Arbeiten Sie auf der Autoren Labor wurde von USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213) unterstützt worden; NIH / NCRR (2 RR17359 R01-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) und Alberta Innovates - Health Solutions.

TEIL A. Germ-Transplantation bei Mäusen 1. Herstellung von Empfängermäuse <ol><li> Die Empfänger sollten immunologisch tolerant (entweder genetisch an die Spender oder immundefizienten abgestimmt) an die Spender Hoden-Zellen. </li><li> Die Empfänger sollten entweder von Natur aus frei von Spermatogenese (zB W / W v Mäuse) oder abgereichertes endogener Keimzellen. Germ Zell-Depletion kann durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika wie Busulfan erreicht werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verfahren zur Herstellung von Empfängermäuse mit Busulfan. </li><li> Gönnen Empfänger bei 4-6 Wochen alt durch ip-Injektion von Busulfan. Die optimale Dosis von Busulfan ist Belastung abhängig. In häufigsten verwendeten Rezipientenstämme, ist eine Dosis von 40-50 mg / kg ausreichend ist, um endogenen Keimzellen (zB 44 mg / kg für Nacktmäuse, 50 mg / kg für B6/129 F1 Empfänger). Führen </li><li> Pulver auflösen Busulfan in DMSO und fügen Sie dann ein gleiches Volumen an sterilem destilliertem Wasser to tätigt eine abschließende Konzentration von 4 mg / ml. Halten Sie warme Lösung bei 35-40 ° C zu verwenden, um vor Fällung von Busulfan zu vermeiden. Entsorgen Lösung, wenn Niederschläge zu beobachten ist. </li><li> Nach Busulfan Behandlung, mindestens einen Monat vor der Verwendung die Empfänger zu ermöglichen. Die Empfänger können zwischen 1 Monat und 3 Monate nach der Busulfan Behandlung verwendet werden. </li></ol> 2. Herstellung von Mikroinjektion Pipetten <ol><li> Wählen Sie Borosilikatglas Pipetten (Kapillarröhrchen) mit einem 1,0 mm Außendurchmesser, einer 0,75 mm Innendurchmesser, und einer Länge von 3 Zoll. </li><li> Silikonisieren Glaspipetten mit Sigmacote gründlich Pipetten mit Methanol und trocken blasen. </li><li> Ziehen Sie die Pipette mit einer Pipette Abzieher. Verschiedene Pipette Abzieher Maschinen haben unterschiedliche Einstellungen, daher ein paar Einstellungen zu testen. Im Allgemeinen kann ein Setting ähnlich dem, dass zur Herstellung Enukleation verwendeten Pipetten arbeiten. </li><li> Brechen Sie die Pipettenspitzen unter Seziermikroskop vor dem Gebrauch auf einen Durchmesser von etwa 50 um zu erreichenan der Spitze. </li></ol> 3. Herstellung von Spenderzellen für die Transplantation <ol><li> Choise von Donor-Stamm ist abhängig von der experimentellen Frage und untersucht. Wenn Quantifizierung der Spermatogenese als Endpunkt benutzt wird, muss der Spender mit einem leicht identifizierbaren genetischen Marker wie Lac-Z (zB B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J vom Jackson Laboratory) oder GFP (zB C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J vom Jackson Laboratory). </li><li> Planen Sie 7 ml Collagenase in DMEM bei 1 mg / ml, 4 ml Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin zzgl. 1 mM EDTA), und 2 ml DNase in DMEM bei 7 mg / ml. Dieser Betrag ist für die Verdauung von 2 Spender Mäusehoden. </li><li> Sammle Hoden aseptisch und entfernen Sie die Tunica albuginea. Spread-Hodenkanälchen vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um enzymatische Verdauung zu erleichtern. </li><li> Transfer-Tubuli in Kollagenase, bei 37 ° C für 5-10 min, und häufig schütteln inkubieren. </li><li> Waschen Sie Tubuli zweimal durch Spinnen (200-300 g für 3 min) und Resuspendieren in PBS w / o Ca 2 + + </sbis&gt;. </li><li> Resuspendieren Tubuli in Trypsin-EDTA und schütteln, bis sie klebrig und trübe geworden. Überwachen