansione sinusoidale attraverserà il campione, riducendo al minimo le distorsioni di immagine. Un altro approccio sarebbe quello di post-elaborazione delle immagini raccolte per linearizzare l&#39;asse veloce. Questo può essere ottenuto attraverso l&#39;immagine un modello conosciuto fluorescente (come ad esempio una griglia) e utilizzando il modello di dimensioni conosciute per creare uno script di elaborazione che unwarps le immagini raccolte. Questo sistema di scansione particolare è stato progettato allo scopo di imaging in vivo, che spesso richiede un montante orientati video-tasso microscopio. Per gli esperimenti di imaging cellulare, microscopi invertiti sono più tipicamente usato. Il progetto qui presentato può essere facilmente modificato per costruire un simile microscopio invertito, tutto ciò che serve è una rotazione della finale &quot;specchio 2 di diametro. Invece di orientare lo specchio per dirigere il fascio di scansione verso il basso, lo specchio può dirigere il raggio verso l&#39;alto. Ponendo la lente obiettivat la stessa distanza dallo specchio insieme a uno stadio campione permetterebbe di imaging in una geometria invertita. Se il sistema di imaging è stato costruito esclusivamente per l&#39;imaging microendoscopica, non vi è alcuna ragione di &quot;piegare&quot; la progettazione microscopio verticale a tutti. Invece, il sistema di scansione intero può essere costruito su una basetta singola orizzontale con il parallelo obiettivo obiettivo orientato al tavolo ottico. Si noti che il microscopio in questa build utilizza una configurazione fissa a foro stenopeico, mentre questa prevede la massima semplicità e facilità di costruire l&#39;allineamento, gli utenti che desiderano un sistema più versatile potrebbe prendere in considerazione che incorpora un foro stenopeico variabile, come si possono trovare in microscopi confocale più commerciale. Consentendo all&#39;utente di regolare le dimensioni del foro stenopeico per compensare i campioni di varia intensità di emissione, questo permette all&#39;utente di ottimizzare al meglio il compromesso tra potenza del segnale e la risoluzione di un dato campione. ChOICE di fibra dell&#39;immagine selezionata per il microscopio è importante. Si consiglia di utilizzare fibre un&#39;immagine coerente Sumitomo a causa della loro distanza chiudere nucleo della fibra e basso autofluorescenza relativa. Fibre di immagine prodotto da Fujikura sono stati trovati per avere elevate quantità di autofluorescenza 10, che può sopraffare deboli segnali di fluorescenza da un campione e limitare la sensibilità finale del microendoscope. Sumitomo fibre prodotte, come la 8-30N utilizzato in questa configurazione particolare, hanno molto più bassi livelli di autofluorescenza rispetto ai loro equivalenti Fujikura. Mentre fasci di fibre leeched potrebbe essere considerato attraente per microendoscopy, il loro design luoghi tipicamente core singola fibra troppo distanti, il che significa che i nuclei delle fibre scarsamente oggetti campione, lasciando le regioni significative di potenziale interesse. Infine, va notato che, mentre il microscopio qui descritti saranno utili in una varietà di in vitro e in vivo applions e può essere creato per una frazione del costo di un completo sistema commerciale, non ha caratteristiche come il rilevamento luce trasmessa, un oculare per la visualizzazione, o di un percorso del fascio per non confocale widefield epifluorescenza. Mentre è possibile costruire un sistema con queste caratteristiche da zero, i lettori che desiderano un sistema del genere potrebbe voler modificare un sistema commerciale esistente per soddisfare le loro esigenze, piuttosto che avviare una costruzione completamente nuova.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome parte </td><td> Fabbricante </td><td> Item Number </td><td> Specificazioni </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> 515 nm filtro passa-banda </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromatico Doublet Dia Lens 25,4 mm. FL x 50 mm, rivestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromatico Doublet Dia Lens 25,4 mm. FL x 76,2 millimetri, rivestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromatico Doublet Dia Lens 25,4 mm. FL x 88,9 millimetri, rivestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Obiettivo acromatico Dia Doublet 50mm. FL x 300 mm, rivestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz R scanner ad alta frequenza ottica </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGC driver </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA fotosensore modulo </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Limitazione di corrente raccomandato </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Alimentazione </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Per l&#39;utilizzo con H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO Obiettivo