We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. Zellkultur (24-48 h vor der Transfektion) <ol><li> 24-48 h vor der Transfektion Samen eine ausreichende Menge HEK293T-Zellen basierend auf der Anzahl von Platten mit 96 Vertiefungen transfiziert. HINWEIS: Für die konsequente Transfektionen Platte Zellen mit einer ausreichenden Dichte schnelle Teilung zu begünstigen, noch nicht mehr als 70-90% Konfluenz werden zum Zeitpunkt der Transfektion. </li><li> Jede Platte mit 96 Vertiefungen erfordert 9 x 10 6 Zellen (75.000 Zellen pro Vertiefung, und 120 Vertiefungen pro Platte für die Verwendung von Vorratsbehälter und Mehrkanalpipette Konto). Berechnung der Verdopplungszeit von HEK293-Zellen (~ typischerweise 20 h), und Samen die geeignete Anzahl von Zellen, um mindestens 9 x 10 6 Zellen zur Zeit der Transfektion erhalten. A 145 mm Kreiskulturplatte ist in der Regel ausreichend für 3 96-Loch-Transfektionen, wenn sich zu ~ 90% Konfluenz, mit ~ 10% der Zellen verbleibende, um eine neue Platte reseed. </li></ol> 2. Vorbereitung vor der Transfektion _content &quot;&gt; HINWEIS: Die Herstellung der Puffer und die Plasmid-DNA in Schritt 2,0-2,2 sollte in den Tagen vor der Transfektion durchgeführt, da die Herstellung dieser Reagenzien können zeitaufwendig sein kann. <ol><li> Menschen 3&#39;UTR Klone, die mit dem Assay 3&#39;LIFE kompatibel sind, über ein öffentliches Plasmid-Repository 30 zur Verfügung. Reinigen DNA-Plasmid von Hand oder mit Liquid-Handling-Roboter. Verwenden Sie eine Transfektion Grade alkalische Lyse Mini-Prep 96-Loch-Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Resuspendieren der gereinigten Vektoren auf ~ 100 ng / ul pro Vertiefung. HINWEIS: Zu wenig Luciferase-Signal wird, wenn die Plasmid-Konzentration unter 40 ng / &amp; mgr; l. </li><li> Erhalten die pLIFE-miRNA-Vektoren 30 oder Klon mit der Rohrleitung in 1B 24. Resuspendieren der Vektoren in einer Konzentration von 500 ng / ul für jede miRNA und Blank Steuer Plasmide. </li><li> Aufgrund der Empfindlichkeit der Nukleofektion Pufferbedingungen, sicherzustellen, dassdas Gesamtvolumen der transfizierten Materialien (einschließlich Zellen und Plasmide), 10% der gesamten Flüssigkeit in jede Vertiefung der 96-Loch-Transfektion Platte nicht überschreiten. Um dies zu erreichen, konzentrieren die pLIFE-miRNA Plasmid-Lager in einer Konzentration von mindestens 500 ng / ul. </li><li> Vorbereitung 10x Glühwürmchenluciferase Pufferreagentien (Tabelle 1), und das 1X Renilla Luciferase Pufferreagentien (Tabelle 2), die für bis zu 6 Monate gelagert werden können. HINWEIS: Der DVB-T in der Glühwürmchen-Luciferase-Puffer muss in Lösung bei -20 ° C in den einmaligen Gebrauch Aliquots gelagert werden. </li></ol> 3. Bereiten Nach Artikel Unmittelbar vor der Transfektion <ol><li> Vorbereitung Transfektionspuffer enthaltenden PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Bereiten Sie diese frischen, auch wenn es für bis zu 1 Monat bei 4 ° C ohne merkliche Abnahme der Transfektionseffizienz gespeichert werden. Bei der Formulierung Puffer und Plasmid-DNA Bände, davon ausgehen, 120 Reaktionen für jede Platte mit 96 Vertiefungen zu sufficiently machen Fehler beim Pipettieren und Lautstärke mit Flüssigkeitsreservoirs und Mehrkanalpipetten verloren. Aliquot 18 ul pro Vertiefung Transfektionspuffer (120 Wells / 96-Well-Platte = 2,16 ml pro Platte), und beiseite stellen. HINWEIS: Die zell Elektroporationsvorrichtung ist extrem empfindlich auf die Pufferbedingungen verwendet, um Zellen zu transfizieren. Genauigkeit bei der Herstellung von Puffern wird eine konstante Leistung des Gerätes zu gewährleisten. Zusätzliche Vorsicht ist bei der Durchführung des Assays, um Verdunstung von Puffern zu verhindern, und zwar durch Minimieren der Zeit, daß der Puffer gelassen wird in Mikrozentrifugenröhrchen, Platten mit 96 Vertiefungen, Reservoirs und Elektrodenplatten aufgedeckt genommen werden. </li><li> Reserve vier Brunnen für die folgenden Kontrollen, keine pLIFE-3&#39;-UTR (zum Hintergrund der Luciferase-Assay zu messen), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (negative Zielkontrolle), Positivkontrolle