Die Autoren danken Victoria Carpenter für ihre kritischen Kommentare dieses Protokolls.

Teil I - RNAi-vermittelten Gen-Knockdown in der Erwachsenenbildung Aedes aegypti Mücken. Für Experiment Überblick siehe Abbildung 1. 1. dsRNA-Synthese <ol><li> Synthetisieren spezifische dsRNAs gegen Gene von Interesse und Kontrolle dsRNAs. Anmerkung: Es wird empfohlen die Entwicklung Primer für die PCR-Fragmente im Bereich von 300 bis 500 Basenpaare am 3&#39;-Ende der spezifischen cDNA 2 und mit dem T7-Primer-Sequenz am 5 &#39;befestigt Ende (5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTA befindet TAG GG-3 &#39;). Die Einzigartigkeit der Fragmente sollte durch BLASTN Analyse 3 bestätigt werden. </li><li> Verwenden Sie die Ambion MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit (Ambion, Tisch von Reagenzien), die T7-RNA-Polymerase nutzt für die Transkription Reaktion auf dsRNA zu synthetisieren. Hinweis: ähnliche Reagenzien und Kits sind verfügbar anderswo. </li><li> Um dsRNA zu reinigen, fällt mit Lithiumchlorid gemäß den Anweisungen mit dem MEGAscript Kit. </li><li> Nach purificatIonen, löst den dsRNA Pellet in sterilem Wasser. Um eine ausreichende Viskosität für die Mikroinjektion zu gewährleisten, sollten die dsRNA-Konzentration nicht mehr als 2 ug / ul. </li></ol> 2. Injektionspräparat <ol><li> Eine einfache Mikro-Injektor kann durch Schläuche, Schere, Nadel ein Metall, eine 1 ml Spritze und einer 1 ml Kunststoff-Pipettenspitze (siehe Abbildung 2) konstruiert werden. Der Schlauch sollte ~ 40 cm Länge geschnitten werden. Alternativ kann ein automatisches Mikroinjektor wie Drummond Nanojet II 4 verwendet werden. <ol><li> Schneiden Sie die Spitze der Spritze (Nadel-Hub) bei 2 ml Skalenmarkierung und entfernen Sie den Gummistopfen Kopf aus dem Kolben. </li><li> Lochen Sie ein Loch mit einer Nadel aus Metall in der Gummi-Kolbenkopf und Ort des Gummikolbens Kopf in den Nacken in der Nadel-Hub. </li><li> Die Nadel-Hub in einem Ende des Rohrs und stellen eine 1-ml-Kunststoffröhrchen Pipettenspitze in dem anderen Ende, die als das Mundstück (alternativ kann ein 10 ml sy verwendet wirdringe verwendet werden, um den Luftdruck zu erzeugen, die für Injektion) werden. </li></ol></li><li> Legen Sie eine Glaskapillare Nadel in das Loch in der Gummikolben Kopf und brechen Sie die Spitze der Nadel ab, so dass die Breite ist groß genug für Flüssigkeit ungehindert durchfließen. Hinweis: Die optimale Größe der Nadelspitze muss empirisch ermittelt werden - wenn die Breite der Nadel ist zu groß, das wird in der Trauma und eine hohe Sterblichkeit zur Folge haben Moskito, wenn die Nadel Breite zu klein ist, wird es unmöglich sein zu durchdringen die Mücke Exoskelett. </li><li> Tauchen der Injektionsnadel in die vorbereitete Probe dsRNA und stellt die flüssige Probe in die Injektionsnadel durch Ansaugen der Flüssigkeit mit dem Mundstück (oder einer Spritze). Hinweis: Dieser Schritt ist für alle flüssigen Reagenzien, die in Mücken gespritzt werden, einschließlich der PBS-Puffer, der in der in vivo Diurese Assay-Protokoll verwendet wird (siehe unten). </li></ol> 3. Sammeln und Anesthetize Moskitos <ol><li> Collectiont Moskitos mit einem batteriebetriebenen Aspirator in einen Sammelbehälter. Legen Sie eine Kappe über die Sammlung Fläschchen und legen Sie das Fläschchen auf eine saubere CO 2-Pad, um Mücken zu betäuben. Hinweis: Alternativ können Mücken auf Eis betäubt. </li></ol> 4. Mosquito Injection <ol><li> Öffnen Sie die Sammlung Fläschchen und legen die Mücken direkt an der CO 2-Pad und warten, bis Mücken betäubt sind. </li><li> Entsorgen Sie alle Männer. </li><li> Richten Sie die Mücken auf der Seite, um für einen leichteren Zugang zur Injektion zu ermöglichen. </li><li> Schnappen Sie Mücken an den Beinen oder Flügeln, um Verletzungen zu vermeiden. Sie können auch einen feinen Pinsel oder Feder, um Mücken zu manipulieren. </li><li> Wenn Sie bereit sind, um die erste Mücke injizieren, sanft unterstützen eine Seite des Thorax mit der Zange und legen Sie die Spitze der Nadel in die andere Seite des Thorax (Abbildung 2). Es ist besser, in einem dünnen Abschnitt der Oberhaut injizieren und zu vermeiden Drücken der Nadelo tief in den Brustkorb. </li><li> Sobald die Nadel ist vorhanden, blasen die Flüssigkeit in der Mücke. Die gewünschte Menge kann durch Überwachen des Flüssigkeitsmeniskus in der Nadel bestimmt werden. Die Anzahl von Millimetern, die für eine spezifische Volumen durch Berechnen der Zylindervolumen der Glaskapillare Nadel (&amp;pgr; r 2 h) bestimmt werden. Die wirksame Menge an dsRNA, die typischerweise für die Injektion verwendet wird, ist 1 ug. </li><li> Sobald die Flüssigkeit in Mücke injiziert wird, einfahren vorsichtig die Nadel. Wenn ein großer Flüssigkeitströpfchen bildet sich auf der Außenseite des Thorax, sollte die Stechmücke verworfen werden. Dann wiederholen Sie diesen Vorgang beim nächsten Stich. </li></ol> 5. Mosquito Rückgewinnung und Speicherung <ol><li> Nach der Injektion setzen die Moskitos in einem Behälter