Sie die Verdauung von Tubuli bei 37 ° C, da sollte in 1-2 min auftreten. </li><li> Fügen Sie DNase und gut schütteln. Inkubieren Sie für 1-2 min. </li><li> Zusatz von 3 ml FBS, um die Aktion von Enzymen zu stoppen. </li><li> Einschränken Zellsuspension unter Verwendung eines Nylon Netzkappe mit 40-70 &amp;mgr; m Porengröße zu Zelle / Gewebe Brocken zu entfernen. </li><li> Collect-Zellen bei 600 g für 5 min und erneut zu suspendieren Zellen in einem kleinen Menge von DMEM (&lt;100 ul). </li><li> Zählen von Zellen und die Lautstärke auf einen gewünschten Endkonzentration (in der Regel 100 x 10 6). Halten Sie Zellsuspension auf Eis vor der Verwendung. </li><li> Jeder Busulfan-behandelten Maus Hoden wird mit nur 10-15 ul Zellsuspension gefüllt werden. Aufgrund möglicher Abfall-und Auslaufen, zielen darauf ab, 30-50 ul pro Hoden haben. </li></ol> 4. Transplantation Verfahren (Abbildung 1) <ol><li> Betäuben Empfänger nach genehmigten Protokollen. </li><li> Platz in RückenlageLiegen und chirurgisch bereiten den Bauchbereich. Machen Sie einen ~ 1cm Mittellinie Bauchschnitt, um die Bauchdecke entlarven. Heben Sie Bauchdecke mit Hilfe von kleinen Zangen an der Stelle der weißen Linie zu vermeiden, versehentlich verletzt Bauchorgane, und fahren Sie mit einem ~ 0,5 cm lange Inzision in der Mittellinie der Bauchwand, die Bauchhöhle aussetzen zu machen. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um die Iris Bauchdecke halten, und verwenden Sie ein anderes Paar von Iris Zange für die Fettpolster an den Nebenhoden und Hoden in der Bauchhöhle zu suchen. Ziehen Sie das Fettpolster heraus, bis der Hoden wird entäußert und die Hoden und Nebenhoden Arterie sind deutlich sichtbar. Arbeit an einem Hoden auf einmal. </li><li> Legen Sie eine dünne sterile Abdeckung von autoklavierten Karteikarten unter dem Fettpolster / Hoden für eine bessere visuelle Identifizierung (optional) gemacht. Der Faltenwurf funktioniert auch, um Flüssigkeit zu absorbieren. </li><li> Einen Tropfen Trypanblau in die Zellsuspension vorsichtig und laden Sie die Zellsuspension in das Polyethylenlene einen Schlauch mit einer 1 ml Spritze verbunden ist. Befestigen Sie die gezogen Pipette in der Rohrleitung und sanft zwingen die Zelle Suspension in der Pipette durch Aufbringen von Druck auf die Spritze auf. </li><li> Identifizieren Sie die Ausführungsgänge (die die Hoden auf den Nebenhoden verbinden) und entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe rund um die Kanäle. Arbeiten Sie sorgfältig, wie die Kanäle und die Membran um sie durchscheinend sind. </li><li> Stecken Sie vorsichtig mit der Pipette in einen Kanal im Bündel Ausführungsgänge, sanft fädeln einige mm in Richtung der Hoden. </li><li> Während Vermeidung von bewegten die Injektionspipette, für die Spritze zu erreichen, sanft drücken Sie den Kolben der Spritze um sicherzustellen, dass die Suspension in den Rete testis und Tubuli seminiferi strömt anfangen zu füllen. </li><li> Die Injektionsrate und den Fluss von Zellsuspension wird mit dem Daumen Druck reguliert wird. Vermeiden Sie plötzliche Erhöhung des Drucks; Kontrolle der Beförderung Suspension in Tubuli. </li><li> Stoppen Sie die Injektion wenn fast alle Oberflächen Tubuli gefüllt wurden, bevor die Hoden beginnt become ischämischen. </li><li> Bringen Sie den Hoden in die Bauchhöhle. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Hoden. Nähen Sie die Bauchdecke mit 6-0 Seidenfaden und schließen Sie die Haut mit Metall Wundklammern. Überwachen Mäuse auf einem Pad Erwärmung bis zur vollständigen Genesung. </li></ol> 5. Die Analyse der Empfänger Hoden <ol><li> Erlauben Sie 2-4 Monate nach der Transplantation vor der Analyse. </li><li> Einschläfern den Empfänger Maus nach Tier in Pflege und Gebrauch Richtlinien und sammeln die Hoden und Nebenhoden in PBS. Wenn ein Lac-Z-transgenen Donor-Stamm verwendet worden ist, kann der Nebenhoden als positive Färbung Kontrolle verwendet werden, da es endogene Beta-Galactosidase-Aktivität aufweist. </li><li> Für den Nachweis von Spenderzellen durch Lac-Z-Färbung, beheben den Hoden für 1-2 Stunde bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Spülen Sie 3 x 30 min bei Raumtemperatur in lacZ Pufferspülgang. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in LacZ-Färbung Lösung. Hoden kann als Ganzes oder nach dem Dispergieren gefärbt werdendie Tubuli. </li><li> Fix und lagern in 10% neutral gepuffertem Formalin. Sofern Teile benötigt werden, verwenden neutrale schnell rot als Gegenfärbung. </li></ol> TEIL B. ektopische Xenografting bei Mäusen (Von Dobrinski und Rathi 2008 15, und Rodriguez-Sosa et al. 2011 16). 1. Sammlung von Spendergewebe <ol><li> Erhalten Hodengewebe durch Kastration oder Biopsie von einem Spender männlich. </li><li> Ort Hoden in PBS oder Biopsien in Kulturmedium, die Aufrechterhaltung sterilen Bedingungen. </li><li> Halten Sie das gesammelte Gewebe auf Eis und Transport ins Labor. </li></ol> 2. Herstellung von Spendergewebe <ol><li> Führen Sie in der Gewebekulturabzug zur Aufrechterhaltung der Sterilität. </li><li> Waschen Sie jeden Hoden in eiskaltem PBS mit Antibiotika zwei bis drei Mal vor der Übertragung in eine Kultur-Schale mit PBS. Im Falle von Biopsien, waschen Hoden Fragmente zwei-bis dreimal mit eiskaltem Kultur medium die Antibiotika enthalten, durch Drehen bei 150g für 2 min und Resuspendieren in frischem eiskaltem Kulturmedium. </li><li> Für intakte Hoden entfernen Tunica vaginalis durch einen Einschnitt entlang der Oberfläche und extrudieren die Hoden. Entfernen von Hoden aller Anhang Strukturen (Samenstrang, Nebenhoden, Bindegewebe). Waschen Hoden einmal in kaltem PBS und Überführung in eine Kultur-Schale mit PBS. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Tunica albuginea des Hodens mit einem Skalpell und eine Schere. Wenn der Hoden sehr klein ist, kann die Tunica durch Zusammendrücken des Hodengewebe Stelle von der Tunica durch einen kleinen Einschnitt verfügt am einen Ende, während die Tunica mit einem Paar von kleinen Pinzette am anderen Ende entfernt werden. </li><li> Je nach Größe des Hodens entweder die gesamte Hodengewebe können in kleine Stücke von der Umgebung von 1 zugeschnitten - 2 mm 3 in der Größe unter Verwendung einer gebogenen Pinzette und ein Skalpell-Klinge, oder große Stücke von Hodengewebe kann zunächst aus dem Hoden entfernt werden und dann schneiden in kleinereStück. All dies sollte in eiskaltem Kulturmedium und unter sterilen Bedingungen in einem kleinen Kulturschale (60 x15 mm) erfolgen. </li><li> Übertragen Sie die vorbereiteten Gewebestücke zu eiskaltem Kulturmedium in kleinen Kultur-Gerichte auf Eis, bis Pfropfen. </li></ol> 3. Kastration von Empfängermaus <ol><li> Betäuben Maus wie oben vorbereiten und sterile OP-Feld durch Schneiden der Haare (nicht notwendig in Nacktmäusen), Abreiben mit 70% Ethanol und Betadine Lösung. </li><li> Machen Sie einen 0,5 -1 cm ventralen Mittellinie Hautschnitt, um die Bauchdecke entlarven. </li><li> Sorgfältig Setzen Sie den Hoden, die Hoden und Nebenhoden Arterie wie in TeilA, 4,2-4,3 beschrieben. </li><li> Nehmen Sie den Schwanz der epidydimis aus dem Gubernaculum durch stumpfe Präparation. </li><li> Ligieren der A. testicularis und der Samenleiter gemeinsam mit dem Blutgefäß mit Seide, und Abschnitt die ligierten Strukturen durch Schneiden zwischen den Hoden und der Ligatur. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für das secoND Hoden. </li><li> Nähen Sie die Bauchdecke mit einem oder zwei chirurgischen Nähten. </li><li> Schließen Sie den Hautschnitt mit einem oder zwei Michel-Clips. </li></ol> 4. Ektopische Xenografting <ol><li> Positionieren Sie die Maus im ventralen Liegen und bereiten einen sterilen OP-Feld auf dem Rücken wie oben. </li><li> Je nachdem wie viele Transplantate werden ausschliesslich zum eingefügt (in der Regel 4-8/mouse) werden, machen ~ 0,5 cm lange Hautschnitte auf jeder Seite der Mittellinie der Rückseite der Maus. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um einen Rand der Hautschnitt zu halten, und machen einen Hohlraum, der durch subkutane Hänseleien auseinander das Bindegewebe mit einer Schere. </li><li> Mit Hilfe einer Pinzette Iris Ort ein Stück Hodengewebe tief in das subkutane Hohlraum, hält die Grenze der Hautschnitt mit einem anderen Iris Zange. </li><li> Schließen Sie den Hautschnitt mit einem Michel-Clip und halten der Maus auf Heizkissen, bis er aus der Narkose zu erholen beginnt. </li><li> Übertragen Sie die Maus an einem Käfig mit zusätzlicher Dämmung und CoVer-und Monitor, bis Mäuse werden vollständig erholt. </li></ol> 5. Sammlung von Hoden Xenotransplantate für Analyse-und Samenzellen der Ernte <ol><li> Einschläfern den Host-Maus nach Tierpflege und Leitlinien für die Verwendung, und machen eine Mittellinie Hautschnitt an der Rückseite der Haut ab dem Schwanz an den Hals und offene Haut. Dies macht die Transplantate, die entweder auf dem subkutanen Gewebe lokalisiert werden kann oder an der Haut befestigt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Transplantate unter Verwendung eines Paares Zange und eine Schere. </li><li> Rekordzahl von Transplantaten erholt, Größe und Gewicht der einzelnen Transplantate. </li><li> Herumführen Samenblasen aus dem Bauch der Maus und aufzeichnen ihr Gewicht als Hinweis auf Testosteron-Produktion durch die transplantierten Gewebes. </li><li> Für die histologische Analyse <ol class="lalpha"><li> Suspend-Xenotransplantaten in Probenfläschchen mit Bouin-Lösung (oder andere Fixativ) in einem Volumen ~~~V dass der Xenograft-10x, und Etikett Fläschchen angemessen. </li><li> Bebrütenüber Nacht im Kühlschrank durch Waschen mindestens 3-mal in 70% Ethanol in Abständen von 24 Stunden vorzugsweise gefolgt. </li><li> Gehen Sie für die Bearbeitung und Einbettung in Paraffin. </li></ol></li><li> Für Spermien Ernte <ol class="lalpha"><li> Waschen Sie Xenotransplantate durch Spinnen sie sich an 300g für 1 min und Resuspendieren sie in Kulturmedium mit Antibiotika enthielt. </li><li> Schneiden Sie Transplantate in kleine Stücke hacken und vorsichtig mit der Pinzette in einem Gewebe Kulturschale mit 3 bis 5 ml Kulturmedium. </li><li> Filter zerkleinerte Gewebe durch die Zelle 40 um Sieb. </li></ol></li></ol> TEIL C. repräsentative Ergebnisse 1. Germ-Transplantation Wenn die transplantierten Spender-Zell-Suspension enthält Stammsamenzellen Tragen eines genetischen Markers wie des LacZ-Transgen, Kolonisierung der Spender SSCs in den Empfängerländern Hoden kann durch X-gal-Färbung sichtbar gemacht, wie markanten blauen Segmente des SEMiniferous Tubuli nach 2-3 Monate nach der Transplantation 3 (Abbildung 2A). Eine gut etablierte Kolonie sollte eine lange dunkelblaue Strecke komplett gefüllt Segmente mit zwei oder mehr Schichten von blauen Zellen näher an das Zentrum, und relativ schwächer gefärbte Bereiche an beiden Enden haben, wo ein Netzwerk von einzelnen, gepaart oder kleine Gruppen von blauen Zellen ist ersichtlich, 3 (Abbildung 2B). Ein Querschnitt des dunkelblauen Samenkanälchens Region zeigen sollte, gut etablierte und gut organisierte Spermatogenese mit blauen Keimzellen in verschiedenen Stadien Differenzierung (Abbildung 2C). 