für die miRNA # 1, positive Kontrolle für die miRNA # 2. HINWEIS: Diese Vektoren sind öffentlich zugänglich 30. Alternativ kann jede zuvor validierten Zielkann als eine Positivkontrolle verwendet werden. </li><li> Warmen Medien, Trypsin (0,25%) auf 37 ° C. </li><li> In jede Vertiefung der 96-Loch-Zellkulturplatte, 200 &amp; mgr; l DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 1% Pen / Strep und in einem 37 ° C Inkubator für die Verwendung nach der Transfektion platziert. </li><li> Schalten Sie alle Geräte Zelle Elektroporation, gefolgt von der unterstützenden Software. Verwenden Pulse Code FF120 für HEK293T-Zellen und PBS / HEPES-Puffer. </li></ol> 4. Herstellung von Plasmid-DNA und Zellgemisch HINWEIS: Die folgende Protokoll geht davon Transfektion drei Platten mit 96 Vertiefungen in einem Experiment für einen Bildschirm mit zwei miRNAs (miRNA # 1 und # 2 miRNA). Jede Platte wird auf die gleiche Platte mit 96 Vertiefungen von pLIFE-3&#39;UTR Plasmide entsprechen, und dreimal mit pLIFE-miRNA-blank, pLIFE-miRNA # 1, oder pLIFE-miRNA # 2 behandelt werden. <ol><li> Bereiten Sie 3 Bestände pLIFE-miRNA + Transfektionspuffer für jedes miRNA. Dieser Bestand sollte für 50% (10 ul) des Gesamtvolumens der jedes Kontogut, um 120 Brunnen multipliziert. Daher sollte jede Aktien 1,08 ml Puffer + 120 ul Plasmid-DNA (pLIFE-miRNA) enthalten. </li><li> Zellen aus 145 mm-Kulturplatte zu entfernen durch Eluieren Medien, wäscht vorsichtig mit PBS, und Behandeln mit ~ 5 ml 0,25% Trypsin für 5 min bei 37 ° C. Trypsin zu neutralisieren mit einem gleichen Volumen an Medium und Pellet-Zellen bei 300 g für 5 min. </li><li> Entfernen Trypsin / Medien und Pellet in ~ 5-10 ml Medium (je nach Zelldichte und genaue Bereich von Zellzähler). </li><li> Zählen von Zellen mit einem Zellzähler. Stellen Sie sicher, dass Zellen&gt; 95% lebensfähig und in exakte Reihe von Maschine. HINWEIS: Eine falsche Zellenzahl kann von extrem hohen Zellkonzentrationen (&gt; 6.0x 10 6 / ml) zur Folge haben. Transfektion zu viele Zellen drastisch zu reduzieren Effizienz der miRNA-Targeting durch Reduzierung Plasmid: Zellverhältnis und / oder abnehm Transfektionseffizienz. </li><li> Aliquot drei Röhren mit jeweils 9 x 10 6 Zellen, die den Zellen entsprechen rzur Transfektion von einer Platte mit 96 Vertiefungen equired. Spin-Zellen bei 300 × g für 3 min. </li><li> Medien zu entfernen. Achten Sie darauf, so viel wie möglich zu Medien mit minimaler Störung des Pellets zu entfernen, da überschüssige Medien Transfektionseffizienz beeinflussen. </li><li> Die Zellen in 1,2 ml Transfektionspuffer / miRNA Plasmid-Gemisch, und beiseite stellen. </li><li> Die folgenden Schritte detailliert Resuspension pLIFE-3&#39;UTR Plasmid in Transfektionspuffer. Da dies in 96-Well-Platten auf, achten Sie darauf, Verdampfung von Puffer durch Abdeckplatten zu allen Zeiten zu vermeiden. <ol><li> Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, bewegen 32,4 ul Transfektionspuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte (9 ul [pro Transfektion] * 3 [Platten] * 1.2 [für Pipettenfehler Konto]). </li><li> In 3,6 &amp; mgr; l (~ 100 ng / ul) von Mini-prepped pLIFE-3&#39;UTR Plasmid in jede Vertiefung geben und gut mischen. </li><li> Je 10 &amp; mgr; l dieser Mischung in jede Vertiefung der 96-Loch-Transfektion Platte und Abdeckung. </li></ol></li></ol><ol><li> Bewegen 1.2 ml der ersten Zelle / Puffer / pLIFE-miRNA Plasmid-Gemisch in das Reservoir. Gut mischen. </li><li> Zugabe von 10 ul dieser Mischung in der ersten 96-Well-Transfektion Platte 10 ul Transfektionspuffer / pLIFE-3&#39;UTR bereits enthält. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. HINWEIS: Equal Suspension von Zellen in dem Puffer wird auch sichergestellt und gründliche Durchgang des elektrischen Stroms durch die Küvette und maximieren Transfektionseffizienz. </li><li> Platzieren Sie 96-Loch-Transfektion Platte auf der Zell Elektroporationsvorrichtung und initiieren Transfektion. </li><li> Nach Transfektion abgeschlossen ist, fügen Sie 100 ul der vorgewärmten Medien von 96-Well-Kulturplatte in jedes Well der 96-Well-Platte Transfektion und gut mischen. Bewegen Sie 100 ul von jeder Vertiefung in die 96-Loch-Kulturplatte. </li><li> Mischen Zellen in Kulturplatten mit Pipette vertikal in der Mitte der Vertiefung angeordnet ist, die als Zellen dazu neigen, an den Seiten des w aggregierenell, wenn richtig gemischt. </li><li> Wiederholen 5,1-5,5 für die verbleibenden zwei Platten. </li><li> Reinigung 96-Well-Platte Transfektion <ol><li> Die 96-Well Platten Transfektion kann durch Waschen mit 70% EtOH geführt werden, um keinen Übertrag von Nukleinsäuren zwischen den Experimenten zu gewährleisten. Führen Sie zwei 70% EtOH wäscht mit einer Sprühflasche, um vollständig zu füllen jedes Loch, gefolgt von Abwischen überschüssigen EtOH auf den Elektrodenstreifen (Unterseite) und ermöglicht die Transfektion Platten vollständig trocknen in der Kultur Kapuze. Anmerkung: Wir haben für Carry-over DNA-Kontamination durch Transfizieren 12 Vertiefungen mit 2 &amp; mgr; pmaxGFP jeweils in HEK293T-Zellen Plasmid getestet, gefolgt von einem einzelnen Waschschritt mit 70% EtOH und eine zweite Transfektion ohne Plasmid-DNA. Mit diesem extrem hohen Plasmidkonzentration, extrem helle Reporter und einem einzigen Wasch, gab es keine beobachtbaren Fluoreszenz in einem der 12 Transfektionen replizieren. </li></ol></li><li> Kulturzellen für 48-72 h bei 37 ° C, gefolgt von der doppelten luciflöschen Assay. </li></ol> 6. Zelllysat Vorbereitung für Luciferase Assay <ol><li> Verdünnen Sie Lysepuffer mit 4 Teilen Wasser, 1 Teil 5x passive Lysepuffer in einem Reservoir. Berechnen Sie 26 ul / Vertiefung, Hinzufügen ~ 20 zusätzliche Mengen, um den Verlust in dem Behälter zu berücksichtigen. HINWEIS: Der Puffer wird bei -20 ° C gelagert und können äußerst dickflüssig und damit vor so dass der 5-fach-Puffer auf Raumtemperatur zu nähern wird Pipettiergenauigkeit verbessern. </li><li> Analysieren Sie jede Vertiefung für Transfektionseffizienz mittels Fluoreszenzmikroskopie. Beachten Sie, etwaige Unstimmigkeiten in Brunnen, die nicht effizient transfizieren haben (&gt; 90% Transfektionseffizienz) oder äußern niedrigen RFP Hinweis auf Überfüllung oder Medien Erschöpfung. Entfernen Sie diese Brunnen aus der Analyse. </li><li> Vollständig zu entfernen Sie das Medium aus den Zellen, man aufpassen, nicht zu schnell zu eluieren, welche dazu führen, Zellen zu lösen wird. HINWEIS: Verbleibende Medien werden das Lysat und verursachen Schwankungen der Werte über Experime verdünnennts. </li><li> In 26 &amp; mgr; l Lysepuffer in jede Vertiefung, und auf einem Plattenschüttler / Wippe bei niedriger / mittlerer Geschwindigkeit für ca. 20-30 min. Nutzen Sie diese Zeit, um die Luciferase-Puffer vorzubereiten, waschen und prime das Luminometer (n), und übertragen Lysat bis opak Messplatten. </li></ol> 7. Doppel Luciferase Assay Hinweis: Wenn mehrere Platten werden der Reihe nach auf einem Luminometer gemessen, erstellen Puffermastermixen mit alles außer ATP und Substrate, das Hinzufügen dieser Reagenzien, gefolgt von pH-Einstellung unmittelbar vor der Anwendung mit jeder Platte. ATP und Substrate können im Laufe der Zeit verschlechtern; Kohärenz der Zeit sind diese Reagenzien im Puffer Konsistenz über mehrere Platten zu verbessern. <ol><li> Bereiten 1x Luciferase-Puffer (Tabelle 1): <ol><li> Wickeln Sie zwei Rohre (in der Regel 15/50 ml Zentrifugenröhrchen) mit der Firefly und Renilla-Puffer mit einer Aluminiumfolie, die als Substrate können lichtempfindlich sein. </li><li>Bereiten 1x Firefly Luziferase-Puffer. 1 ml von jeder der fünf 10x Glühwürmchenluciferase Reagenzien Zugabe EGTA letzten, auf 5 ml H 2 0 zu einer endgültigen Konzentration 1x. <ol><li> Hinzuzufügen 0,025 g ATP auf 10 ml 1x firefly Puffer. Mischen Sie durch mehrmaliges Wenden. Halten ATP auf Eis zu allen Zeiten. ATP wird abgebaut, so dass, wenn mehr als eine Platte nacheinander messen, müssen Puffer neuen Anfang gemacht werden in diesem Schritt für jede weitere Platte. </li><li> 100 l 100 Käfer-Luciferin (Substrat) (Tabelle 1) Buffer sollte gelbliche Farbe auf Basis von pH ändern. </li></ol></li><li> 1x Renilla-Luciferase-Puffer Rekonstitution: Per 96-Well-Platte, aliquote 