Die Verwendung verschiedener Energiesubstrate ist sowohl zelltypspezifisch als auch krankheitsindikativ. Die Messung des Verbrauchs der spezifischen Substrate kann sowohl Aufschluss über die normale Biologie als auch über die Pathologie geben. Die Technik benötigt keine spezielle Ausrüstung und ist leicht zu skalieren.
Es ist auch einfacher zu verwenden als zuvor veröffentlichte Methoden. Das Verständnis von Veränderungen der Substratoxidationsrate wird die Entwicklung von diätetischen und pharmakologischen Interventionen für Stoffwechselstörungen ermöglichen. Obwohl diese Technik mit Knochengewebe demonstriert wird, lässt sie sich leicht anpassen, um die metabolische Flexibilität in allen Zelltypen zu untersuchen und sowohl die Ursachen als auch die Folgen metabolischer Verschiebungen zu verstehen.
Nachdem Sie die Welpen von drei bis fünf postnatalen Tagen geopfert haben, übertragen Sie sie in eiskalte D PBS-haltige Penicillin-Streptomycin-Dual-Antibiotika-Lösung. Legen Sie die Kalvarien frei, indem Sie die Haut und das Weichgewebe entfernen. Sammeln Sie den mittleren Bereich, indem Sie das umgebende Gewebe von hinten nach vorne in D PBS schneiden.
Kratzen Sie die inneren und äußeren Oberflächen der Kalvaria vorsichtig mit einer Pinzette, um die Zellen bei der anschließenden Verdauung freizusetzen. Bereiten Sie 2 und 4 Milligramm pro Milliliter Lösungen von Kollagenase Typ zwei in D PBS vor und filtern Sie jede Lösung mit einem frischen 0,22-Mikrometer-Filter. Verdauen Sie zuerst die gereinigten Calvaria mit zwei Milligramm pro Milliliter Kollagenaselösung für 15 Minuten und verwerfen Sie dann die Verdauungslösung.
Als nächstes verdauen Sie die sauberen Proben in vier Milligramm pro Milliliter Kollagenaselösung dreimal für jeweils 15 Minuten. Ziehen Sie dann die Verdauungslösung und speichern Sie sie. Filtern Sie die Aufschlusslösung durch 70-Mikrometer-Zellsiebe und zentrifugieren Sie das Filtrat bei 300 RCF für fünf Minuten.
Das Zellpellet wird in einem vollständigen MEM-Alpha-Medium mit 10%FBS und Penicillin-Streptomycin-Dual-Antibiotika-Lösung suspendiert. Zählen und säen Sie die Zellen in einer 10 Zentimeter großen Platte. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid für drei Tage.
Dissoziieren Sie dann die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 0,25 Trypsin EDTA. Nach der Verdauung zählen und säen Sie die Zellen in einer 24-Well-Zellkulturplatte mit einem vollständigen MEM-Alpha-Medium, das 10% FBS und Penicillin-Streptomycin-Dual-Antibiotika-Lösung enthält. Samen Sie mindestens vier Vertiefungen pro Zelltyp und Substrat und mindestens drei zusätzliche Vertiefungen für jeden Zelltyp für die Zählung vor dem Assay.
Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nachdem Sie den Muskel und das Bindegewebe von acht Wochen alten Mäusen entfernt und Femuren und Tibias gesammelt haben, schneiden und verwerfen Sie beide Enden der Knochen mit einer scharfen Schere. Spülen Sie das Knochenmark von einem Femur und einer Tibia in eine frische 10 Zentimeter große Petrischale mit einer Spritze, die mit einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, die 15 Milliliter komplettes MEM-Alpha-Medium mit 10% FBS-Penicillin-Streptomycin-Dual-Antibiotika-Lösung und 10% CGM 14 12-konditioniertem Medium enthält.
Kultivieren Sie die Zellen in der Petrischale in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Nach drei Tagen entsorgen Sie die Nährmedien und spülen Sie die Zellen mit D PBS aus. Dissoziieren Sie die angeschlossenen Zellen bei 37 Grad Celsius mit 0,25% Trypsin EDTA für fünf Minuten.
