저자 연구실의 작품은 USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213)에 의해 지원되었다; NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2)와 앨버타 혁신 - 건강 솔루션.

생쥐에 참여하기 A. 배아 세포 이식 1. 받는 생쥐의 작성 <ol><li> 수신자 기증 testis 세포에 (중 유전적으로 기증자 또는 면역 - 결함과 일치) immunologically 허용해야합니다. </li><li> 받는 사람도 자연스럽게 spermatogenesis의 결여된 (예, W / W V 쥐)이나 내생 배아 세포 고갈 있어야합니다. 배아 세포 고갈은 조사 또는 Busulfan 같은 chemotherapeutic 약물에 의해 형성될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Busulfan으로받는 생쥐를 준비하는 방법을 설명합니다. </li><li> Busulfan의 IP 주입을 통해 시대의 4-6주에서 수신자를 드셔보세요. Busulfan의 최적 복용량은 변형에 따라 달라지게된다. 일반적으로 사용되는받는 종자에서 40-50 밀리그램 / kg의 복용량은 내생 배아 세포 (예 : 44 누드 마우스에 대한 밀리그램 / kg, 50 밀리그램 / B6/129 F1을받는 사람에 대한 ㎏).를 고갈에 충분하다 </li><li> DMSO의 Busulfan 파우더를 해산하고 멸균 증류수의 전술이 동일한 볼륨을 추가4 MG / ML의 최종 농도를 O. Busulfan의 석출을 방지하는 데 사용할 35-40시 ° C에서 이전 솔루션은 따뜻하게. 강수량이 관찰되는 경우 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> Busulfan 치료 후 한 달쯤 수신자를 사용하기 전에 수 있습니다. 받는 사람은 1 달 삼개월 후 Busulfan 치료 사이에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. microinjection의 pipettes의 작성 <ol><li> 1.0 mm 외경, 0.75 mm 내경, 3 인치 길이 borosilicate 유리 pipettes (모세관 튜브)를 선택합니다. </li><li> Sigmacote와 유리 pipettes를 Siliconize, 메탄올과 pipettes 씻어 건조 폭파. </li><li> 피펫 풀러를 사용하여 pipettes를 당겨. 다른 피펫 풀러 기계는 다른 설정은, 그러므로, 몇몇 설정을 테스트할 수 있습니다. 일반적으로 핵의 제거를 pipettes를 만들기 위해 사용하는 것과 비슷한 설정은 작동합니다. </li><li> 약 50 μm의의 직경을 달성하기 위해 사용하기 전에 해부 현미경 피펫 팁 떨어져일각에서. </li></ol> 3. 이식을위한 기증자 세포의 준비 <ol><li> 기증자 변형의 Choise는 연구 실험 문제에 따라 달라집니다. spermatogenesis의 부량가 종점으로 사용되는 경우, 해당 LAC-Z와 같은 쉽게 식별 가능한 유전자 마커와 기증자의를 사용 (예 : B6.129S7-GT (로사) 잭슨 연구소에서 26Sor / J) 또는 GFP (예 : C57BL/6-Tg ( 잭슨 연구소에서 편대의 편대-EGFP) 1Osb / J). </li><li> 7 MG / ML에서 DMEM에 DNase의 MG / ML, 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ML (0.25 % 트립신 플러스 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 2 ML 1에서 DMEM에서 collagenase 7 ML을 준비합니다. 이 금액은 2 기증자 마우스 testes을 소화입니다. </li><li> 무균 testes를 수집하고 tunica의 albuginea를 제거합니다. 확산 정액을 운반하는이 효소 소화를 촉진하기 위해 미세 집게로 부드럽게 tubules. </li><li> 5-10 분, 그리고 자주 활발히 논의를 위해 37 ° C에서 품어 collagenase로 전송 tubules. </li><li> 방적 (3 분 2백~3백g)과 PBS W / O 칼슘 2에 다시 정지하여 두 tubules 씻으 + + </s&gt;까지. </li><li> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 tubules를 다시 중지들이 끈적끈적한와 흐린가 될 때까지 흔들어. 그것 1-2 분 이내에 발생한다 ° C로 37 tubules의 소화를 모니터링합니다. </li><li> DNase을 추가하고 잘 흔들어. 1-2 분 동안 품어. </li><li> 효소의 작용을 중지 FBS 3 ML을 추가합니다. </li><li> 세포 / 조직 덩어리를 제거하는 40-70 μm의 기공 크기 나일론 메쉬를 사용하여 필터 세포 현탁액. </li><li> 5 분 대한 600g에 세포를 수집하여 DMEM (&lt;100 μl)의 소량에 다시 정지 세포. </li><li> 세포를 세고 원하는 최종 농도 (일반적으로 100 × 10 6)으로 볼륨을 조정합니다. 