10 ml 1 &quot;Renilla Puffer&quot;. <ol><li> 100 l BSA (44 mg / ml Stamm). </li><li> Wenn Screening mehr als eine Platte, separate Master-Mix in 10 ml-Teilmengen. </li><li> Fügen Sie 100 ul Coelenterazin zu Puffer (bisher aufgeteilt und bei 100x konz gespeichert.) </li></ol></li> &lt;li&gt; Einstellen des pH auf 8,0 firefly 1x Puffer, gefolgt von dem 1x Renilla-Puffer auf 5,0 unter Verwendung von NaOH und HCl. HINWEIS: Die Aktivität von jedem Puffer und die Fähigkeit des Renilla Puffer, um die Firefly-Luciferase-Aktivität zu quenchen ist stark abhängig vom pH-Wert. Für gleichbleibende Ergebnisse als äußerst präzise in diesem Schritt. </li><li> Bringen Volumen jedes Puffers (entsprechend 1 96-well-Platte) auf 10,5 ml für Luminometer Priming unterzubringen. </li></ol></li><li> Übertragen Lysat bis opak weißen Platten: An dieser Stelle sollten die Zellen in Lysepuffer für ~ 20 min. 25 &amp; mgr; l aus jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, lesen Sie auf- und abpipettieren gründlich zum Aufbrechen der Zellklumpen und homogenisieren Sie das Lysat. </li><li> Bereiten Sie das Luminometer. Schalten Sie das Luminometer und wählen Sie das Protokoll in der DLR-Ordner namens &quot;DLR mit zwei Injektionen&quot;. Andere Formate sind nicht mit der Datenanalyse-Pipeline (unten) kompatibel. <ol><li> Wählen Sie die Brunnen zu sein tinteressiert (alle Vertiefungen ist die Standardeinstellung). </li><li> Verlängern Sie die &#39;Verzögerung vor der Messung &quot;Einstellung auf 5 Sekunden, mit einer 10 sec Messzeit (siehe 29 für nähere Information). </li><li> Kapillar-Waschschritte: 3x Wasser, EtOH 3x, Wasser 3x, trocken 3x. Prime Puffer einmal in den Abfall, und dann ein zweites Mal prime zurück in den Adern, um sicherzustellen, Mischen. Spritzen Sie die Glühwürmchen Puffer ersten und prime es in der linken Kapillare, gefolgt von Renilla in der rechten Kapillare. </li></ol></li><li> Initiieren Sie die Luciferase-Assay. Jede Platte sollte 48 min nehmen ~ zu lesen. Nach Beendigung speichern Sie die Datei zuerst, und dann wiederholen Sie die Waschschritte und schaltete den Luminometer. HINWEIS: Mehrere Platten können gelesen werden und Daten auf dem gleichen Excel-Datei gespeichert, aber Probleme können mit mehreren Platte auftreten, wo das Luminometer liest Programm abstürzen. Achten Sie darauf, alle Daten zwischen den Messungen speichern und Screenshots, wenn Programm stürzt vor Speichern möglich ist. <ol><li> Ersetzen Sie alte Puffermit neuen, wobei Sie auf prime mindestens zweimal mit neuen Puffer vor dem Start der neuen Platte. </li></ol></li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Nutzen Sie Excel-Tabellen &quot;3&#39;LIFE - Einzelplattenanalyse&quot; und &quot;3&#39;LIFE - Mehr Analyse&quot;, erhältlich von <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> . Kopieren Sie Rohdaten für Firefly und Renilla-Luciferase-Messungen von Luminometer Ausgabedatei in die entsprechenden Stellen an den negativen Zustand, miRNA # 1, # 2 und miRNA in das &quot;3&#39;LIFE - Einzelplattenanalyse&quot; Tabellenkalkulation. </li><li> Das Spreadsheet berechnet automatisch Firefly / Renilla-Verhältnis und normalisieren jede miRNA auf die entsprechende negative Kontrolle und Repression zu normalisieren Werte in jeder Platte. HINWEIS: Diese Tabelle wird automatisch Brunnen mit geringer Luciferase-Signal zu identifizieren, markieren Sie deutlich unterdrückte Vertiefungen und bieten Maßnahmen repressiauf über die gesamte Platte. Siehe 24 für eine detaillierte Erläuterung der statistischen Analyse. <ol><li> Kopieren Sie die Werte aus der &quot;Normalized RI Index&quot; Box, in die entsprechenden Zellen in der &quot;3&#39;LIFE - Mehr Analyse&quot; Tabellenkalkulation an der Position, die für jedes miRNA getestet replizieren # 1. Wiederholen Sie dies für alle biologischen Replikaten an verschiedenen Tagen durchgeführt. </li></ol></li><li> Falls gewünscht, legen Sie die Gennamen und Zielvorhersagestatus in Spalten B und D auf. <ol><li> Lassen Sie die Tabelle, um den Durchschnitt aller Platte automatisch zu berechnen. Beachten Sie die Daten in 96-Well-Format als Wärme Karte (Abbildung 2). Die Datei organisiert auch die Daten in Listenform (Abbildung 2). HINWEIS: Die Repression Index ist die verwendet werden, um mutmaßlichen miRNA Targets zu identifizieren Maßnahme. Verschiedenen Stringenzbedingungen Parameter verwendet werden, basierend auf individuellen Vorlieben. Im Durchschnitt sehen wir wahrscheinlich Treffern unter Repression Index 0.8 und durch t-Test (p -Wert &lt;0,05) statistisch signifikant. Wie in Abbildung 3 potentielle Ziele auf der Grundlage dieser Kriterien wird in rot hervorgehoben. </li></ol></li></ol>