CS </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios EA / XA Framegrabber Carta </td><td> Matrox </td><td> Solios EA / XA </td><td> MIL software necessario; OEM interconnessioni raccomandato </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Alimentazione 12V </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> +12 V, 8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5x Microscope Lens Obiettivo </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> 0,10 NA, Lunghezza focale 25,4 millimetri </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Immagine fibra Coherent </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 Vite e Kit Hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 micron montati Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td> Ideale per la costruzione di filtri spaziali </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 millimetri Cage Clamp Cubo </td><td> Thorlabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 millimetri di sistema Cubo Cage, 4-Way </td><td> Thorlabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, 5 mW, B Pin Code, fibra SM Pigtailed diodo laser, FC / PC </td><td> Thorlabs </td><td> LPS-406-FC </td><td> Prodotto obsoleto, sostituita dalla LP405-SF10 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5-Minute Epoxy, 1 oncia </td><td> Thorlabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 assi cinematica ottica Monte </td><td> Thorlabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Vite e Kit Hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Vite di fermo e Kit Hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adattatore con esterno e interno RMS Discussioni Discussioni SM1 </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Agg. FC / PC e FC / APC collimatore, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> Thorlabs </td><td> CFC-2X-A </td><td> f = 2,0 millimetri </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Regolabile collimatore Adapter Fiber, filettato SM1 </td><td> Thorlabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Breadboard in alluminio, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 Threaded </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Diodo laser da banco / TEC controller </td><td> Thorlabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm a lungo Passo specchio dicroico </td><td> Thorlabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Monte cinematica per Ø1 &quot;Ottica </td><td> Thorlabs </td><td> Km100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC monte per Thorlabs fibra Pigtailed Diodi laser </td><td> Thorlabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Attacco obiettivo di Ø18 millimetro Ottica </td><td> Thorlabs </td><td> LMR18 </td><td> Un anello di fissaggio inclusa </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Supporti Lens per 2 &quot;Optics </td><td> Thorlabs </td><td> LMR2S </td><td> Con filettatura interna ed esterna; anello di fermo incluso </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini Serie Cage Assemblea Rod, 6 &quot;Long, mm Ø4, Qty 1. </td><td> Thorlabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Post Pilastro piedistallo, 8-32 Taps, 1&quot; Long </td><td> Thorlabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Post Pilastro estensione, lunghezza = 0,5 </td><td> Thorlabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pillar Messaggio estensione, lunghezza = 0,75&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm di spessore </td><td> Thorlabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 rotante Elemento di messa a fuoco regolabile, L = 1&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø2 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm di spessore </td><td> Thorlabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 micron montati Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris bassa deriva Ø1 &quot;cinematica Specchio Monte </td><td> Thorlabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Bassa deriva </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 Lens Tube, L = 1 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Un anello di fissaggio inclusa </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 Cage piastra filettata 30 mm, 0,35 &quot;Thick </td><td> Thorlabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 a M25 adattatore Component ottica Threading </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A24 </td><td> Discussioni SM1 esterno e interno M25.5x0.5 Discussioni </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Larghezza Diam piccolieter galvanometrica sistema </td><td> Thorlabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Piccola Forcella di serraggio </td><td> Thorlabs </td><td> CF125 </td><td> 1 / 25 &quot;svasati slot, universale </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Spaziale Filter System </td><td> Thorlabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole venduto separatamente </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-raffreddato monte per 5,6 e 9 Laser millimetri </td><td> Thorlabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Supporto verticale per Circuiti sperimentali </td><td> Thorlabs </td><td> VB01 </td><td> Ogni </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