사용하기 전에 빙판에 세포 현탁액을 유지. </li><li> 각각 Busulfan - 대우 마우스 testis는 세포 현탁액의 단지 10-15 μl로 가득합니다. 잠재적인 낭비와 누수로 인해 testis 당 30-50 μl를하고자합니다. </li></ol> 4. 이식 절차 (그림 1) <ol><li> 승인된 프로토콜에 따라받는 사람을 마취시키다. </li><li> 지느러미의 장소드러누움 및 수술 복부 영역을 준비합니다. 복부 벽을 폭로하기 위해 ~ 1cm 중간선 복부 절개를합니다. 우연히 복부 장기를 손상하지 않도록하고, 복막 구멍을 노출하는 복벽의 중간선에서 ~ 0.5 cm의 절개를 만들기 위해 진행 흰색 라인의 시점에서 작은 집게를 사용하여 복벽 들어 봐요. </li><li> 복부 벽을 사수 하나 홍채 집게를 사용하여 복막에 고인 epididymis와 testis에 부착된 기름 패드를 검색할 홍채 포셉 또 한 쌍의을 사용합니다. 부드럽게 testis가 exteriorized 때까지 지방 패드를 꺼내와 고환 동맥과 epididymis 명확하게 볼 수 있습니다. 한 번에 한 testis에서 작동합니다. </li><li> 더 나은 시각적 식별 (옵션)에 대한 지방 패드 / testis 아래 autoclaved 색인 카드로 만든 얇은 무균 드레이프를 놓습니다. 드레이프 또한 액체를 흡수하기 위해 노력하고 있습니다. </li><li> 세포 현탁액으로 Trypan 블루 염료 방울을 넣고 조심스럽게 polyethy에 세포 현탁액을로드lene 튜빙은 1 ML의 주사기에 연결. 튜빙으로 뽑았 피펫을 첨부하고 부드럽게 주사기에 압력을 적용하여 피펫으로 세포 현탁액을 강제. </li><li> efferent 덕트 (epididymis로 testis 연결하는)를 식별하고 부드럽게 덕트 주위 지방 조직을 제거합니다. 그들 주위 덕트와 멤브레인가 반투명 있기 때문에 신중하게 작동합니다. </li><li> 조심스럽게 efferent 관의 번들로 덕트로 피펫을 삽입, 부드럽게 testis 향해 몇 mm에 실을 꿰다. </li><li> 주입 피펫을 이동 피하는 동안 주사기를 위해 도달, 부드럽게 작성하기 시작 정지가 rete testis와 정액을 운반하는 tubules로 흐르는 수 있도록 주사기의 플런저를 우울하게. </li><li> 세포 현탁액의 주입 속도와 흐름은 엄지손가락의 압력에 의해 규제됩니다. 압력의 갑작스런 증가를 피한다; tubules에있는 정지의 움직임을 모니터링합니다. </li><li> testis는 벡을 시작하기 전에 거의 모든 표면 tubules가 충만되어 분사를 중지합니다허혈성 ome. </li><li> 복강에 testis를 반환합니다. contralateral testis에 절차를 반복합니다. 6-0 실크 봉합사와 복부 벽 치료와 금속 상처 클립으로 피부를 닫습니다. 전체 복구까지 온난 패드에서 마우스를 모니터링합니다. </li></ol> 5. 받는 사람 testes 분석 <ol><li> 2-4개월 분석하기 전에 이식 후 허용합니다. </li><li> 동물 관리 및 사용 지침에 따라받는 마우스를 안락사시켜야하고 PBS로 testis와 epididymis를 수집합니다. 그것이 내생적인 베타 갈락토 활동이로 LAC-Z 유전자 변형 기증자 스트레인이 사용되면, epididymis는 긍정적인 염색법 컨트롤로 사용할 수 있습니다. </li><li> LAC-Z의 염색법에 의한 공여 세포의 검출 들어, 4에 1~2시간 위해 testis를 해결 ° C를 PBS에서 4 % paraformaldehyde (PFA)에. lacZ의 실온에서 3 X 30 분 린스하면 버퍼를 린스. </li><li> lacZ의 염색법 용액에서 37 ° C에서 밤새 품어. Testis은 전체적으로 또는 분산 후에 물들일 수tubules. </li><li> 수정하고 중립은 포르말린 버퍼 10 % 저장합니다. 섹션이 필요한 경우에는 반대 얼룩과 같은 중립 빠른 빨간색을 사용합니다. </li></ol> 부 B. 자궁외은 생쥐에 xenografting (Dobrinski 및 Rathi 2008 15,로드 리게스 - 소사 외부터. 2,011 16). 1. 공여 조직의 모음 <ol><li> 거세에 의해 testis 조직을 확보하거나 기증자 남성에서 생검. </li><li> 멸균 조건을 유지하는 PBS 또는 배지에 biopsies의 장소 testis. </li><li> 얼음과 실험실로 이송에서 수집된 조직을 유지. </li></ol> 2. 공여 조직의 준비 <ol><li> 불임을 유지하기 위해 조직 문화 후드에서 수행합니다. </li><li> 2 ~ 3 배 PBS와 문화 그릇에 전송하기 전에 얼음처럼 차가운 PBS가 들어있는 항생제 각 testis 씻으십시오. biopsies의 경우, 심심풀이 문화 메디와 함께 testis 조각에게 2 ~ 3 배 씻어음 .. 