Diese Arbeit wurde durch ein Wellcome Project Grant (078043/Z/05/Z) an ROJW unterstützt

TEIL A: High-throughput Wachstum von Bakterienkulturen. Ein. Bakterien wachsen Übernachtung in 2 ml Autoinduktion Medium mit 24-well Platten <ol><li> Sterilisieren die 24-Well-Platten durch Mikrowelle. </li><li> Beimpfen 1,5 ml Autoinduktion Medium (Overnight Express Medium) mit frisch gewachsenen Bakterienkolonien oder gefroren Glycerin Aktien. Wir normalerweise impfen drei Vertiefungen pro Mutante mit drei einzelnen geklonten Kolonien. Reserve sechs Vertiefungen für positive und negative Kontrollen. Für den positiven Kontrollen wir aufwachsen drei Wildtyp-Klonen und für den negativen Kontrollen wir aufwachsen 2 Klone, die mit einem nicht-exprimierenden Plasmid transformiert wurden. Achten Sie auf ausreichende Sterilisation der Platte, indem Sie ein gut Zuschnitt für die mittel-only Kontrolle. </li><li> Wachsen die Zellen für 18 Stunden bei 37 ° C und unter Schütteln bei 250 Upm. Wir verwenden lac-induzierbaren BL21 (DE3) Rosetta 2-Zellen. Autoinduktion Medium eine Mischung aus Glucose und Lactose. Die Bakterien zunächsternähren Glukose und dann beginnen, Laktose, die auch induziert die Expression der rekombinanten Proteine ​​zu verwenden. </li><li> Entfernen Sie den Deckel und legen Sie die Platte auf der Roboter-Plattform. </li></ol> TEIL B: Robotic Aufreinigung von rekombinanten Proteinen. 2. Bereiten Sie die Robotic Platform <ol><li> Bilden die Waschpuffer, bestehend aus 20 mM Imidazol, 0.1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% Glycerin, und der Elutionspuffer, bestehend 0,5 M Imidazol, 0.1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% Glycerol. Diese Puffer wird verwendet, um die Perlen zu waschen, nachdem die markierten Proteine, um sie gebunden worden sein, oder, um die Proteine ​​von den Kügelchen eluiert bzw. werden. </li><li> Make-up die bakterielle Verdünnungsmittel (100 ml destilliertem Wasser mit 15 ul Entschäumer Reagenz). Diese Lösung wird verwendetVerdünnungen der bakteriellen Übernacht-Kulturen für die optische Dichte (A600) Messungen durchzuführen. Die Anwesenheit von Antischaummittel in dem Verdünnungsmittel verhindert die Bildung von Luftblasen, die mit den Plattenleser Messungen stören würde. </li><li> Make-up die Lyse-Lösung, bestehend aus 10x FastBreak Reagenz, 2 ul lysonase pro Probe und 15 mM MgOAc 2. FastBreak enthält eine Mischung aus Reinigungsmittel und Salze, die die bakterielle Zellwände brechen und erleichtern die Freisetzung von intrazellulären Proteinen. Lysonase ist eine proprietäre Mischung aus Lysozym und einer Nuclease. Lysozym hilft bei Aufbrechen der Zellwand und der Nuklease verdaut die Freigabe bakteriellen Nukleinsäuren. </li><li> Optional: Stellen Sie eine 6 M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung. Einige rekombinante Proteine ​​neigen dazu, den Teflon-beschichteten Pipettiernadeln kleben. Die Guanidin-Hydrochlorid-Lösung denaturiert Proteine ​​und wäscht sie ab effektiver als Wasser, die routinemäßig verwendet wird, um die waschbare Roboter Pipettenspitzen gründlich nach jeder Rundeep. </li><li> Vorbereiten des BCA (Bicinchoninsäure) Proteinquantifizierung Reagenz durch Mischen Bicinchoninsäure Lösung (Reaktionsmittel A) und dem Kupfersulfatlösung (Reagenz B): Peptid-Bindungen zu reduzieren Cu 2 + von dem CuSO 4 Komponente in dem BCA-Reagens zu Cu 1 + wobei die Menge an Cu 1 + ist proportional der Zahl der Peptidbindungen in der Lösung vorliegen. In einem zweiten Schritt, zwei Moleküle Bicinchoninsäure Chelat Cu 1 +, was zu einer Verschiebung Absorption bis 562 nm, was eine violette Farbe. Die Farbreaktion ist zeitabhängig und muss in der Regel mehrere Stunden, um endgültig. Danach ist die Farbe für mehrere Stunden stabil. </li><li> Füllen Mulden oder Platten