Wir danken an Fabiana Benatti für ihre freundliche Zusammenarbeit im Video. Wir danken auch FAPESP (# 2007/51228-0) und CNPq (# 300133/2008-1) für die Unterstützung unserer Forschungen auf diesem Gebiet.

Einführung Die notwendige Energie für die Aufrechterhaltung einer körperlichen Anstrengung kommt von zwei metabolischen Quellen: aerobe und anaerobe Stoffwechsel. Während die aeroben Metabolismus ist effizienter als der anaeroben Stoffwechsel (dh er erzeugt eine höhere Menge an ATP pro Mol Substrat), Energiegewinnung durch anaeroben Stoffwechsel kann eine große Menge an Energie in einem sehr kurzen Zeitraum bereitzustellen. Dies kann entscheidend sein für jede Situation, die extrem schnelle Bewegungen erfordert. Jede Sportart hat spezifische Eigenschaften in Bezug auf die motorischen Fähigkeiten, die einzigartigen physiologischen und metabolischen Anforderungen für die jeweilige Sportart zu verleihen. Der wichtigste Aspekt des metabolischen Bedarfs ist der relative Beitrag des Energiesystems zu der Gesamtenergie für die Aktivität erforderlich ist. Um den spezifischen Bedarf der einzelnen Sportarten zu bestimmen, ist entscheidend für die Entwicklung optimierter Ausbildungsmodelle, Ernährungs-Strategien und Hilfsmittel, die eine leistungssteigernde maximieren könnenthletic Leistung. Einige Sportarten sind relativ einfach in einem Labor reproduziert werden, wodurch es möglich ist, um eine kontrollierte Umgebung, in der Athleten ausgewertet werden können. Dies ist der Fall von Laufen und Radfahren, zum Beispiel. Vorhersehbare Bewegungen komponieren diese Sportarten und deshalb sind sie einfach zu studieren. Unter Verwendung spezieller Geräte, ist es möglich, ganz genau die gleichen Bewegungen zu imitieren, dass Athleten führen in realen Situationen, wie Training und Wettkampf. In der Tat haben diese Sportarten wurden ausführlicher durch Übung Wissenschaftler studierte und profitierte mit einem vollständigen und zuverlässigen wissenschaftlichen Literatur. Auf der anderen Seite gibt es eine Reihe von Sport viel schwieriger im Labor reproduziert werden. Diese Sportarten sind unberechenbar und abhängig von den Aktionen der Partner (s) und Gegner (n). Dies führt zu einer Unfähigkeit, genau zu reproduzieren die Wettbewerbsbedingungen im Labor und eine Unfähigkeit zur Assess diese Athleten im Feld entweder während Training oder Wettkampf. Vielleicht, weil diese Probleme, haben sie viel weniger Aufmerksamkeit von den Wissenschaftlern erhalten. Dies ist der Fall von der Mehrheit der Mannschaftssport und vielen einzelnen Sportarten ein. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte wollten wir beschreiben, wie die Differential Beitrag der Energiesysteme in Sportarten, die nur schwer in kontrollierten Laborbedingungen reproduzieren sind zu beurteilen. Denn Judo ist ein sehr komplexer und unberechenbarer Sport, werden wir Judo als Beispiel verwenden. Jedoch können die Konzepte hier dargestellt, um eine Reihe von verschiedenen Sportarten angepasst werden. 1. Physiologische Messungen in Ruhe <ol><li> Messen des Sportlers Körpermasse bevor er / sie leitet die Ausübung. </li><li> Vor Beginn der Übung, sammeln eine kleine Ruhe-Blutprobe aus der Fingerspitze oder Ohrläppchen und halten Sie sie auf Eis, bis die ganze experimentelle Verfahren ist beendet. </li><li> Im Anschluss an, legen Sie die CALibrated tragbare Gasanalysator an der bequemste Position, die auf die Bewegungen, dass der Athlet führt, und Rekord Ruhe-oder Grundlinie Sauerstoffverbrauch für fünf Minuten ab. Während der Baseline-Messung, muss der Athlet ruhig stehend auf seine / ihre Füße bleiben (wenn die Übung wird im Stehen durchgeführt werden) oder saßen in der Ausrüstung, die verwendet werden (wird, wenn die Ausübung in einem oder in cycloergometer durchgeführt werden oder ähnliche Anlagen). </li></ol> 2. Physiologische Messungen während der Übung <ol><li> Nach dem Sammeln ruhenden Blutprobe und Ruhen Sauerstoffverbrauch, könnten Sie fragen den Athleten, um die spezifische Übung, die Sie studieren beginnen. Das tragbare Gasanalysator muss in der Lage, die nicht mit Bewegung und dass Sport nicht das Gerät beschädigt wird stört platziert werden. Weiter Messen des Sauerstoffverbrauchs während der gesamten Übung Zeitraum. </li></ol> 3. Physiologische Messungen nach dem Training </p&gt; <ol><li> Nach dem Sammeln Übung Sauerstoffverbrauch Daten, solange aufnehmen, Sauerstoffverbrauch für zehn Minuten vor dem Ausschalten des Gerätes nach unten. Immer neu kalibrieren Gasanalysator wenn mehr als ein Athlet wird in der am gleichen Tag ausgewertet werden. </li><li> Um die maximale Plasmakonzentration Laktat nach dem Sport identifizieren, sammeln kleine Blutproben sofort nach dem Training, drei, fünf und sieben Minuten nach dem Training. Halten Sie sie auf Eis, bis die Analyse. </li></ol> 4. Blutproben Verarbeitung und Peak-Plasma-Laktat-Bestimmung <ol><li> Jede Blutprobe muss in Mikroröhrchen, die ein ähnliches Volumen einer 2% NaF-Lösung (dh, wenn Sie sammeln 25 ul Blut werden, platzieren Sie es in 25 ul 2% NaF) platziert werden. </li><li> Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, Abtrennung des Plasmas von Erythrozyten durch Drehen der Proben für 5 Minuten bei 2000 g bei 4 ° C </li><li> Plasma-Laktat kann durch eine Vielzahl von Verfahren2, 3 bestimmt werden. In unserem Labor verwenden wir die elektrochemische Meth-od mit Hilfe eines automatisierten Laktat-Analysator (Yellow Springs 1500 Sport, Ohio). </li></ol> 5. Die Berechnungen <ol><li> Berechnen Sie die Netto-Energie durch den aeroben Stoffwechsel durch Subtraktion Rest Sauerstoffverbrauch nach dem Training Sauerstoffverbrauch generiert. Sauerstoffverbrauch in Ruhe wird durch Multiplikation des Durchschnitts der letzten 30 Sekunden der Grundlinie Sauerstoffverbrauch durch die gesamte Trainingsdauer Zeit erhalten. Dann Berechnung der Fläche unter der Kurve der Ausübung Sauerstoffverbrauch durch Verwendung der Trapez-Methode. Schließlich subtrahieren Sie die Ruhe-Sauerstoffverbrauch nach dem Training Sauerstoffverbrauch. </li><li> Der Beitrag des anaeroben Stoffwechsels alaktaziden (dh, die ATP-CP-Weg) kann als die schnelle Komponente der Überschuß Post-Belastungs-Sauerstoffverbrauch 4-6 in Betracht gezogen werden, wie in 1 dargestellt. Berechne die Energie von der alaktaziden System durch den Einbau hergestellt die Kinetik der post-exercise Sauerstoffverbrauch zu einem bi-oder einem monoexponential Kurve. Dies kann mit Hilfe der Mathematik &quot;-Software (zB Microcal Origin Version 7.0) durchgeführt werden. Wählen Sie von der mono-oder bi-exponentiellen Kurve auf dem Modell, das am besten zu Ihrem Datensatz (dh die niedrigste Rückstand) basiert. Dann verwenden Sie die Begriffe von der angepassten Formel (Gleichung 1) bereitgestellt, um alaktaziden Beitrag gemäß Gleichung 2 berechnet werden. <img src="/files/ftp_upload/3413/3413fig1.jpg" alt="Fiugre 1" /> 1. Schematische Darstellung eines typischen Kurve Sauerstoffverbrauch in Ruhe erhalten, während und nach der Übung. Gleichung 1: <img src="/files/ftp_upload/3413/3413eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> Gleichung 2: <img src="/files/ftp_upload/3413/3413eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> wobei