2 분 동안 150g에 회전과 신선한 얼음처럼 차가운 배지에 resuspending하여 항생제를 포함하는. </li><li> 그대로 testes은 표면을 따라 절개하여 tunica vaginalis 장치를 제거하고 testis을 압출 성형. testis 모든 별관 구조 (정액의 코드, epididymis, 결합 조직)에서 제거합니다. PBS와 문화 그릇에 차가운 PBS 및 전송에 한 번 testes 씻으십시오. </li><li> 조심스럽게 메스 블레이드와 가위를 사용하여 testis의 tunica의 albuginea를 제거합니다. testis가 매우 작은 경우, tunica는 다른 끝에 작은 포셉 한 켤레로 tunica를 누른 상태에서 한쪽에 만들어진 작은 절개를 통해 tunica의 고환 조직을 착취하여 제거할 수 있습니다. </li><li> testis의 크기에 따라 하나를 전체 testis 조직은 1 주위를 작은 조각으로자를 수 있습니다 - 곡선 집게와 메스 블레이드, 또는 testis 조직의 큰 조각을 사용하여 크기가 2mm 3 처음엔 testis에서 제거하실 수 있습니다 작은로 잘라조각. 모든 이것은 얼음처럼 차가운 배지와 작은 문화 요리 (60 x15 ㎜)에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. </li><li> 접목 때까지 얼음 작은 문화 요리 심심풀이 문화 매체로 준비된 조직 조각을 전송합니다. </li></ol> 3. 받는 마우스의 거세 <ol><li> 위의 마우스를 마취시키다 70 %의 에탄올과 Betadine 용액으로 닦고, 머리를 (없는 누드 마우스에 필요한) 클리핑하여 무균 수술 부위를 준비합니다. </li><li> 복부 벽을 폭로하기 위해 0.5 -1 cm 복부 중간선에 피부 절개를합니다. </li><li> 신중 PartA, 4.2-4.3에서 설명한대로 testis, 고환 동맥과 epididymis을 폭로. </li><li> 무딘 절개로 gubernaculum에서 epidydimis의 꼬리를 분리합니다. </li><li> 고환 동맥을 Ligate하고 중이야 실크로 혈관과 함께 정관 및 testis와 끈 사이를 절단하여 섹션의 출혈도 잡았 구조. </li><li> seco 절차를 반복차 testis. </li><li> 하나 또는 두 개의 수술용 봉합사와 복부 벽 봉합해. </li><li> 하나 또는 두 개의 미셸 클립으로 피부 절개를 닫습니다. </li></ol> 4. xenografting 자궁외 <ol><li> 복부 드러누움에 마우스를 위치 이상 등 그 뒷면에 불임 수술 부위를 준비합니다. </li><li> (일반적으로 4-8/mouse) 삽입하는 것입니다 얼마나 많은 이식에 따라, 마우스 뒤쪽의 중간 라인의 각 면에 ~ 0.5 cm 길이 피부 incisions하다. </li><li> 피부 절개의 테두리를 잡고 집게를 사용하여 가위를 사용하여 결합 조직을 분열 괴롭히고하여 피하 충치합니다​​. </li><li> 다른 홍채 포셉로 피부 절개의 테두리를 잡고 아이리스 포셉 장소에게 피하 캐비티에 깊은 testis 조직의 조각을 사용합니다. </li><li> 한 미셸 클립으로 피부 절개를 닫고 그것이 마취에서 회복하기 시작할 때까지 가열 패드에서 마우스를 보관하십시오. </li><li> 부가 절연 및 공동과 새장에 마우스를 전송버전 및 모니터 마우스까지 완전히 회복됩니다. </li></ol> 5. 분석 및 정자 추수할 testis xenografts 수집 <ol><li> 동물 관리 및 사용 지침에 따라 호스트 마우스를 안락사, 그리고 꼬리의 목 및 개방형 피부에 실행 다시 피부에 중간선에 피부 절개를합니다. 이것은 피하 조직에 어느 위치하거나 피부에 장착할 수 이식술을 제공합니다. </li><li> 조심스럽게 페어 집게와 가위를 사용하여 이식을 제거합니다. </li><li> 이식술은 회복, 크기 및 개별 이식술의 무게의 레코드 번호입니다. </li><li> 마우스의 복부에서 정액 vesicles를 검색하고 이식할 조직에서 남성 호르몬 생산은 표시대로 자신의 체중을 기록합니다. </li><li> histological 분석 <ol class="lalpha"><li> 볼륨에 Bouin의 솔루션을 (또는 다른 정착액) 포함하는 샘플 유리병에 xenografts을 일시 중지하면 해당 이종 이식의 10 배 정도요, 그리고 라벨 유리병 적절. </li><li> 알을 품다선호 24 시간 간격으로 70 % 에탄올에 적어도 3 회 씻고 다음 냉장고에서 하룻밤. </li><li> 처리과 파라핀에 삽입을 위해 진행합니다. </li></ol></li><li> 정자 추수할 <ol class="lalpha"><li> 1 분 동안 300g에 그들을 아래로 회전과 문화 매체를 포함하는 항생제에 그들을 resuspending하여 xenografts 씻으십시오. </li><li> 작은 조각으로 이식을 잘라와 3를 포함하는 조직 배양 접시에있는 집게로 조심스럽게 말하다 - 배지 5 ML. </li><li> 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 다진 조직. </li></ol></li></ol> 부 C. 