in der richtigen Größe und legen Sie sie in ihrer vorab zugewiesene Positionen auf der Roboter-Plattform. </li><li> Stellen Sie einen 24-Well-Platte für die Guanidinhydrochlorid Abfälle zwei klaren 96-Well-Platten für OD 600 und Extinktionsmessungen und einem blauen 96-Well-Platte für the gereinigte Proteine ​​auf ihren Positionen auf der Plattform. Legen Sie eine 96-Deepwell Platte auf dem Magnetfuß. </li><li> Verdünnte MagneHis Ni-Teilchen, die durch Bilden Proteine ​​binden Chelate mit ihren His-Tags 5-fach mit destilliertem Wasser und füllt sie in die Wulst-Rührwerk. Schalten Sie den Rührer auf die Perlen in der Schwebe zu halten. </li><li> Schalten Sie den Roboter-Plattform und bündig die Pipettiernadeln für einige Minuten, um Luftblasen, die sonst mit dem Pipettiergenauigkeit stören würden entfernen. Die wieder verwendbaren Pipettieren Nadeln zwischen einzelnen Pipettierschritte gespült. Alternativ könnte Einwegpipetten verwendet werden. Alle weiteren Schritte werden maschinell durchgeführt. Die Roboter-Protokoll ist auf Anfrage erhältlich. </li></ol> 3. Zellwachstum durch Messung der OD600 überprüft <ol><li> 10 ul-Nacht-Kultur wird in 90 ul Verdünnungsmittel verdünnt. </li><li> Messung der OD 600 um sicherzustellen, dass die Bakterien auf ähnliche Dichten herangewachsen(Abbildung 1). </li></ol> 4. Die Zellen werden die Proteine ​​lösen und auf Zulassen gebrochener Wulst-binding <ol><li> 100 ul magnetischen Ni-Kügelchen-Suspension wird in jede Vertiefung einer zweiten Platte mit 24 Vertiefungen verteilt. </li><li> 900 ul jeder kleinräumige Bakterienkultur wird in die 24-Well-Platte mit den Kügelchen überführt. Fügen Sie 100 ul der 10x FastBreak / lysonase Mix. </li><li> Die 24-Well-Platte ist an der Schüttelplattform für schnelle Schütteln (800 UpM) für 30 Minuten bei Raumtemperatur überführt. Bakterielle Zellwände werden durch eine Kombination von mechanischen Kräften und chemische Wirkung und die rekombinant hergestellten Proteine ​​werden in die Lösung freigesetzt gestört. Mit ihrer Affinitätstags sie sofort binden die paramagnetische Chelat Nickel Perlen. </li></ol> 5. Die Beads werden gewaschen <ol><li> Die Zell-Lysate mit den resuspendierten magnetischen Kügelchen werden auf eine 96-Deepwell Platte, die auf einem Ständer mit m positioniert übertragenagnetische Stangen, die Folie zwischen den Brunnen. Die 96-well-Platten haben eine quadratische kegelförmigen Boden aufweist leichtere Entfernung des Überstandes erlaubt. Die Brunnen können Volumina von bis zu 2,1 ml zu halten, aber mit viel kleineren Volumen gefüllt. Dies ermöglicht uns, kräftiges Schütteln Schritte ohne Probe Kreuzkontamination durch Spritzwasser durchzuführen. </li><li> Die Pipettenspitzen werden zwischen einzelnen Pipettierschritte mit 6 M Guanidin-HCl gewaschen. Dieser Schritt ist entscheidend für die Reinigung von TFIIB und andere &quot;sticky&quot;-Proteine, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Mit anderen Proteinen kann es ausreichend sein, um die Nadeln ausgiebig mit Wasser abspülen zwischen den Pipettierschritte. </li><li> Die magnetischen Stäben des magnetischen Stand locken die paramagnetische Kügelchen, ziehen sie weg von den Zentren der Brunnen und ermöglichen dem Pipettiernadeln freien Zugang zu den Überstand. Der Überstand wird verworfen. </li><li> 500 ul Waschpuffer wird zuerst auf die 24-Well-Platte gegeben und anschließend an den 96-Well-Platte überführt, um ENsure die vollständige Übertragung der Kügelchen. Die 24-Well-Platte ist aus der Schüttler entfernt. </li><li> Weitere 500 ul Waschpuffer direkt mit dem 96-Well-Platte zugesetzt, wird die Platte auf dem Schüttler überführt und für 1 min kräftig geschüttelt. Die Platte wird zurück in den magnetischen Ständer bewegt und der Waschpuffer verworfen. </li><li> Dieser Schritt