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	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Pasquinelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+sequence+and+temporal+expression+of+let-7+heterochronic+regulatory+RNA.">Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA.</a> Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).</li><li>Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+plants.">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).</li><li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14.">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li><li>Wienholds, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+in+zebrafish+embryonic+development.">MicroRNA expression in zebrafish embryonic development.</a> Science. 309 (5732), 310-311 (2005).</li><li>Darnell, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+during+chick+embryo+development.">MicroRNA expression during chick embryo development.</a> Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).</li><li>Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+and+microRNAs+in+fragile+X+mental+retardation.">RNA and microRNAs in fragile X mental retardation.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MicroRNA+feedback+circuit+in+midbrain+dopamine+neurons.">A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons.</a> Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).</li><li>Poy, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreatic+islet-specific+microRNA+regulates+insulin+secretion.">A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion.</a> Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li><li>Paraskevopoulou, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIANA-microT+web+server+v5.0:+service+integration+into+miRNA+functional+analysis+workflows.">DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3'UTR.">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).</li><li>Lal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-24+Inhibits+cell+proliferation+by+targeting+E2F2,+MYC,+and+other+cell-cycle+genes+via+binding+to+'seedless'+3'UTR+microRNA+recognition+elements.">miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements.</a> Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).</li><li>Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+of+the+let-7+miRNA+interacting+with+the+site+LCS1+of+lin-41+mRNA+from+Caenorhabditis+elegans.">NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).</li><li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+microRNA+targeting+code:+functional+sites+with+centered+pairing.">Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing.</a> Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).</li><li>Azzouzi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-96+directly+inhibits+gamma-globin+expression+in+human+erythropoiesis.">MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis.</a> PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-193b+Regulates+Mcl-1+in+Melanoma.">miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).</li><li>Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mode+of+microRNA+target+recognition.">An alternative mode of microRNA target recognition.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).</li><li>Jiao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+targeting+oncogenes+are+down-regulated+in+pancreatic+malignant+transformation+from+benign+tumors.">MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors.</a> PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).