대표 결과 1. 배아 세포 이식 이식된 공여 세포 현탁액 등 LacZ transgene,받는 testis의 기증자 SSCs의 식민지와 같은 유전자 마커를 들고 spermatogonial 줄기 세포가 포함되어 있으면 SEM의 독특한 푸른 세그먼트로 X-여자의 염색법에 의해 시각이 될 수iniferous는 2~3개월 사후 이식 3 (그림 2A) 이후 tubules. 탄탄한 식민지가 끝나 모두에서 두 개 이상의 가까운 센터에 청색의 세포 레이어, 그리고 상대적으로 약한 스테인드 영역으로 완전히 채워진 세그먼트 긴 진한 파란색 신축성이 있어야 어디 단일, 이점 또는 파란색 세포의 작은 그룹의 네트워크 3 (그림 2B) 겉보기입니다. 진한 파란색의 정액을 운반하는 가느다란 관 영역의 단면이 잘 설립 밝히지 각종 분화 단계 (그림 2C)에서 파란색 배아 세포로 잘 조직 spermatogenesis한다. 2. xenografting Testis 조직 이식 후 testis 조직의 생존 능력은 반대 기증자의 발달 단계와 서로 관련되며 성인 조직은 17-21 타락한 후 죽게 높은 경향을 보여주면서 최고의 결과는 신생아 남성의 조직이 사용되었을 때 얻어진다. 기증자 조직이 나를 거쳐로서 일반적으로, 이종 이식 성공은 감소spermatogenesis의 첫 번째 물결의 iosis. 미숙 기증자 조직하고 완전한 spermatogenesis의 전체 개발 시간은 수종 구체적이고, 원래의 장소에 testes에 비해 자주 다소 짧아. 전체 spermatogenesis으로 정액을 운반하는 장치 tubules의 수는 종류에 따라 변수입니다. 양에있는 동안 숫자가 소와 고양이에, 50 %보다 큰 것으로 염소와 돼지는 채 15% 14 (그림 3)입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" /> 1 그림. 배아 세포 이식 절차. 플레이스 마취 후 지느러미 드러누움에있는 수신자와 ~ 0.4 인치 중간선 복부 절개 (를) 확인하십시오. epididymis와 testis에 부착된 지방 패드를 철수하여 testis을 폭로하고 더 나은 시각적 식별 (B)에 대한 지방 패드 / testis 밑에 얇은 무균 드레이프를 놓습니다. 지방 패드에 묻힌 efferent 덕트는 (C, D, E)보고 알 수있는가되도록 testis와 epididymis를 둡니다. 신분증엔티티 efferent 덕트 부드럽게 덕트 주위 지방 조직을 제거합니다. 색 종이 또는 플라스틱의 조각이 더 나은 시각화 (G) 용 덕트 아래에 배치될 수 있습니다. 피펫 (H)로 덕트 및로드 세포 현탁액의 크기에 따라 피펫 팁을 빠져나가거나 갈아서. 조심스럽게 efferent 관의 번들로 덕트로 피펫을 삽입, 부드럽게 testis (H의 화살표가 피펫 사출 및 스레딩의 방향을 보여주는)을 향해 몇 mm에 실을 꿰다. 정액을 운반하는 tubules로 성공적인 분사와 testis는 (I) 표시됩니다. TS : Testis, EP : epididymis. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" /> 그림 2. 배아 세포 이식) X-여자 물들일 주입 testis위한 대표 결과입니다. 정액을 운반하는 장치 tubules의 푸른 세그먼트는 유전자 변형 기증 SSCs (LacZ transgene)에서 설립 식민지를 나타냅니다. 삼개월 후 이식에서 SSC 식민지의 B) 높은 배율. 일중앙에 전자 진한 파란색 영역은 끝에 전체 spermatogenesis과 하늘색 지역을 대표하는 식민지의 성장 확장자를 나타냅니다. C) 진한 파란색의 정액을 운반하는 가느다란 관의 histological 섹션 (삼개월 이후 이식)은 잘 조직 spermatogenesis를 보여줍니다. B와 C의 스케일 바는 200 μm의 각각 30 μm의입니다. (숫자는 Annu 레브 데브 세포 Biol에서 적응 2008;. 24:263-86 및 Biol Reprod 1999 6월는;. 60 (6) :1429-36). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" /> 그림 3. 자궁외 immunodeficient 생쥐로 큰 동물의 미숙 testis 조직의 xenografting. immunodeficient 생쥐의 지느러미 피부 ()에서 이식 미숙 기증자 testis 파편 (~ 1mm 3)하고 생존과 마우스 gonadotropins에 응답할 수 있습니다. 그 결과, testis 조직 기름지게 관할 정자 (B)의 형성을 포함한 완벽한 개발을 거쳐. testis의 xenografts가 수집되면 (C)그들은 분석을 위해 또는 ICSI (E)와 배아 생산 (F)에 정자 (D)을 구하는 데 사용될 수 있습니다. 바 동등 50 μm의 (B, E 및 F) 또는 10 μm의 (D). (로드 리게스 - 소사와 Dobrinksi 2,009 14에서 수정).