für die Lagerung. Zum Beispiel, gesäumt ein Pint Wachs Pappbecher (Suppentassen) mit Mesh-Abdeckung mit dem Pappdeckel gesichert. Der Deckel hat ein Abschnitt aus der Netzbezug ausgesetzt werden geschnitten. Sobald die gesamte Mosquitoes im Container platziert werden, platzieren Sie den Behälter in einer kontrollierten Umweltbedingungen Kammer für die Inkubation und bieten die Moskitos mit einer Nahrungsquelle, wie z. B. 20% Saccharose getränkten Wattebausch auf der Oberseite des Mesh-Abdeckung platziert. Vor der Durchführung der In-vivo-Assay Diurese, nehmen die dsRNA-injizierten Moskitos einer Wasserquelle für 12 Stunden, um die Hydratation Zustand jedes Moskito standardisieren. </li><li> Die Effizienz der dsRNA-vermittelte Gen-Knockdown kann variabel sein. Gen-Silencing konnte 1 Tag nach der Injektion beginnen und es könnte bis zu 6 Tage nach der Injektion 4. Der optimale Zeitpunkt, um maximale Gen Knockdown erreichen muss empirisch für jedes Gen verwendet wird, bestimmt werden. Generell warten wir 3 Tage nach dsRNA Injektion, bevor wir fortfahren. </li></ol> Teil II - In-vivo-Assay Diurese bei erwachsenen Stechmücken Aedes aegypti Hinweis: Dieses Protokoll wurde von den Autoren entwickelt worden undverwendet für die RNAi-vermittelte Knockdown von Aquaporin-Proteine ​​in der Gelbfieber-Mücke Aedes aegypti ein. Um die Variabilität zwischen den einzelnen Mücken zu vermeiden, sollte Moskitos in Gruppen analysiert werden. Aus technischen Gründen, empfehlen wir Gruppen von 5 Mücken pro Behandlung - gibt es eine begrenzte Menge an Zeit, um die erste Messung durchzuführen Gewicht vor Mücken, Urin auszuscheiden nach der Injektion beginnen. 6. Sammeln und Anesthetize Moskitos <ol><li> Vor der Sammlung des Moskitos, nimmt das Gewicht von einem leeren Sammlung Fläschchen mit einer Kappe mit einer analytischen Präzisionswaage. Diese Ampulle wird für alle folgenden Messungen verwendet werden. </li><li> Sammelt 5 weiblichen Mücken in den tarierten Sammlung Fläschchen mit einem Aspirator. Legen Sie die Kappe über dem Fläschchen Sammlung und lassen Sie es auf der CO 2-Pad sitzen für ein paar Sekunden, um die Mücken zu betäuben. </li></ol> 7. Erste Gewichtsmessung <ol><li> Nehmen Sie ter Einwaage Messung der 5 Mücken, indem Sie die Sammlung Fläschchen mit den Moskitos mit der Kappe auf der Präzisionswaage. </li><li> Berechnen Sie das Gewicht der Gruppe von 5 Mücken, indem sie das Gewicht der Moskitos und die Sammlung Fläschchen mit Kappe und Subtraktion des Gewichts des leeren Sammlung Fläschchen mit Kappe. </li><li> Öffnen Sie die Sammlung Fläschchen und legen die Mücken direkt an der CO 2-Pad nach der Aufnahme des Gewichts der Mücken. Wenn die Moskitos beginnen zu erwachen während der Gewichtsmessung, stellen Sie die Flasche auf den CO 2-Pad für einige Sekunden vor dem Öffnen und Platzieren der Moskitos auf dem Pad. </li></ol> 8. Injektionspräparat <ol><li> Richten Sie das Mikro-Injektor nach den Anweisungen in der RNAi-vermittelten Gen-Knockdown-Protokoll gegeben. </li><li> Stellen Sie ein Glas Kapillarnadel im Mikro-Injektor und brechen Sie die Spitze der Nadel ab, so dass die Breite ist groß genug für Liquid ungehindert durchfließen. </li><li> Tauchen die Nadel in PBS-Puffer und stellt den Puffer in der Injektionsnadel, ist die gewünschte Menge für dieses Protokoll verwenden 1,25 l PBS für jedes Moskito. Hinweis: Dieser Betrag ahmt die durchschnittliche Menge an Blutplasma, die sich von einer weiblichen Stechmücke 5 getroffen wird. </li></ol> 9. Mosquito Injection <ol><li> Richten Sie die Moskitos um eine leichtere Bedienung mit dem Mikro-Injektor ermöglichen. </li><li> Sobald die Nadel ist vorhanden, blasen PBS-Puffer in der Mücke. </li><li> Sobald die Flüssigkeit in der Mücke injiziert wird, kann ein Tröpfchen an der Außenseite des Thorax zu bilden. Diese Tropfengröße muss sorgfältig vor dem nächsten Schritt entfernt werden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang Injektion beim nächsten Stich. Mit zunehmender Erfahrung werden Moskito-Überlebensrate fast 100% betragen nach der Injektion. </li></ol> 10. Mit einem Gewicht Moskitos <ol><li> Nach der Injektion ist, setzen Sie die Moskitos in der Sammlung Fläschchenund Kappe. Machen Sie den ersten Gewichtsmessung der 5 Mücken, indem Sie die Sammlung Fläschchen mit den Moskitos mit der Kappe auf der Präzisionswaage. </li><li> Berechnen Sie das Gewicht der Gruppe von 5 Mücken, indem sie das Gewicht der Mücken und der Sammlung Fläschchen mit Kappe und subtrahieren das Gewicht des leeren Sammlung Fläschchen mit Kappe. Hinweis: Moskitos beginnt, Urin innerhalb von 2 Minuten nach Entnahme aus dem CO 2-Betäubung Pad ausscheiden, so ist es wichtig, das Gewicht Messung vorzunehmen, bevor sie ausscheiden zu starten. </li><li> Platzieren Sie Moskitos in einem kleinen Container, in dem sie beginnen, Urin ausscheiden wird. </li></ol> 11. Zweite und die folgenden Maße Gewicht Hinweis: Gewicht Messungen der Moskitos sollte in Intervallen von 30 Minuten genommen werden, aber