2. Hodengewebe Xenografting Die Lebensfähigkeit der Hodengewebe nach der Transplantation ist invers mit der Entwicklungsstufe des Spenders korreliert; das beste Ergebnis wird erzielt, wenn Gewebe von männlichen Neugeborenen verwendet wird, während die adulten Gewebe zeigt eine hohe Tendenz zu degenerieren und sterben 17-21. Im allgemeinen nimmt Xenograft Erfolg als Spendergewebe durchläuft michiosis von der ersten Welle der Spermatogenese. Zeit bis zur vollen Entwicklung der unreifen Spendergewebe und komplette Spermatogenese ist artspezifisch, und oft etwas kürzer im Vergleich mit Hoden in situ. Die Zahl der Hodenkanälchen mit vollständiger Spermatogenese ist variabel je nach Tierart. Während bei Schafen, Ziegen und Schweine, dass Teilnummer größer als 50% ist, in Rinder und Katzen ist es weniger als 15% 14 (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" /> Abbildung 1. Keimzelle Transplantation Verfahren. Platz Empfänger in Rückenlage nach der Narkose und eine ~ 0,4-Zoll-Mittellinie Bauchschnitt (A). Expose Hoden durch die Rücknahme des Fettpolster an den Nebenhoden und Hoden und legen Sie eine dünne sterile Abdeckung unterhalb des Fettpolster / Hoden für eine bessere visuelle Identifizierung (B). Positionieren Sie den Hoden und Nebenhoden, so dass die Ausführungsgänge in das Fettpolster begraben erkennbar sind (C, D, E). IdentifikationUnternehmen die Ausführungsgänge und entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe rund um die Kanäle. Ein Stück farbiges Papier oder Kunststoff können unter die Kanäle für eine bessere Visualisierung (G) abgegeben werden. Break oder schleifen die Pipettenspitze nach Anspruch der hat eine Größe von den Kanälen und Last Zellsuspension in die Pipette (H). Stecken Sie vorsichtig mit der Pipette in einen Kanal im Bündel Ausführungsgänge, sanft fädeln einige mm in Richtung der Hoden (der Pfeil in H zeigt die Richtung der Pipette Injektion und Gewindeschneiden). Ein Hoden mit erfolgreichen Injektion in den Samenleiter wird (I) gezeigt. Ts: Hoden, EP: Nebenhoden. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für Keimzell-Transplantation A) einen injiziert Testis mit X-gal gefärbt. Die blauen Segmente der Samenleiter darstellen etablierten Kolonien aus transgenen Spenders SSCs (LacZ-Transgen). B) Stärkere Vergrößerung eines SSC Kolonie 3 Monate nach der Transplantation. The dunkelblau Region in der Mitte stellt komplette Spermatogenese und die hellblauen Regionen an den Enden repräsentieren wachsenden Ausdehnung der Kolonie. C) einem histologischen Schnitt des dunkelblauen Samenkanälchens (3 Monate nach der Transplantation) zeigt gut organisiert Spermatogenese. Maßstabsbalken in B und C sind 200 um und 30 um jeweils. (Zahlen aus Annu Rev Cell Dev. Biol. angepasst 2008;. 24:263-86 und Biol Reprod Juni 1999;. 60 (6) :1429-36). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ektopische Xenografting von unreifen Hodengewebe von Großtieren in immundefizienten Mäusen. Fragmente von unreifen Hoden Spender (~ 1 mm 3) unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen (A) transplantiert werden können, um zu überleben und reagieren auf Maus Gonadotropine. Als ein Ergebnis erfährt Testisgewebe komplette Entwicklung, einschließlich der Bildung der Befruchtung zuständigen Spermien (B). Sobald Hoden Xenotransplantate werden gesammelt (C)sie können für die Analyse oder zu Spermien (D) für ICSI (E) und Embryo-Erzeugungseinheiten (F) zu erhalten verwendet werden. Bars gleich 50 um (B, E und F) oder 10 um (D). (Geändert von Rodriguez-Sosa und Dobrinksi 2009 14).