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R., Schlatt, S., Dobrinski, I., Seli, E., Agarwal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+tissue+transplantation+for+fertility+preservation.">Testicular tissue transplantation for fertility preservation.</a> Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. , 331-331 (2011).</li><li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+fate+and+seminiferous+tubule+development+in+bovine+testis+xenografts.">Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts.</a> Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).</li><li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+development+in+equine+testis+tissue+xenografted+into+mice.">Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice.</a> Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).</li><li>Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+donor+age+on+success+of+spermatogenesis+in+feline+testis+xenografts.">Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).</li><li>Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenografting+of+adult+mammalian+testis+tissue.">Xenografting of adult mammalian testis tissue.</a> Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).</li><li>Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+survival+of+adult+human+testicular+tissue+as+ectopic+xenograft.">Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft.</a> Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).</li><li>Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta1-+and+alpha6-integrin+are+surface+markers+on+mouse+spermatogonial+stem+cells.">beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD9+is+a+surface+marker+on+mouse+and+rat+male+germline+stem+cells.">CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).</li><li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aging+and+niche+microenvironment+on+spermatogonial+stem+cell+self-renewal.">Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).</li><li>Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+Plzf+in+maintenance+of+spermatogonial+stem+cells.">Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells.</a> Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).</li><li>Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV5+is+required+for+continuous+spermatogenesis+in+adult+mice+and+may+mediate+blood+testes+barrier+function+and+testicular+immune+privilege.">ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).</li><li>Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+and+transplantation+of+porcine+testis+tissue.">Preservation and transplantation of porcine testis tissue.</a> Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).</li><li>Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cold+storage+and+cryopreservation+of+immature+non-human+primate+testicular+tissue+on+spermatogonial+stem+cell+potential+in+xenografts.">Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts.</a> Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).</li><li>Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+testicular+tissue+from+infant+monkeys+after+xenografting+into+mice.">Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice.</a> Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).</li><li>Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+maturation+of+primate+testis+by+xenografting+into+mice.">Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice.</a> Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