</li><li>Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'LIFE:+a+functional+assay+to+detect+miRNA+targets+in+high-throughput.">3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput.</a> Nucleic Acids Res. , (2014).</li><li>Mangone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+C.+elegans+3'UTRs.">The landscape of C. elegans 3'UTRs.</a> Science. 329 (5990), 432-435 (2010).</li><li>Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis.">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes.">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li><li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs:+a+network+perspective.">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li></ol>

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

Die 3&#39;LIFE Assay identifiziert Funktions miRNA Ziele in 3&#39;UTRs in Hochdurchsatz. Dieser Assay ist nützlich für Forscher, die experimentell Identifizierung einer großen Anzahl von mutmaßlichen Ziele für deren miRNA interessiere möchten. Die 3&#39;LIFE Assay ein leistungsfähiger Ansatz zur 3&#39;UTR angetrieben Regulierung abzufragen, indem der Assay stellt ein funktionelles Maß miRNA Targeting und die binäre Testen eines einzelnen Reporter :: 3&#39;UTR gegen eine einzelne miRNA vertrauens adressieren das...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, zu erkennen und zu microRNA (miRNA) Ziele präzise Karte im Hochdurchsatz. MiRNAs endogenen nicht-kodierenden RNAs ~ 22 Nukleotide lang. Nach der Transkription und Verarbeitung, sind reife miRNAs in einem Proteinkomplex eingebaut namens RNA induced silencing complex (RISC). Jedes miRNA führt die RISC auf Zielelemente vor allem in den 3&#39;-untranslatierte Regionen (3&#39;UTRs) von Boten-RNAs (mRNAs) gelegen, was entweder Übersetzung Repression oder mRNA-Spaltung 1. MiRNA erkennen, Zielorte basierend auf Standard-Watson-Crick und G: U Wobble-Basenpaarung und entartet in der Natur, mit mehreren fehlgepaarten Basenpaaren und ausgebeult Regionen. Viele miRNAs sind im Großen und Ganzen aus Pflanzen auf den Menschen 2,3, wo sie eine breite Palette von biologischen Rollen spielen konserviert. In Metazoen können miRNAs mehrere biologischen Prozessen einschließlich Zellschicksal Entscheidungen 4, Entwicklungszeit 5 beeinflussen </sup&gt;, Und weisen häufig gewebespezifische Expressionsmuster 6,7. MiRNA misexpression kann auch aberrante Genregulation, die wesentlichen Einfluss auf das Zellverhalten ausschließlich auf die Funktion der Zielgene Portals resultieren. Als solche sind miRNAs zu einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Neurodegeneration 8,9, Diabetes und Krebs 10 11. Bioinformatic und Nassbank Ansätze vorschlagen, dass jeder miRNA kann in der Lage gezielt Hunderte bis Tausende von verschiedenen mRNAs 12-14 sein, die anzeigt, dass Hochdurchsatz oder genomweite Ansätze sind erforderlich, um diese großen Pool von potentiellen Wechselwirkungen zu untersuchen. Identifizierung von Zielgenen ist eine kritische Komponente des mechanistisch definieren miRNA-Funktion, und dazu müssen die Forscher in der Lage, Ziele in großem Maßstab zu offenbaren. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um miRNA Ziele, einschließlich bioinformatische Vorhersage-Algorithmen zu identifizieren, Hochdurchsatz-Sequenzierunggezielte mRNAs und Reporter basierte Assays. Jeder dieser Ansätze hat inhärente Stärken und Schwächen. Da miRNA Targeting durch Sequenzspezifität geführt, insbesondere von Nucleotiden 2-6 der miRNA (der so genannten Seed-Region), mehrere Algorithmen entwickelt, um miRNA gesamten Genom vieler Organismen vorherzusagen. Diese Algorithmen werden mit den beobachteten Basenpaarung Motive validierter miRNA Targets ausgebildet und häufig nutzen, Parameter wie stringent seed Paarung Website Erhaltung und / oder thermodynamische Stabilität 15. Obwohl diese Filter zu verfeinern, die große Anzahl von mutmaßlichen Ziele mit ausreichender Komplementarität zu nur hohen Vertrauens Ziele können sie artspezifisch nichtkanonische miRNA Zielstellen, die den letzten Beweis schlägt sind weit verbreitet 16-24 ausschließen. Darüber