Wir sind dankbar, dass Ruth Lehman und Dorothe Godt, die freundlicherweise Vasa und Stau-Antikörper. Wir möchten die Bloomington Stock Center an der Indiana University für die Aufrechterhaltung der vorgesehenen Aktien und die Entwicklungsstudien Hybridoma Bank im Rahmen der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und von der Universität von Iowa gehalten anzuerkennen. Wir danken allen Mitgliedern der Wawersik Labor für ihre Beratung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Monroe-Scholars Program Grant (AF und LB) und NSF gewähren IOS0823151 (MW) finanziert.

1. Herstellung einer Sammlung Cage <ol><li> Betäuben junge, fruchtbare Fliegen mit CO 2. Übertragen betäubten Fliegen auf einen Käfig. Um eine optimale Ausbeute zu erhalten, verwenden Sie 100-120 erwachsenen Fliegen von 2-7 Tagen des Alters bei einem 4: 1-Verhältnis von Frauen zu Männern. Fliegen ermöglichen eine angemessene Eingewöhnungszeit, ~ 24 Stunden vor der Probe für den Erhalt Fixierung. Wenn der Käfig wurde mit jungfräulichen Weibchen gesetzt gepaart, um Männer, eine Verwendung einer 36 - 48 h Akklimatisierung. </li><li> Am offenen Ende des Käfigs, legen Sie einen vorbereiteten Apfelsaft-Agar-Platte mit einer Dime-Größe Tropfen Hefe-Paste in der Mitte über der Öffnung des Käfigs. Dann sichern Sie sie mit Klebeband. Verschließen Sie den Übergang zwischen der Apfelsaft-Agar-Platte und der Käfig mit Parafilm. </li><li> Platzieren Sie den Käfig in einem zweiten Behälter mit Apfelsaft Agarplatte als Base und ermöglichen die Fliegen bei einer bestimmten Temperatur für eine geeignete Zeitperiode zu reproduzieren, wie durch das Experiment bestimmt. Hinweis: Musterkollektion mal will variieren. Wenn zum Beispiel das Sammeln spät Embryonen / frühe L1-Larven (17. - 24. Stunde), ermöglichen Fliegen Eier auf Apfelsaft Agarplatten für 7 h bei 25 ° C vor dem Altern der Probe für 17 Stunden bei 25 ° C lag. Ähnlich, für eine Sammlung von mittleren bis späten ersten Larvenstadium (36 - 48 h) entfernt, um zu ermöglichen Eier 12 Stunden bei 25 ° C vor der Alterung der Probe für 36 Stunden bei 25 ° C lag. </li><li> Sobald der Zeitraum abgeschlossen ist, tippen Sie auf den Käfig auf einen Tisch, so dass Fliegen fallen weg von der Apfelsaft-Agar-Platte ohne Narkose. Ersetzen schnell die verwendete Platte durch eine neue, die einen Rückgang von Hefe-Paste. Sichern Sie die frische Platte mit Klebeband und Parafilm und bewahren Sie den Käfig mit Apfelsaft-Agar-Platte als Basis. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Hefe-Drop aus der gebrauchten Teller mit einem Metallspachtel. Deckel auf Platte verwendet Apfelsaft und legte ermöglichen Embryonen nach Alter, wenn experimentell notwendig. Anmerkung: Während Alterungs Proben können die Platten bei 25 ° C gelagert werden, wenn höhere Temperaturen Experimentally erforderlich. Beispiele, wie man Embryonen für die Sammlung sind oben beschrieben altern (siehe Hinweis für Schritt 1.3). Entfernung von Hefe-Paste vor dem Altern zu probieren durchgeführt, um Larven von kriechen in die Hefe und das Aufbrechen der Agar unter verhindern. Die restlichen Apfelsaft-Agar und Hefe-Paste Rest liefern die Nährstoffe für das Larvenwachstum. Während Embryonen direkt in der Hefe Paste gelegt werden durch Entfernen der Hefe-Paste verloren geht, ist dieser Verlust vorzuziehen, Hefe und Agar-Rückstand in der Probe, die Färbungseffizienz verringern kann. Sollte man sich entscheiden, die Hefe-Paste zu entfernen, kann Hefe mit Phosphatpuffer Triton X-100 (PBTx) verflüssigt werden, mit einem Pinsel vermischt und dann aus der Probe mit einer Zelle Sieb vor der Fixierung entfernt