1. 배아 세포 이식 배아 세포 이식은 세포 인구의 spermatogonial 줄기 세포의 존재 (SSCs)의 애매하지 않은 확인하는 유일한 기능 분석을 제공합니다. 오직 SSCs는하고 지하 막에서 SSC의 틈새를 식민지와 기증자 파생 spermatogenesis을 시작할 가정 수 있습니다. 배아 세포 이식은 전례없는 방식으로 SSCs을 연구하고 조작하는 것이 가능했다. 기술은 SSCs 4의 유전자 조작을 통해 형?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Collagenase (유형 IV) </td><td> 시그마 </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 시그마 </td><td> DN25 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Trypan 파란색 얼룩 </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td></tr><tr><td> 나일론 메쉬 셀 스트레이너 </td><td> BD biosciences </td><td> 352340 (40μm) 352350 (70μm) </td></tr><tr><td> Busulfan </td><td> 시그마 </td><td> B2635 </td></tr><tr><td> 얇은 벽 유리 모세 혈관 </td><td> 세계 정밀 악기 </td><td> TW 100-3 </td></tr><tr><td> BD intramedic의 plyethylene 튜브 (PE100) </td><td> BD </td><td> CA-63018-725 </td></tr><tr><td> Ethicon 6-0 실크 봉합사 </td><td> Ethicon </td><td> 706G </td></tr><tr><td> 상처 클립 </td><td> BD </td><td> 427,631 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> X-여자 </td><td> 시그마 </td><td> B4252 </td></tr><tr><td> Ferrocyanide 칼륨 </td><td> 시그마 </td><td> P9387 </td></tr><tr><td> Ferricyanide 칼륨 </td><td> 시그마 </td><td> P3667 </td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 </td><td> 시그마 </td><td> 208,337 </td></tr><tr><td> 나트륨 deoxycholate </td><td> 시그마 </td><td> D6750 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamide </td><td> 시그마 </td><td> D4551 </td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> 시그마 </td><td> 18,896 </td></tr></tbody></table>