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R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta1-+and+alpha6-integrin+are+surface+markers+on+mouse+spermatogonial+stem+cells.">beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD9+is+a+surface+marker+on+mouse+and+rat+male+germline+stem+cells.">CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).</li><li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+and+niche+microenvironment+on+spermatogonial+stem+cell+self-renewal.">Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).</li><li>Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+Plzf+in+maintenance+of+spermatogonial+stem+cells.">Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells.</a> Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).</li><li>Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV5+is+required+for+continuous+spermatogenesis+in+adult+mice+and+may+mediate+blood+testes+barrier+function+and+testicular+immune+privilege.">ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).</li><li>Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+transplantation+of+porcine+testis+tissue.">Preservation and transplantation of porcine testis tissue.</a> Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).</li><li>Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cold+storage+and+cryopreservation+of+immature+non-human+primate+testicular+tissue+on+spermatogonial+stem+cell+potential+in+xenografts.">Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts.</a> Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).</li><li>Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+testicular+tissue+from+infant+monkeys+after+xenografting+into+mice.">Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice.</a> Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).</li><li>Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+maturation+of+primate+testis+by+xenografting+into+mice.">Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice.</a> Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

1. Germ-Transplantation Keimzell-Transplantation bietet die einzig funktionierende Assay für eindeutige Bestätigung der Gegenwart von spermatogonialen Stammzellen (SSC) in einer Zellpopulation. Nur SSCs können nach Hause zu besiedeln und die SSC-Nische an der Basalmembran und initiieren Donor-derived Spermatogenese. Keimzelle der Transplantation war es möglich, zu studieren und zu manipulieren SSCs in beispielloser Weise. Die Technik wurde genutzt, um transgene Tiere durch genetische Manip...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Collagenase (Typ IV) </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Trypanblau-Färbung </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td></tr><tr><td> Nylon Mesh Zellsieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 (40 um) 352350 (70μm) </td></tr><tr><td> Busulfan </td><td> Sigma </td><td> B2635 </td></tr><tr><td> Dünnwand Glaskapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> TW 100-3 </td></tr><tr><td> BD Intramedic plyethylene Schlauch (PE 100) </td><td> BD </td><td> CA-63018-725 </td></tr><tr><td> Ethicon 6-0 Seidennaht </td><td> Ethicon </td><td> 706g </td></tr><tr><td> Wundklammern </td><td> BD </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Sigma </td><td> B4252 </td></tr><tr><td> Kaliumferrocyanid </td><td> Sigma </td><td> P9387 </td></tr><tr><td> Kaliumferricyanid </td><td> Sigma </td><td> P3667 </td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Sigma </td><td> 208337 </td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamid </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma </td><td> 18896 </td></tr></tbody></table>