dies kann zu kürzeren oder längeren Abständen, je nach Exkretionsraten eingestellt werden. <ol><li> Nach 30 Minuten sammeln die Group von 5 Moskitos mit einem Aspirator in der gleichen Sammlung Fläschchen mit Kappe. Machen Sie den nächsten Gewichtsmessung der Mücken, indem Sie die Sammlung Fläschchen mit den Moskitos mit der Kappe auf der Präzisionswaage. </li><li> Nach der Messung, platzieren Sie die Mücken im gleichen Betrieb Behälter für die nächsten 30 Minuten. </li><li> Dieser Vorgang wird für eine gewünschte Zeitspanne. </li></ol> 12. Bestimmen Mosquito Ausscheidungsrate <ol><li> Die Gesamtmenge an Flüssigkeit, die in der Gruppe von 5 Moskitos injiziert wurde, kann durch Subtrahieren des ursprünglichen Gewichts des Moskitos aus dem Gewicht unmittelbar nach der Injektion zu berechnen. </li><li> Die Menge an Urin, die durch die Gruppe von Moskitos zu einem bestimmten Zeitpunkt wurde ausgeschieden werden durch Subtrahieren des ursprünglichen Gewichts des Moskitos aus dem Gewicht der Moskitos in dem bestimmten Zeitpunkt berechnet werden. </li><li> Die Ausscheidungsrate zu einem bestimmten Zeitpunkt durch Dividenden berechnet werdenDing die Menge an Urin zu diesem Zeitpunkt durch die Gesamtmenge an Flüssigkeit injizierten (Tabelle 1) ausgeschieden. </li></ol> 13. Repräsentative Ergebnisse RNAi-vermittelte Gen-Ausschaltung und in vivo-Assays haben Diurese durch die Hansen-Labor verwendet worden, um die Auswirkungen der Aquaporine in Aedes aegypti Diurese zu studieren. Drei Aquaporine, die in Aedes aegypti Malpighischen Gefäßen exprimiert werden, wurden mit erheblichen Auswirkungen auf die Ausscheidung Preise im Vergleich zu Stechmücken 1 zu kontrollieren klopfte. Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse eines Experiments, wo die Diurese Assay verwendet wurde, um die Ausscheidung Raten zwischen Aedes aegypti und Culex quinquefasciatus vergleichen bei verschiedenen Temperaturen. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Flussdiagramm des RNAi-/ Diurese Assay. 5 Gruppen von 10 Mücken each sind mit dsRNA für eine bestimmte Gen injiziert und weitere fünf Gruppen von jeweils zehn Mücken sind mit Kontroll-dsRNA injiziert. Eine weitere Gruppe von Mücken mit 200 pM HgCl 2 in PBS injiziert wird als eine positive Kontrolle verwendet. Diese Mücken sind vor der Injektion und nach der Injektion in 30 Minuten Intervallen für 3 Stunden gewogen. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Eine einfache Mikro-Injektion Gerät für die RNAi-vermittelte Gen-Knockdown-und in vivo-Assay Diurese. A. Die Glaskapillare Injektionsnadeln verwendet. Das graue Dreieck steht für die Millimeter-Schritten auf der Nadel gezogen, um die Menge an Flüssigkeit injiziert in der Mücke zeigen. B. 1 ml Spritze benutzt, um die Mikro-Injektor zu konstruieren. Das weiße Dreieck stellt die Nadelnabe und der schwarze Dreieck stellt das Gummikolben Kopf an dem Kolben in der Spritze. C. Der Schlauch verwendet, um das Mundstück zu befestigender Injektor. D. 1 ml Einweg-Pipettenspitze (blaue Spitze), die als Sprachrohr der Mikroinjektion Gerät verwendet wird. E. Die Mikroinjektion Gerät, das AD Teile enthält. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Optimale Moskito Injektionsstelle. A. Weibliche Mücke Aedes aegypti mit einer Glaskapillare Nadel zwischen den großen Schuppen am Thorax injiziert. Der schwarze Balken zeigt 1 mm zum Größenvergleich. B. Eine Zeichnung des weiblichen Stechmücke Thorax und die weißen Flecken repräsentieren die weißen Schuppen in der Mücke Exoskelett. Die Injektionsnadel muss die Mücke stechen zwischen den Spots zu Sterblichkeitsrate während der Injektion zu minimieren. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Auswirkungen von Temperaturtur auf Culex quinquefasciatus und Aedes aegypti Diurese. Die Diurese Assay wurde mit zwei Arten von Stechmücken, Aedes aegypti und Culex quinquefasciatus durchgeführt, bei verschiedenen Temperaturen. Die Ausscheidungsrate während der ersten Stunde nach der Injektion wird in Prozent angegeben. <table border="1"><tbody><tr><td> Gruppe </td><td> TARA (G) </td><td> nicht gespritzt (G) </td><td> nach der Injektion (G) </td><td> 1h nach der Injektion (G) </td><td> Durchschnittsgewicht (mg) </td><td> Mengen injiziert (Ul) </td><td> Menge ausgeschieden (Ul) </td><td> % Ausgeschieden </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7,5938 </td><td> 7,6057 </td><td> 7,6104 </td><td> 7,6096 </td><td> 2,38 </td><td> 0,94 </td><td> 0,16 </td><td> 17,0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7,8252 </td><td> 7,8349 </td><td> 7,8415 </td><td> 7,8403 </td><td> 1,94 </td><td> 1,32 </td><td> 0,24 </td><td> 18,2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7,8896 </td><td> 7,9026 </td><td> 7,9077 </td><td> 7,906 </td><td> 2,6 </td><td> 1,02 </td><td> 0,34 </td><td> 33,3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Aedes aegypti in vivo Diurese Testergebnisse. Rohdaten aus den in vivo-Assay mit Diurese Aedes aegypti weibliche Moskitos bei 4 ° C