Microscopia confocale è diventato uno strumento prezioso nel campo della biologia e delle scienze biomediche, consentendo una rapida, ad alta sensibilità, e ad alta risoluzione sezionamento ottico di sistemi complessi. Microscopia confocale è abitualmente usato, per esempio, per studiare specifici obiettivi cellulari 1, dinamiche monitor in cellule viventi 2-4, e visualizzare l&#39;evoluzione tridimensionale di interi organismi 5,6. Estensioni di sistemi di imaging confocale, come microendoscopes confocale, permettono di imaging ad alta risoluzione in vivo 7 e vengono attualmente impiegati per l&#39;imaging della malattia e la diagnosi in ambito clinico 8,9. Microscopia confocale offre tridimensionale risoluzione con la creazione di cosiddette &quot;sezioni ottiche&quot; utilizzando semplici ottica geometrica. In uno standard a largo campo microscopio a fluorescenza generata da un campione viene raccolto da una lente obiettivo e trasmesso direttamente ad un rivelatore. Anche se accettareper i campioni in grado di imaging sottili, campioni di spessore si confondono con fluorescenza generata sopra e sotto il piano focale dell&#39;obiettivo. Al contrario, la microscopia confocale permette virtuale, il sezionamento ottico di campioni, rifiutando out-of-focus luce ad alta risoluzione per costruire rappresentazioni tridimensionali di campioni. Microscopio confocale realizzare questa impresa utilizzando un&#39;apertura confocale nel percorso ottico di rilevamento. La fluorescenza raccolti da un campione l&#39;obiettivo è inoltrati attraverso gli specchi di scansione e attraverso lo specchio dicroico primario, uno specchio accuratamente selezionati per riflettere lunghezze d&#39;onda minori, come il raggio laser di eccitazione durante il passaggio lungo la, Stokes in differita emissione di fluorescenza. Questa lunghezza d&#39;onda del segnale di fluorescenza viene quindi passata a un paio di lenti su entrambi i lati di un foro che è posizionato in un aereo esattamente coniugato con il piano focale della lente obiettiva. Fotoni raccolti dal volume focale dell&#39;oggetto sono collimatidalla lente dell&#39;obiettivo e sono concentrati dalle lenti confocale attraverso il foro stenopeico. Fluorescenza generata sopra o sotto il piano focale quindi non sarà adeguatamente collimato, e non passare attraverso il foro stenopeico confocale 1, la creazione di una sezione ottica in cui solo la luce dal fuoco microscopio è visibile. (Fig. 1). Così il pinhole agisce effettivamente come un&#39;apertura virtuale al piano focale, limitando l&#39;emissione rilevato a una sola posizione spaziale limitata. Moderni microscopi confocale commerciali offrire agli utenti il ​​funzionamento completamente automatico, rendendo complesse procedure di imaging in precedenza relativamente semplice e accessibile. Nonostante la flessibilità e la potenza di questi sistemi, commerciali microscopi confocale non sono adatti per tutte le attività di imaging confocale, come molte applicazioni di imaging in vivo. Senza la possibilità di creare sistemi di imaging personalizzati per soddisfare le loro esigenze, importanti esperimenti può rimanere fuori dalla reazioneh per molti scienziati. In questo articolo forniamo un passo-passo metodo per la costruzione completa di una consuetudine, video-rate sistema di imaging confocale da componenti di base. Il microscopio verticale sarà costruito utilizzando uno specchio risonante galvanometrico per fornire l&#39;asse veloce di scansione, mentre un normale specchio velocità di risonanza galvanometrico analizzerà l&#39;asse lento. Per creare un fascio preciso nella scansione la messa a fuoco dell&#39;obiettivo, questi specchi verranno posizionati gli aerei telecentrica cosiddetto con quattro lenti relè. Rilevazione confocale sarà realizzato utilizzando uno standard, off-the-shelf tubo fotomoltiplicatore (PMT), e le immagini saranno catturati e visualizzati utilizzando una scheda Matrox framegrabber e il software incluso.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

La costruzione completa di una consuetudine, in tempo reale del sistema di imaging confocale scansione è descritto. Questo sistema, che può essere facilmente utilizzato per il video-rate microscopia e microendoscopy, consente una vasta gamma di geometrie e le applicazioni di imaging non accessibili utilizzando le normali sistemi commerciali confocale, ad una frazione del costo.

Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

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