V O2 (t) Sauerstoffaufnahme zum Zeitpunkt t, V O2baseline Sauerstoffaufnahme an der Basislinie, A die Amplitude ist, δ die Zeitverzögerung ist, τ eine Zeitkonstante,und 1 und 2 bezeichnen die schnellen und langsamen Komponenten, jeweils. </li><li> Um den Beitrag von der anaeroben zu berechnen, wird angenommen, dass 1 mM Laktat über den Ruhewerte bis 3 ml Sauerstoff pro Kilogramm Körpergewicht mass7 verbraucht entspricht. So berechnen Delta-Peak-Plasma-Laktat (dh Peak-Plasma-Laktat minus Ruhe-Plasma-Laktat) und multipliziert sie mit 3 und durch den Körper des Sportlers Masse. Der erhaltene Wert von Sauerstoff in ml wird dann auf L und Energie (kJ) umgewandelt, unter der Annahme, dass jede 1 l O 2 gleich 20,92 kJ. </li><li> Schließlich wird der Erfolg jedes Energiesystem erhalten summiert, so dass Sie den gesamten Energieverbrauchs während der Tätigkeit und den relativen Beitrag der einzelnen System berechnet werden müssen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Kurve der Sauerstoffverbrauch in Ruhe, während des Trainings und nach dem Training. Imhier verwendeten Beispiel durchgeführt Athleten drei verschiedene Judo-Techniken (O-uchi-gari, Harai-goshi und seoi-nage) für fünf Minuten (ein Wurf alle 15 s) 8. Dies ist eine typische Reaktion auf intermittierende Bewegung. Nach den Berechnungen, erhalten wir die endgültigen Ergebnisse über den Beitrag der Energie-Systeme während des Judo-Übungen (Tabelle 1). Weitere repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. In diesem Beispiel wurden Indoor-Kletterer verschiedener wettbewerbsfähiges Niveau (dh, Freizeit-vs Elite) während einer Low-Route klettern Schwierigkeit bewertet. Einzelne Ergebnisse für ein Elite-Athlet und ein Freizeitsportler sind dargestellt (Tabelle 2). <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2"> Seoi-nague </td><td colspan="2"> Harai-goshi </td><td colspan="2"> O-uchi-gari </td></tr><tr><td> kJ </td><td> % </td><td> kJ </td><td> % </td><td> kJ </td><td> % </td></tr><tr><td> Anaerobe alaktaziden </td><td> 46 ± 20 </td><td> 16,3 ± 2,8 </td><td> 43 ± 21 </td><td> 16,1 ± 2,7 </td><td> 36 ± 22 </td><td> 14,6 ± 2,8 </td></tr><tr><td> Aerob </td><td> 223 ± 66 </td><td> 82,2 ± 2,9 </td><td> 211 ± 66 </td><td> 82,3 ± 3,8 </td><td> 196 ± 74 </td><td> 84,0 ± 3,8 </td></tr><tr><td> Anaerobe Milchsäure </td><td> 4 ± 2 </td><td> 1,5 ± 0,7 </td><td> 5 ± 5 </td><td> 1,6 ± 1,4 </td><td> 4 ± 4 </td><td> 1,5 ± 1,1 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 273 ± 86 </td><td>- </td><td> 259 ± 91 </td><td> - </td><td> 237 ± 99 </td><td> - </td></tr><tr><td> Total (kJ / min) </td><td> 51,9 ± 8,7 </td><td> - </td><td> 49,4 ± 8,9 </td><td> - </td><td> 45,3 ± 19,6 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Repräsentative Ergebnisse des gesamten Energieverbrauchs und den Beitrag der Energie-Systeme während drei verschiedenen Judo-Übungen. <table border="1"><tbody><tr><td> Wettbewerbsfähiges Niveau </td><td> Aerobic (%) </td><td> Anaerobe Milchsäure (%) </td><td> Anaerobe alaktaziden (%) </td><td> Total (kJ) </td><td> Total (kJ / s) </td></tr&gt; <tr><td> Elite </td><td> 40 </td><td> 8 </td><td> 52 </td><td> 70,4 </td><td> 1,00 </td></tr><tr><td> Recreational </td><td> 40 </td><td> 15 </td><td> 45 </td><td> 96,1 </td><td> 1,15 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vertreter individuellen Daten des gesamten Energieverbrauchs und den Beitrag der Energie-Systeme während einer Low-Schwierigkeit Aufstieg Route. <img src="/files/ftp_upload/3413/3413fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse während einer 5-Minuten-Übung Judo erhalten.