wird zweimal wiederholt und das Waschvorgang wird durch Entfernen keine Puffer Überbleibsel aus der Platte fertig. </li></ol> 6. Eluieren die Proteine ​​in Elutionspuffer <ol><li> 100 ul Elutionspuffer zu den Kügelchen zugegeben wird, wird die Platte auf dem Schüttler bewegt und kräftig für 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. </li><li> Die Platte zurück zu dem Schüttler und das Eluat bewegt, die das gereinigte rekombinante Protein, wird in eine neue Platte übertragen. </li></ol> 7. Messung der Konzentrationen des gereinigten Proteinen <ol><li> 190 ul der BCA Reagenzienmix wird zu einer deutlichen 96-well-Platte transferiert und 10 ul der ProProtein-Lösung zugegeben. </li><li> Nach mehreren Stunden Inkubation (typischerweise 5-6 oder über Nacht), die Extinktion und vergleicht sie mit BSA-Standards, um die Konzentrationen von jedem der gereinigten Protein Zubereitungen (Abbildung 2) zu bestimmen. </li><li> Die gereinigten Proteine ​​können nun für Downstream-Anwendungen in den entsprechenden Konzentrationen (Abbildung 3) verwendet werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Die Reinigung Protokoll bietet zwei Qualitätskontrolle Stufen, von denen Beispiele gezeigt. Wir sind in der Lage zu erkennen und zu dokumentieren mögliche Probleme bei der bakteriellen Wachstumsphase (Abbildung 1) und später auf die Beurteilung der Erträge des gereinigten Proteinen (Abbildung 2). Wir in der Regel zu reinigen Proteine ​​und testen sie in dreifacher Ausfertigung. Dies, in Kombination mit den beiden Qualitätskontrolle Schritte, gibt uns Vertrauen, dass jegliche Variation in unserem funktionellen Assays beobachtet aufgrund des mutierten Phänotyp sinde (Abbildung 3) und nicht durch experimentelle Variationen oder fehlgeschlagene Reinigungen verursacht. Die Ausbeuten liegen typischerweise im Bereich von 50 bis 200 ug und sind mehr als ausreichend für verschiedene funktionelle Assays. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> Abbildung 1. Histogramm der OD Messungen eines 24-Well-Platte mit Übernachtkulturen. Drei Klone sechs TFIIB mutierten Varianten sowie des Wildtyp TFIIB angezogen worden sind. Zwei Klone Durchführung einer nicht-exprimierenden Plasmid und ein gut mit Medium nur als negative Kontrollen dienen. Die OD-Messungen zeigen, dass es kleine Abweichungen in den Wachstumsraten zwischen den einzelnen Kulturen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> Abbildung 2. Proteinausbeuten aus diesen Kulturen erhalten, wie durch einen BCA-Test bestimmt und bestätigt durch SDS-PAGE. Eine der Varianten ist nicht auf hohem Niveau exprimiert. In comKombination mit Abbildung 1, können wir schließen, dass dies nicht durch einen differenziellen Zellwachstum aber aufgrund Proteinexpression nicht ordnungsgemäß induziert. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentatives Ergebnis einer Transkription Assay. Wir maßen die Stimulation Aktivität TFIIB Varianten auf die Produktion von kleinen abortive Transkripte durch RNAP. Hier werden die Reizwirkungen einer vollständigen Sammlung von ein Aminosäuresubstitutionen TFIIB Rückstände K87 gezeigt. Die hohe Reproduzierbarkeit wird durch kleine Fehlerrate bestätigt. Eine Probe Gel der die Leistung von drei Mutanten zu Wildtyp (wt), Negativkontrollen (NC) und Elutionspuffer Vergleich steuert nur unterhalb dargestellt.