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	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. 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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die RNAi-Protokoll verwendet wurde im Labor von Alexander Raikhel wurde an der University of California Riverside 6,7 entwickelt und ist vergleichbar mit einem Protokoll, das von Garver und Dimopoulos 4 veröffentlicht. Der experimentelle Ansatz in diesem Video-Protokoll gezeigt werden verwendet, um Gene in Insektenzellen Diurese in einem in-vivo-Umgebung verwickelt zu werden. Die Ausscheidungsorgane der Insekten, die Malpighischen Gefäßen, haben das Interesse von Generationen v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 High-Yield-Kit </td><td> Ambion, Inc. </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-Puffer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Kunststoffschlauch </td><td> Lokale Anbieter </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml Kunststoff-Pipettenspitze </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Blaue Spitze </td></tr><tr><td> 1 ml-Spritze </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Schere </td><td> Lokale Anbieter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metall-Nadel </td><td> Carolina Biologicals </td><td> 654307 </td&gt; <td> Größe 5 </td></tr><tr><td> Fly-Pad </td><td> Genesee Scientific </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Batteriebetriebene Aspirator w / Sammelfläschchen </td><td> Upma Labs </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Feine Spitze Pinzette </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Glaskapillare Nadeln </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Stereo Dissektionsmikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Analytische Präzisionswaage </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Ein Pint gewachst ausgekleideten Karton Tassen </td><td> Lokale Anbieter </td><td></td><td> Hergestellt Suppentassen </td></tr><tr><td> Mesh-Netz </td><td> Lokale Anbieter </td><td></td><td> Kunststoff-fly Gaze </td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