germ cell transplantation and testis tissue xenografting in mice

Keimzelle der Transplantation wurde von Dr. Ralph Brinster und Kollegen an der University of Pennsylvania im Jahr 1994 1,2 entwickelt. Diese bahnbrechenden Studien zeigten, dass die Mikroinjektion von Keimzellen von Mäusen fruchtbaren Spender in die Samenleiter des unfruchtbaren Empfängermäuse Ergebnisse in Donor abgeleitete Spermatogenese und Spermien durch den Empfänger Tier 2. Die Nutzung von Spender männlichen Trägern die bakterielle β-Galactosidase-Gen erlaubte die Identifizierung Donor abgeleitete Spermatogenese und Übermittlung des Donor Haplotyp an die Nachkommen durch den Empfänger Tiere 1. Überraschenderweise, nach der Transplantation in das Lumen der Tubuli seminiferi, waren transplantierten Keimzellen in der Lage, von der luminalen Kompartiment zu dem Basalmembran, wo Spermatogonien 3 angeordnet sind zu bewegen. Es ist allgemein anerkannt, dass nur SSCs der Lage, die Nische und wieder herzustellen Spermatogenese in den Hoden zu kolonisieren Empfänger sind. Daher KeimzelleTransplantation bietet einen funktionalen Ansatz, um die Stammzell-Nische in den Hoden zu studieren und zu vermeintlichen Stammsamenzellen charakterisieren. Bis heute ist Keimzelle Transplantation verwendet werden, um grundlegende Stammzellbiologie aufzuklären, um transgene Tiere durch genetische Manipulation der Keimzellen vor der Transplantation 4,5 zu produzieren, zu Sertoli-Zell-Interaktion Keimzelle 6,7, SSC Homing und Kolonisierung 3-Studie 8, sowie SSC Selbsterneuerung und Differenzierung 9,10. Germ-Transplantation ist auch in großen Spezies 11 machbar. In diesen sind die Hauptanwendungen Erhaltung der Fruchtbarkeit, die Verbreitung von Elite Genetik in Tierpopulationen, und die Erzeugung von transgenen Tieren, wie die Studie der Spermatogenese und SSC Biologie mit dieser Technik ist, logistisch schwieriger und teurer als bei Nagern. Die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten in die Samenleiter von Mäusen führt zu colonization von Spenderzellen und Spermatogonien Expansion, aber nicht in ihrer vollen Differenzierung vermutlich aufgrund der Inkompatibilität des Empfängers somatische Zell-Kompartiment mit den Keimzellen von phylogenetisch entfernten Spezies 12. Ein alternativer Ansatz ist die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten zusammen mit den sie umgebenden somatischen Fach. Zunächst berichtete im Jahr 2002, dass kleine Fragmente von Hodengewebe aus unreifen Männchen unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen transplantiert in der Lage, zu überleben und zu unterziehen volle Entwicklung mit der Produktion von Spermien Befruchtung zuständig sind 13. Seitdem Hodengewebe Xenografting hat sich gezeigt, dass bei vielen Arten erfolgreich und entpuppte sich als wertvolle Alternative zu Hodenentwicklung und Spermatogenese der großen Tiere bei Mäusen 14 zu studieren.

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Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Protokolle für die Keimzelle der Transplantation und Hodengewebe Xenografting werden beschrieben. Germ-Transplantation führt zu Donor-derived Spermatogenese in den Empfängerländern Hoden und eine funktionelle Rekonstitution Assay für die Identifizierung von Spermatogonien-Stammzellen (SSC). Hodengewebe Xenografting reproduziert Hodenentwicklung und Spermatogenese verschiedener Spender Arten in Empfängermäuse.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.6K Aufrufe.  University of Calgary. Protokolle für die Keimzelle der Transplantation und Hodengewebe Xenografting werden beschrieben. Germ-Transplantation führt zu Donor-derived Spermatogenese in den Empfängerländern Hoden und eine funktionelle Rekonstitution Assay für die Identifizierung von Spermatogonien-Stammzellen (SSC). Hodengewebe Xenografting reproduziert Hodenentwicklung und Spermatogenese verschiedener Spender Arten in Empfängermäuse.

Serie: Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Heterotopic Heart Transplantation in Mice