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	<li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain.">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li><li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+polymerase+factory:+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes.">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li><li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases.">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40 (2008).</li><li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions.">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li><li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+Function+of+TFIIB.">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , (2011).</li><li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea.">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li><li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II.">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li><li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II.">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li><li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center.">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li><li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism.">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li><li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation.">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li><li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors.">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das automatisierte rekombinanten Proteinreinigung hier beschriebene Verfahren erlaubt die Herstellung und Reinigung einer Vielzahl von mutierten Proteinen in einer kleinen Format unter hoch reproduzierbaren Bedingungen mit minimaler menschlicher Eingriff. Abbildungen 1 und 2 zeigen die Ergebnisse systematischer Qualität-Steuerelemente und Beispiele für die gereinigte Proteine. Abbildung 3 zeigt, dass die gereinigten Transkriptionsfaktoren in diesem Beispiel verwendet in einem hoch reproduzierbar in funktionellen Assays durchzuführen. Auch wenn das Verfahren zur Reinigung von archaealen TFIIB entwickelt wurde, ist es allgemein anwendbar zur Reinigung von Affinitäts-markierten Proteinen. Die Verwendung eines solchen automatisierten Aufreinigungsprotokolle wird also wesentlich erleichtert die biochemische Analyse von rekombinanten Proteinen und wird somit unser Verständnis von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf einer Skala, die schwierig zu erreichen ist manuell.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Overnight Express Sofortige TB Medium </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fastbreak </td><td> Promega GmbH </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Lysonase Bioprocessing Reagent / 1 ml </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-Partikel </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma Basis </td><td> Sigma-Aldrich Compjede Ltd </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Bicinchoninsäure Proteinbestimmung </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Deep Well Platte 2,2 ml Platz Wells PP PK10 </td><td> Anachem Ltd </td><td> 1810-00 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate MicroWell 96 well Flachboden Polystyrol nicht 12 Hülsen von 5 Platten klar 0,4 ml Wellvolumen 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc behandelt </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Blau </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well Blocks RB (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> Guanidinhydrochlorid </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> Waschbar Nadel für TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Reagent Rack für Magnetic Beads </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> Plate Reader Synergy HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Shaker Variomag Teleshaker </td><td> INHECO </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well Magnet Typ A </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins

Röntgenkristallographie ist das Verfahren der Wahl, um eine detaillierte Ansicht der Struktur der Proteine. Solche Studien müssen durch weitere biochemische Analysen ergänzt werden, um detaillierte Einblicke in Struktur / Wirkungs-Beziehungen zu erhalten. Advances in Oligonukleotid-und Gen-Synthese-Technologie macht großen Mutagenesestrategien zunehmend möglich, einschließlich der Substitution von Ziel-Rückstände von allen 19 anderen Aminosäuren. Gewinn-oder Verlust-of-function Phänotypen dann erlauben systematische Schlussfolgerungen gezogen werden, wie der Beitrag von besonderer Rückstände katalytische Aktivität, Stabilität des Proteins und / oder Protein-Protein-Wechselwirkung Spezifität. Um die unterschiedlichen Phänotypen der Natur der Mutation zuschreiben - anstatt auf schwankende Versuchsbedingungen - es unerlässlich ist, zu reinigen und zu analysieren, die Proteine ​​in einer kontrollierten und reproduzierbaren Weise. High-throughput-Strategien und die Automatisierung von manuellen Protokolle aufRoboter-Liquid-Handling-Plattformen Möglichkeiten, solche komplexen molekularbiologischen Verfahren mit wenig menschliches Eingreifen und minimale Fehlerraten 1-5 durchzuführen erstellt. Wir beschreiben hier ein allgemeines Verfahren für die Reinigung von His-markierten rekombinanten Proteinen in einem High-Throughput Weise. In einer neueren Studie, verwendeten wir diese Methode, um eine detaillierte Struktur-Funktions-Untersuchung TFIIB, eine Komponente der basalen Transkription Maschinen. TFIIB für Promotor-gerichtete Transkription in vitro unverzichtbar und ist essentiell für die Rekrutierung der RNA-Polymerase in eine Präinitiationskomplexes 6-8. TFIIB enthält einen flexiblen Linker-Domäne, die die aktive Stelle von RNA-Polymerase 9-11 Spalt eindringt. Diese Linker-Domäne verleiht zwei biochemisch quantifizierbare Aktivitäten auf TFIIB, nämlich (i) die Stimulation der katalytischen Aktivität während der &quot;gescheiterten&quot; Stadium der Niederschrift Initiation, und (ii) ein zusätzlicher Beitrag zurspezifische Rekrutierung der RNA-Polymerase in den Präinitiationskomplexes 4,5,12. Wir nutzten die High-Throughput-Reinigungsverfahren, um Einzel-, Doppel-und Dreifach-Substitution und Löschungen Mutationen innerhalb des TFIIB Linker zu erzeugen und anschließend analysiert werden können in funktionellen Assays für ihre Reizwirkung auf die katalytische Aktivität der RNA-Polymerase 4. Insgesamt erzeugt wir, gereinigt und analysiert 381 Mutanten - eine Aufgabe, die schon zeitaufwendig und mühsam manuell durchzuführen hätte. Wir produziert und untersucht die Proteine ​​in multiplicates, die uns irgendwelche experimentellen Variationen schätzen dürfen und gab uns eine klare Vorstellung von der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Diese Methode dient als generisches Protokoll für die Reinigung von His-markierten Proteinen und wurde erfolgreich verwendet, um andere rekombinante Proteine ​​zu reinigen. Es wird derzeit für die Reinigung von Proteinen optimiert 24 kann aber angepasst ist, um bis zu 96 Proteine ​​zu reinigen.

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High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Wir beschreiben ein Verfahren zur affinitätsmarkiert Reinigung von rekombinanten Proteinen unter Verwendung Probenbehandlungstafel Robotik. Dieses Verfahren ist allgemein anwendbar auf die kleinteilige Reinigung von löslichen Proteinen mit His-Tag in einem Hochdurchsatz-Format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Aufrufe.  Imperial College London. Wir beschreiben ein Verfahren zur affinitätsmarkiert Reinigung von rekombinanten Proteinen unter Verwendung Probenbehandlungstafel Robotik. Dieses Verfahren ist allgemein anwendbar auf die kleinteilige Reinigung von löslichen Proteinen mit His-Tag in einem Hochdurchsatz-Format.

Serie: High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...