hinaus sind diese Prognosen nicht berücksichtigt Mechanismen der mRNA-Prozessierung, die miRNA-Zielstellen, wie zum Beispiel alternative Polyadenylierung ausschließen nehmen25, 26 RNA-Editing, RNA-Methylierung 27 und kooperative Bindung. Als solche haben hohen falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse für viele Algorithmen 22,24,28 gemeldet. Während diese Algorithmen sind nützlich, um Kandidaten miRNA Ziele für nachfolgende experimentelle Validierung zu identifizieren, diese hohen Fehlerquoten begrenzen die Wirksamkeit von Bioinformatik-Ansätze für die systematische miRNA Zielerfassung. Systematisch nach Wechselwirkungen zwischen einem bestimmten miRNA und möglicherweise gezielt 3&#39;UTRs Sonde haben wir ein Hochdurchsatz-Assay genannt Leucht Identifizierung von Funktionselementen in 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24 entwickelt. Dieser Assay misst direkte Interaktionen und translationale Repression des Test 3&#39;UTR von einer Abfrage miRNA mit einem Dual-Luciferase-Reportersystems. In diesem System wird die 3&#39;UTR eines Gens von Interesse stromab des Leuchtkäfer-Luciferase (fluc) Reporter-Leserahmen kloniert. Die Reporter construct ist mit einer Abfrage miRNA in HEK293T-Zellen cotransfiziert. MiRNA-Targeting wird durch Messung der relativen Änderung zwischen dem Test Fluc :: 3&#39;UTR-Reporter und eine zweite nicht-spezifische Renilla Luciferase-Reporter bestimmt. Wichtig ist, dass die Luciferaseassays detektieren miRNA / mRNA-Wechselwirkungen, die die Translations Ausgang des Reporter beeinflussen. Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden, um miRNA Regulation, wie RT-qPCR und Western-Blots zu erkennen, daß diese umgeht Unterschiede in mRNA-Abbau und translationale Repression, sowie Änderungen in Proteinmenge unabhängig von 3&#39;UTR basierte Regulierung. Luciferase-Assays werden häufig genutzt, um direkten miRNA Ziele wegen ihrer relativen Einfachheit und Sensibilität, aber ihre Verwendung in Hochdurchsatz-Screens zu validieren ist von hohen Kosten, die mit verbrauchende Reagenzien Dritter, das Fehlen von 3&#39;UTR Bibliotheken aus öffentlichen Quellen, und das Fehlen standardisierter Luciferase protocols, zu Schwierigkeiten führen beim Vergleich funktionelle Unterdrückung in mehreren Datensätzen. Um die Verwendung des 3&#39;LIFE Assay zu erleichtern, haben wir Wert auf eine Vereinfachung der Versuchsplanung, Nutzung von nicht-kommerziellen Transfektion 24 und Luciferase Reagenzien 29 gestellt haben, die Schaffung einer 3&#39;UTR-Bibliothek, die regelmäßig aktualisiert und erweitert wird, und ist durch die verfügbaren eine öffentliche Plasmid-Repository 30. Die Skalierbarkeit der 3&#39;LIFE Assay ermöglicht Screening einer großen 3&#39;UTR Bibliothek für die Ausrichtung von einem bestimmten miRNA ohne Vorspannen des Bildschirms in Richtung bioinformatisch identifizierten Gene. Neben der Prüfung kanonischen und vorhergesagten Wechselwirkungen ermöglicht diese systematischen Ansatz die Identifizierung von neuen Targets über nicht-kanonischen und / oder Spezies-spezifische Wechselwirkungen angetrieben. Wichtig ist, dass die Wirkung von miRNA gezielt auf die Proteinproduktion versteht man im allgemeinen in bescheidenen translationale Repression 15,31 &lt;führen/ Sup&gt;, was darauf hindeutet, dass eine primäre Rolle der miRNA Regulation ist die Feinabstimmung Protein-Ausgang, Schutz vor abweichenden Genexpressionsniveaus und bieten Robustheit auf bestimmte Programme 32,33 Zelle. Die Empfindlichkeit des Luciferase-Assay in Kombination mit der Natur Vielzahl negativer miRNA / mRNA-Wechselwirkungen im 3&#39;LIFE Bildschirm erlaubt den Nachweis von subtile Effekte der miRNA-Targeting auf einer großen Anzahl von Genen und die Identifizierung von mehreren Komponenten der Gen Netzwerken, werden durch eine miRNA 24 geregelt. Hier beschreiben wir die 3&#39;LIFE Protokoll, und zeigen es Machbarkeit durch Screening von zwei gut charakterisierten miRNAs, miR-10b und lassen-7c gegen eine Auswahl von 275 menschlichen 3&#39;UTRs (Abbildung 