germ cell transplantation and testis tissue xenografting in mice

배아 세포 이식 1994 1,2의 펜실베니아 대학에서 박사 랄프 Brinster 및 동료에 의해 ​​개발되었다. 이러한 지상 최신 연구받는 동물이별로 공여자 - 파생 spermatogenesis과 정자 생산에 불임받는 생쥐 결과의 정액을 운반하는 장치 tubules에 비옥한 공여 마우스의 배아 세포의 microinjection을 보여주었다. 받는 동물 1 자손에 기증 haplotype의 기증자 - 파생 spermatogenesis 및 전송의 세균성 β-갈락토 유전자 허용 신분증을 들고 기증자 남성의 사용. 놀랍게도, 정액을 운반하는 tubules의 루멘으로 이식 후 이식된 배아 세포 spermatogonia가 3 위치한 지하 막에 luminal 구획에서 이동할 수있었습니다. 이것은 일반적으로 오직 SSCs가받는 testis에서 틈새 시장과 재연결 spermatogenesis를 식민지 수있는 것으로 인정된다. 따라서 배아 세포이식은 testis에서 줄기 세포 틈새 시장을 연구하고 putative spermatogonial 줄기 세포를 특성화하기 위해 기능적 접근 방식을 제공합니다. 지금까지 배아 세포 이식은, 기본적인 줄기 세포 생물학을 명료하게하다하기 전에 이식 4,5에 배아 세포의 유전자 조작을 통해 형질 전환 동물을 생산, Sertoli 세포 - 배아 세포 상호 작용 6,7, SSC 유도하고 식민지 3 공부하는 데 사용됩니다 8,뿐만 아니라 SSC 자기 갱신과 차별화 9,10. 배아 세포 이식은 큰 종 11도 가능한 것입니다. 이들의 주요 응용 프로그램은 다산의 보존, 동물 집단의 엘리트 유전학의 보급, 그리고이 기술 spermatogenesis과 SSC 생물학 연구 logistically 설치류보다 더 어렵고 비싼 등 유전자 변형 동물의 세대입니다. colonizat의 생쥐 결과의 정액을 운반하는 장치 tubules에 큰 수종으로부터 배아 세포의 이식공여 세포 spermatogonial 확장 이온 아니지만 phylogenetically 먼 종 12에서 배아 세포로받는 체세포 구획의 비호 환성으로 아마도 인해 전체 차별화 인치 대안적인 접근은 그들 주변의 체세포의 구획과 함께 대형 종의 배아 세포의 이식입니다. 우리가 먼저 immunodeficient 생쥐의 지느러미 피부 밑에 이식 미숙한 남성의 testis 조직의 작은 조각이 기름지게 관할 정자 13 생산과 전체 개발을 생존하고 받아야 할 수있는 것으로, 2002 년 보도했다. 이후 xenografting testis 조직은 많은 종의에서 성공을 보여줘왔다와 생쥐 14 대형 동물의 testis 개발과 spermatogenesis을 공부하는 귀중한 대안으로 나타났다.

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Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

배아 세포 이식과 testis 조직 xenografting을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 배아 세포 이식받는 testes의 기증자 파생 spermatogenesis의 결과와 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs)의 식별을위한 기능성 reconstitution 분석을 나타냅니다. xenografting Testis 조직이받는 생쥐에서 다양한 공여 종의 testis 개발과 spermatogenesis를 재현한.

배아 세포 이식 및 Testis 조직 마우스에 Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.6K 조회수.  University of Calgary. 배아 세포 이식과 testis 조직 xenografting을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 배아 세포 이식받는 testes의 기증자 파생 spermatogenesis의 결과와 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs)의 식별을위한 기능성 reconstitution 분석을 나타냅니다. xenografting Testis 조직이받는 생쥐에서 다양한 공여 종의 testis 개발과 spermatogenesis를 재현한.

비디오: Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

연구

생물학

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Heterotopic Heart Transplantation in Mice