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Die Autoren erklären, sie haben keinen Interessenkonflikt zu dieser Studie.

Die Methode, die wir gezeigt haben, Hase kann sowohl für kontinuierliche und intermittierende Übung verwendet werden. Der große Vorteil des Verfahrens ist, dass es zu Übungen und Sportarten, die schwer in kontrollierten Labor nachgeahmt werden Einstellungen sind angepasst werden kann. Darüber hinaus ist dies die einzige Methode, die geeignet sind, den Beitrag der drei verschiedenen Energien. Somit erlaubt die Methode die Studie von Sport mit großer Ähnlichkeit zu realen Situationen, die Bereitstellung wünschenswert ökologische Validität der Studie 9. Zum Beispiel kann eine aktuelle Studie von Mello et al. Zeigten, dass die 10 glykolytische Beitrag in einem 2000 m auf dem Wasser Ruderregatta von nur 7%, was bedeutet, dass Ruderleistung ist hauptsächlich abhängig von den aeroben Stoffwechsel bedeutet. Auch eine Studie von Beneke et al 4 bestätigt, dass die Hauptquelle der Energie, die während einer der am häufigsten verwendete anaerobe Tests, die Wingate Anaerobic Test, der anaerobe Stoffwechsel (20% aerob ist;. 30% alaCTIC und 50% glykolytischen). Jüngste Studien von unserer Gruppe haben auch die Energie Beiträge von Klettern in der Halle 6 und Judo-8, wie in diesem Beispiel berichtet gekennzeichnet. Tatsächlich ist das Wissen über den energetischen Beitrag kritisch für die Entwicklung von Strategien ergogene, Ausbildungseinrichtung oder auch für die Validierung eines Tests. Diese Methode hat einige Einschränkungen. Erstens sind die Kosten der Ausrüstung etwas hoch und spezialisierte geschultes Personal erforderlich. Zweitens, obwohl die meisten Sportarten mit dieser Technik nachgeahmt werden kann, ist es keine Art der Übung, die untersucht unter Verwendung des tragbaren Gasanalysator kann. Schließlich, wie Plasma-Laktat nicht genau stellen die Summe von Laktat Skelettmuskulatur während der Aktivität produziert, können die Ergebnisse durch dieses Verfahren erhalten, wie einem Kostenvoranschlag des metabolischen Bedarf während des Trainings berücksichtigt werden, anstatt eine präzise Quantifizierung der energetischen Beitrag. Dennoch ist dies die einzige validierte michThSB verfügbar 11 geeignet sind, den Beitrag der drei verschiedenen Energiesysteme.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> YSI 1500 Sport </td><td> Yellow Springs </td><td> Dieses Gerät ermöglicht eine schnelle und einfache Plasma-Laktat-Bestimmung </td></tr><tr><td> K4 b2 </td><td> Cosmed </td><td> Dieses Gerät ist zur Messung von Sauerstoffverbrauch während der gesamten Übung unerlässlich </td></tr><tr><td> Software Microcal 6,0 </td><td> Herkunft </td><td> Diese Software (oder eine andere mit ähnlichen Fähigkeiten) wird für die Berechnungen nützlich </td></tr></tbody></table>