Nach der Zentrifugation wird das Zellpellet im BMM-Medium resuspendiert. Zählen und säen Sie die Zellen in einer Zellkulturplatte mit 24 Well gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren. Kultur bei 37 Grad Celsius über Nacht im BMM-Medium vor Beginn der Assays.
Waschen Sie die Zellen in den zusätzlichen Vertiefungen zweimal mit D PBS. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0,25%Trypsin EDTA. Re suspend 20 Mikroliter verdaute Zellen in D PBS.
Mit 20 Mikrolitern Acridinorange und Propidiumiodid-Farbstofflösung bestimmen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und erfassen die Anzahl. Waschen Sie die Zellen in den Assay-Vertiefungen zweimal mit D PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter heißes Medium zu jedem Assay gut in der RAM-gekennzeichneten Gewebekulturhaube hinzu.
Nachdem Sie die Platte mit Parafilm versiegelt haben, inkubieren Sie die Zellen in einem RAM-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 4 Stunden. Schneiden Sie während der Inkubation Filterpapier in kreisförmige Stücke, die etwas größer sind als der Bereich in der Kappe des 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens, und legen Sie das Papier fest in die Kappe. Geben Sie 200 Mikroliter einer 1 molaren Perchlorsäure zu jedem Röhrchen und 20 Mikroliter Natriumhydroxid zu dem Filterpapier, das in der Kappe angebracht ist.
Nach dem Inkubieren der Zellen 400 Mikroliter Kulturmedium aus jedem Brunnen in die vorbereiteten Röhrchen überführen und die Kappen sofort schließen. Lassen Sie die Rohre eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einem Rohrgestell. Parallelae während der Inkubation stellen für jedes Röhrchen ein Szintillationsfläschchen auf und füllen es mit vier Millilitern Szintillationsflüssigkeit.
Geben Sie jedes Stück Filterpapier in ein Szintillationsfläschchen und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Führen Sie Wischtests an der Gewebekulturhaube, dem Wasserbad, dem Kühlschrank, dem Inkubator, der Spüle, dem Boden und jedem anderen Arbeitsbereich auf mögliche RAM-Kontamination durch. Legen Sie die Papiertücher in Szintillationsfläschchen, die Szintillationsflüssigkeit enthalten.
Messen Sie die Kohlenstoff-14-Radioaktivität in den Szintillationsfläschchen mit einem Szintillationszähler und zeichnen Sie die Messergebnisse auf. Dekontamination der Arbeitsumgebung, ggf. nach Strahlenschutzrichtlinien. Die Abbildung vergleicht die Substratoxidation durch primäre Calvaria-Präosteoblasten mit BMMs.
Nachdem die Primärzellen über Nacht in vollständigem MEM-Alpha-Medium durchgangen und kultiviert wurden, erreichen sie typischerweise eine Konfluenz von 80 bis 90% und weisen ihre charakteristische Morphologie auf. Die kalvarialen Präosteoblasten sind deutlich größer als BMMs. Die Ergebnisse der Substratoxidation zeigten, dass die Oxidationsrate für jedes Substrat in kalvarialen Präosteoblasten signifikant höher ist als in BMMs, was wahrscheinlich auf eine höhere Energieproduktion durch oxidative Phosphorylierung in den Präosteoblasten hinweist.
Das eingelegte dritte Papier sollte etwas größer sein als ein 1,7 Milliliter Ebin-Oberrohrverschluss. Diese Methode kann in Verbindung mit dem Sauerstoffverbrauch und zur Bestimmung der Gesamtrate der oxidativen Phosphorylierung und der laktativen Produktion in den Zellen verwendet werden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Substratnutzung während verschiedener Differenzierungsstadien oder Krankheitseinstellungen zu bestimmen.
Mit diesem Wissen können wir Interventionen für Stoffwechselstörungen entwickeln.