The mouse heterotopic heart transplantation has been used widely since it was introduced by Drs. Corry and Russell in 1973. It is particularly valuable for studying rejection and immune response now that newer transgenic and gene knockout mice are available, and a large number of immunologic reagents have been developed. The heart transplant model is less stringent than the skin transplant models, although technically more challenging. We have developed a modified technique and have completed over 1000 successful cases of heterotopic heart transplantation in mice. When making anastomosis of the ascending aorta and abdominal aorta, two stay sutures are placed at the proximal and distal apexes of recipient abdominal aorta with the donor s ascending aorta, then using 11-0 suture for anastomosis on both side of aorta with continuing sutures. The stay sutures make the anastomosis easier and 11-0 is an ideal suture size to avoid bleeding and thrombosis.
When making anastomosis of pulmonary artery and inferior vena cava, two stay sutures are made at the proximal apex and distal apex of the recipient s inferior vena cava with the donor s pulmonary artery. The left wall of the inferior vena cava and donor s pulmonary artery is closed with continuing sutures in the inside of the inferior vena cava after, one knot with the proximal apex stay suture the right wall of the inferior vena cava and the donor s pulmonary artery are closed with continuing sutures outside the inferior vena cave with 10-0 sutures. This method is easier to perform because anastomosis is made just on the one side of the inferior vena cava and 10-0 sutures is the right size to avoid bleeding and thrombosis. In this article, we provide details of the technique to supplement the video.

The mouse heterotopic heart transplantation model has been proven by many investigators to be an important method for studying mechanisms of rejection and immune response. However, the techniques involved are still challenging. By modifying standard techniques we have had success with more than 1000 transplants.

마우스의 Heterotopic 심장 이식

The mouse heterotopic heart transplantation has been used widely since it was introduced by Drs. Corry and Russell in 1973. It is particularly valuable ...

Small Bowel Transplantation In Mice

Since 1990, the development of tacrolimus-based immunosuppression and improved surgical techniques, the increased array of potent immunosuppressive medications, infection prophylaxis, and suitable patient selection helped improve actuarial graft and patient survival rates for all types of intestine transplantation. Patients with irreversible intestinal failure and complications of parenteral nutrition should now be routinely considered for small intestine transplantation. However, Survival rates for small intestinal transplantation have been slow to improve compares increasingly favorably with renal, liver, heart and lung. The small bowel transplantation is still unsatisfactory compared with other organs. Further progress may depend on better understanding of immunology and physiology of the graft and can be greatly facilitated by animal models. A wider use of mouse small bowel transplantation model is needed in the study of immunology and physiology of the transplantation gut as well as efficient methods in diagnosing early rejection. However, this model is limited to use because the techniques involved is an extremely technically challenging. We have developed a modified technique. When making anastomosis of portal vein and inferior vena cava, two stay sutures are made at the proximal apex and distal apex of the recipient s inferior vena cava with the donor s portal vein. The left wall of the inferior vena cava and donor s portal vein is closed with continuing sutures in the inside of the inferior vena cava after, after one knot with the proximal apex stay suture the right wall of the inferior vena cava and the donor s portal vein are closed with continuing sutures outside the inferior vena cave with 10-0 sutures. This method is easier to perform because anastomosis is made just on the one side of the inferior vena cava and 10-0 sutures is the right size to avoid bleeding and thrombosis.  In this article, we provide details of the technique to supplement the video.

The mouse small bowel transplantation model has been recognized as an important tool to study mechanismes of immune rejection and screen new immunosuppressive drugs. However, this model is limited to use because the techniques involved is an extremely technically challenge. Now we introduce the modified technique.

마우스에 작은 창자 이식

Since 1990, the development of tacrolimus-based immunosuppression and improved surgical techniques, the increased array of potent immunosuppressive ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the pathophysiology, treatment and prevention of OAD, different animal models of tracheal transplantation in rodents have been developed (1-7). Here, we use two established models of trachea transplantation, the heterotopic and orthotopic model and demonstrate their advantages and limitations.
For the heterotopic model, the donor trachea is wrapped into the greater omentum of the recipient, whereas the donor trachea is anastomosed by end-to-end anastomosis in the orthotopic model.
In both models, the development of obliterative lesions histological similar to clinical OAD has been demonstrated (1-7).
This video shows how to perform both, the heterotopic as well as the orthotopic tracheal transplantation technique in mice, and compares the time course of OAD development in both models using histology.

This video shows and compares two experimental models to study the development of obliterative airway disease (OAD) in mice, the heterotopic and orthotopic tracheal transplantation model.

Obliterative 에어웨이 질환의 발전을 연구하는 모델로 사용 마우스의 Heterotopic 및 Orthotopic Tracheal 이식

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...