The mouse heterotopic heart transplantation has been used widely since it was introduced by Drs. Corry and Russell in 1973. It is particularly valuable for studying rejection and immune response now that newer transgenic and gene knockout mice are available, and a large number of immunologic reagents have been developed. The heart transplant model is less stringent than the skin transplant models, although technically more challenging. We have developed a modified technique and have completed over 1000 successful cases of heterotopic heart transplantation in mice. When making anastomosis of the ascending aorta and abdominal aorta, two stay sutures are placed at the proximal and distal apexes of recipient abdominal aorta with the donor s ascending aorta, then using 11-0 suture for anastomosis on both side of aorta with continuing sutures. The stay sutures make the anastomosis easier and 11-0 is an ideal suture size to avoid bleeding and thrombosis.
When making anastomosis of pulmonary artery and inferior vena cava, two stay sutures are made at the proximal apex and distal apex of the recipient s inferior vena cava with the donor s pulmonary artery. The left wall of the inferior vena cava and donor s pulmonary artery is closed with continuing sutures in the inside of the inferior vena cava after, one knot with the proximal apex stay suture the right wall of the inferior vena cava and the donor s pulmonary artery are closed with continuing sutures outside the inferior vena cave with 10-0 sutures. This method is easier to perform because anastomosis is made just on the one side of the inferior vena cava and 10-0 sutures is the right size to avoid bleeding and thrombosis. In this article, we provide details of the technique to supplement the video.

The mouse heterotopic heart transplantation model has been proven by many investigators to be an important method for studying mechanisms of rejection and immune response. However, the techniques involved are still challenging. By modifying standard techniques we have had success with more than 1000 transplants.

Heterotope Herztransplantation in Mäuse

The mouse heterotopic heart transplantation has been used widely since it was introduced by Drs. Corry and Russell in 1973. It is particularly valuable ...

Small Bowel Transplantation In Mice

Since 1990, the development of tacrolimus-based immunosuppression and improved surgical techniques, the increased array of potent immunosuppressive medications, infection prophylaxis, and suitable patient selection helped improve actuarial graft and patient survival rates for all types of intestine transplantation. Patients with irreversible intestinal failure and complications of parenteral nutrition should now be routinely considered for small intestine transplantation. However, Survival rates for small intestinal transplantation have been slow to improve compares increasingly favorably with renal, liver, heart and lung. The small bowel transplantation is still unsatisfactory compared with other organs. Further progress may depend on better understanding of immunology and physiology of the graft and can be greatly facilitated by animal models. A wider use of mouse small bowel transplantation model is needed in the study of immunology and physiology of the transplantation gut as well as efficient methods in diagnosing early rejection. However, this model is limited to use because the techniques involved is an extremely technically challenging. We have developed a modified technique. When making anastomosis of portal vein and inferior vena cava, two stay sutures are made at the proximal apex and distal apex of the recipient s inferior vena cava with the donor s portal vein. The left wall of the inferior vena cava and donor s portal vein is closed with continuing sutures in the inside of the inferior vena cava after, after one knot with the proximal apex stay suture the right wall of the inferior vena cava and the donor s portal vein are closed with continuing sutures outside the inferior vena cave with 10-0 sutures. This method is easier to perform because anastomosis is made just on the one side of the inferior vena cava and 10-0 sutures is the right size to avoid bleeding and thrombosis.  In this article, we provide details of the technique to supplement the video.

The mouse small bowel transplantation model has been recognized as an important tool to study mechanismes of immune rejection and screen new immunosuppressive drugs. However, this model is limited to use because the techniques involved is an extremely technically challenge. Now we introduce the modified technique.

Dünndarmtransplantation In Mice

Since 1990, the development of tacrolimus-based immunosuppression and improved surgical techniques, the increased array of potent immunosuppressive ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the pathophysiology, treatment and prevention of OAD, different animal models of tracheal transplantation in rodents have been developed (1-7). Here, we use two established models of trachea transplantation, the heterotopic and orthotopic model and demonstrate their advantages and limitations.
For the heterotopic model, the donor trachea is wrapped into the greater omentum of the recipient, whereas the donor trachea is anastomosed by end-to-end anastomosis in the orthotopic model.
In both models, the development of obliterative lesions histological similar to clinical OAD has been demonstrated (1-7).
This video shows how to perform both, the heterotopic as well as the orthotopic tracheal transplantation technique in mice, and compares the time course of OAD development in both models using histology.

This video shows and compares two experimental models to study the development of obliterative airway disease (OAD) in mice, the heterotopic and orthotopic tracheal transplantation model.

Heterotope und orthotopen Tracheal Transplantation in Mäuse als Modelle benutzt, um die Entwicklung von obliterans Airway Disease Study

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...