determining the contribution of the energy systems during exercise

Einer der wichtigsten Aspekte des metabolischen Bedarf ist der relative Beitrag der Energiesysteme auf der gesamten Energie für eine bestimmte körperliche Aktivität erforderlich. Obwohl einige Sportarten relativ einfach in einem Labor (z. B. Laufen und Radfahren) reproduziert werden sollen, sind eine Reihe von Sportarten viel schwieriger, vervielfältigt und studierte in kontrollierten Situationen. Diese Methode zeigt, wie die Differential Beitrag der Energiesysteme in Sportarten, die nur schwer in kontrollierten Laborbedingungen zu imitieren sind zu beurteilen. Die hier dargestellten Konzepte können auf praktisch jede Sportart angepasst werden. Die folgenden physiologischen Variablen benötigt werden: Rest Sauerstoffverbrauch, Übung Sauerstoffverbrauch, post-exercise Sauerstoffverbrauch, Rest-und Plasma-Laktatkonzentration nach dem Training Plasma-Peak-Laktat. Um den Beitrag des aeroben Stoffwechsels zu berechnen, werden Sie den Sauerstoffverbrauch in Ruhe und während der Übung benötigen. Durch die Verwendung derTrapezmethode, Berechnung der Fläche unter der Kurve der Sauerstoffverbrauch während des Trainings, Subtrahieren des Bereichs entsprechend dem Rest Sauerstoffverbrauch. Um den Beitrag des alaktaziden anaeroben Stoffwechsel zu berechnen, hat die post-exercise Sauerstoffverbrauch Kurve zu einem Mono-oder einen bi-exponentiellen Modell (nach Wahl des am besten passt) eingestellt werden. Verwenden Sie dann die Bedingungen der angepassten Formel zu anaeroben Stoffwechsel alaktaziden berechnen, wie folgt: ATP-CP-Metabolismus = A 1 (mL s -1.) Xt 1 (s). Schließlich, um den Beitrag des anaeroben Systems zu berechnen, multiplizieren Peak-Plasma-Laktat durch 3 und durch den Körper des Sportlers Masse (das Ergebnis in ml wird dann auf L konvertiert und in kJ). Die Methode kann sowohl für kontinuierliche und intermittierende Übung verwendet werden. Dies ist ein sehr interessanter Ansatz, da es zu Übungen und Sportarten, die nur schwer in kontrollierten Umgebungen sind nachgeahmt werden kann angepasst werden. Außerdem ist dies die nurvailable Verfahren geeignet sind, den Beitrag der drei verschiedenen Energiesysteme. Somit erlaubt die Methode die Studie von Sport mit großer Ähnlichkeit zu realen Situationen, die Bereitstellung wünschenswert ökologische Validität der Studie.

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Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern auf Bewegung und Sport Sciences konzentriert, um den relativen Beitrag der drei verschiedenen Energiesysteme zur gesamten Energieverbrauchs während einer Vielzahl von Übungen zu bestimmen.

Bestimmung des Beitrages der Energy Systems während des Trainings

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

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Research

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Biology

41.2K Aufrufe.  University of Sao Paulo. Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern auf Bewegung und Sport Sciences konzentriert, um den relativen Beitrag der drei verschiedenen Energiesysteme zur gesamten Energieverbrauchs während einer Vielzahl von Übungen zu bestimmen.

Serie: Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Forschung

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Gross Dissection der Magen der Lobster, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa have the potential to impair animal welfare and research. The fish are typically analyzed post mortem to detect microbes. The use of sentinels is a suggested way to improve the sensitivity of the surveillance and to reduce the number of animals to sample. The setting of a pre-filtration sentinel tank out of a recirculating system is described. The technique is developed to prevent water pollution and to represent the fish population by a careful selection of age, gender, and strains. In order to use the minimum number of animals, techniques to screen the environment are also detailed. Polymerase Chain Reaction (PCR) on surface sump swabs is used to significantly improve the detection of some prevalent and pathogenic mycobacterial species such as Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilum, and Mycobacterium chelonae. Another environmental method consists of processing the sludge at the bottom of a holding tank or sump to look for P. tomentosa eggs. This is a cheap and fast technique that can be applied in quarantine where a breeding device is submerged into the holding tank of imported animals. Finally, PCR is applied to the sludge sample and A. hydrophila is detected at the sump&#39;s bottom and surface. Generally, these environmental screening techniques applied to these specific pathogens have led to an increased sensitivity compared to the testing of pre-filtration sentinels.

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

This protocol describes the use of sump swabs and sludge analysis of zebrafish systems, which leads to increased detection compared to the sole use of sentinels to detect pathogens such as Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa. A system to monitor P. tomentosa eggs in quarantine is also proposed.

Environmental Screening von Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und Pseudocapillaria Tomentosa im Zebrafisch-Systeme

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...