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycylglycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1127-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kx PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">FLAAS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4282</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luciferin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E0399</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K H2 P O4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1551139</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coelenterazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS/HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5546</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pennicilin/Streptomicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">T2600000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiPrep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A2392</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well miniprep plate</td>
			<td style="width:71px;">Pall</td>
			<td>8032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well shuttle plates</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">V4SP-2096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5x Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td>E1941&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instruments</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well GloMax Plate Reader</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E9032</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biomech FX Liquid Handler Robot</td>
			<td style="width:71px;">Beckmann</td>
			<td style="width:119px;">A31842</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4D-Nucleofector Core Unit</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAF-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well Shuttle System</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAM-1001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Counter Countess</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

Lumineszierende Bezeichnung von Funktionselementen in 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) erlaubt die schnelle Identifizierung von Zielen bestimmte miRNAs innerhalb einer Anordnung von hunderten abgefragt 3&#39;UTRs. Zielidentifizierung basiert auf dem Dual-Luciferase-Assay, das die Bindung erkennt auf mRNA-Ebene durch Messung translationale Ausgang, so dass ein funktions Auslesen von miRNA gezielt beruht. 3&#39;LIFE nutzt nicht-proprietäre Puffer und Reagenzien, und öffentlich zugängliche Bibliotheken Reporter, dass genomweite Screens durchführbar und kostengünstig. 3&#39;LIFE kann in einem Standard-Testumgebung durchgeführt werden, entweder mit oder up Liquid-Handling-Roboter und andere Hochdurchsatz-Instrumentierung skaliert. Wir veranschaulichen die Vorgehensweise unter Verwendung eines Datensatzes der menschlichen 3&#39;UTRs in 96-Well-Platten kloniert und zwei Test miRNAs, let-7c und miR-10b. Wir zeigen, wie man DNA-Präparation, Transfektion, Zellkultur und Luciferaseassays in 96-Well-Format durchführen, und bieten Werkzeuge zur DatenAnalyse. Abschließend 3&#39;LIFE ist sehr gut reproduzierbar, schnell, systematisch und identifiziert hohes Vertrauen Ziele.

Das Luminometer Ausgabedatei enthält Rohmessungen für beide Firefly und Renilla-Luciferase-Proteine. Das RAW-Format ist mit dem &quot;3&#39;LIFE - Einzelplattenanalyse&quot; kompatibel &quot;3&#39;LIFE - Mehr Analyse&quot; Arbeitsblätter zur Verfügung von der Mangone lab Website ( <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). Die einzelne Platte Analyse Tabellenkalkulation berechnet automatisch Firefly / Renilla-Verhältnis, normalisiert jeweils miRNA an die entsprechende Negativkon...

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

10.0K Aufrufe.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Serie: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Forschung

Biologie

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondary Structure Prediction Mit High-Throughput-SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...