Dieses Video demonstriert Protokoll eine effektive Technik, um ein bestimmtes Gen in einer Insekten und die Durchführung einer neuartigen Bioassay zur Ausscheidung zu messen. Diese Methode kann verwendet werden, um ein besseres Verständnis des Prozesses der Diurese bei Insekten erhalten werden und ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Diurese in blutsaugende Arthropoden, die aufnehmen können große Mengen an Flüssigkeit in einem einzigen Blutmahlzeit sind. Das RNAi-vermittelten Gen Knockdown mit einem In-vivo-Assay kombiniert Diurese wurde von der Hansen-Labor entwickelt, um die Effekte der RNAi-vermittelte Reduktion von Aquaporin-Gene auf Aedes aegypti Moskito Diurese 1 studierst. Das Protokoll ist Setup in zwei Teile: der erste Beispiel demonstriert, wie man ein einfaches Moskitonetz Injektionsgerät konstruieren und zur Vorbereitung und injizieren dsRNA in den Brustkorb von Mücken für RNAi-vermittelte Gen-Knockdown. Das zweite Beispiel demonstriert, wie Sie feststellen,Ausscheidung in Moskitos mit einem In-vivo-Bioassay.

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In diesem Protokoll kombinieren wir RNAi-vermittelte Gen-Silencing mit ein<em&gt; In-vivo-</em&gt; Diurese Assay, um die Auswirkungen Knockdown von Genen von Interesse Studie wurde auf Moskito-Flüssigkeit ausgeschieden.

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

13.4K Aufrufe.  New Mexico State University. In diesem Protokoll kombinieren wir RNAi-vermittelte Gen-Silencing mit ein In-vivo- Diurese Assay, um die Auswirkungen Knockdown von Genen von Interesse Studie wurde auf Moskito-Flüssigkeit ausgeschieden.

Serie: RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Die Injektion von dsRNA in Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Forschung

Biologie

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

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Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

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Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection der Dünndarm-und Speicheldrüsen von Ae. aegypti Moskitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Fetten Körper Kultur Organsystem in Aedes Aegypti, Überträger von Zika-Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...