wird. </li></ol> 2. Fixation <ol><li> Sobald Embryonen auf die Apfelsaft-Agar-Platte gelegt haben, um die gewünschten Zeitpunkt im Alter, mit einem kleinen Pinsel mit Phosphatpuffer Triton X-100 (PBTx) Lösung benetzt, um Probe vorsichtig aus th entfernenE Platte. Hinweis: Ältere Larven sind mobil und können auf der Innenseite des Deckels zu kriechen. Diese Probe kann in ähnlicher Weise von der Entfernung mit einem Pinsel gesammelt werden. </li><li> Wischen Sie die Probe beladenen Pinsel gegen den nach innen gerichteten Grat einer Zelle Sieb. Dann spülen Sie die Wände des Sieb und den Pinsel mit einer Spritzflasche enthält PBTx Lösung. Legen Sie eine Petrischale unter dem Deckel Sieb, um die PBTx Lösung zu erfassen. </li><li> Nachdem alle die Probe auf das Sieb übertragen worden ist, gießen Sie genug PBTx in das Sieb, um die Probe aus dem Netz zu erhöhen. Dann heben Sie den Sieb und gießen Sie den Inhalt der Petrischale in eine flüssige Abfallbehälter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.3 dreimal, um Hefe zu entfernen und fliegen Abfälle, die zusammen mit der Probe übertragen worden sein können. </li><li> Gießen Sie genug 50% Bleichmittel (NaOCl) / Wasser (ddH 2 O)-Lösung in das Sieb, um die Larven des Netzes zu erhöhen aus. Dass die Larven in Lösung für 5 min sitzen. Dann heben Sie das Sieb und gießen Sie ter Inhalt der Petrischale in einem Abfallbehälter. Hinweis: - 22 Stunden, um den Chorion-Membran zu entfernen Bleach ist nur in embryonalen Proben im Alter von 0 erforderlich. Die Anwendung von Bleich ältere Proben weggelassen werden kann, aber seine Aufnahme nicht schädlich ist. Wenn Unterlassung gewünscht wird, ersetzen Sie das Bleichmittel in diesem Schritt mit PBTx. Verdünnt Bleich sollte innerhalb von 24 h Herstellung der Lösung verwendet werden. </li><li> Waschen Probe in das Sieb mit PBTx durch Gießen genug PBTx in das Sieb, um die Probe aus dem Netz zu erhöhen. Erlauben Probe in Lösung für 3 min zu sitzen. Dann heben Sie den Sieb und gießen Sie den Inhalt der Petrischale in eine flüssige Abfallbehälter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.6 fünfmal. </li><li> Tupfen Sie den Boden der Zelle Sieb trocknen, dann in einen Probentransfer Szintillationsfläschchen, die 1,75 ml PEMS Lösung mit einem Pinsel. </li><li> Die Arbeit in einem belüfteten Laborabzug, fügen Sie 250 ul 37% Formaldehyd und 8 ml Reagenz Heptan auf die Szintillationsfläschchen. <br/&gt; Hinweis: Formaldehyd und Heptan sind gefährlich. Für Sicherheitszwecke, weiterhin in einem belüfteten Abzug arbeiten und tragen Sie geeignete Handschuhe für Schritte 2,9-3,3. </li><li> Lassen Sie die Flasche bei 200 Umdrehungen pro Minute oder einer ähnlichen mäßiger Geschwindigkeit für 20 min schütteln. </li><li> 10 ml Methanol in Szintillationsfläschchen, ohne die frühere wässrigen Phase und damit die Ampulle kräftig bei 500 Upm für 1 min schütteln. Hinweis: Methanol ist gefährlich. Weiterhin in einem belüfteten Abzug arbeiten und tragen Sie geeignete Handschuhe. </li><li> Entfernen Fläschchen aus Shaker und gießen Sie sofort Inhalte in eine Zelle Sieb über einem Abfallbehälter in der Kapuze. Fügen Sie Zusatz Methanol in das Fläschchen und führen durch die Zelle Sieb wie nötig, um sicherzustellen, dass alle Proben wurde entfernt. Hinweis: Zellsiebe kann langsam abfließen. Um dies zu vermeiden, berühren ein Labor Gewebes am Boden der Zelle Sieb, um die Lösung durch den Filter schneller zu ziehen. Methanol, Formaldehyd und Heptan solltein geeigneten Abfallbehälter bis zur ordnungsgemäßen Entsorgung nach den Richtlinien des Instituts gespeichert. </li><li> Trockenen Boden der Zelle Sieb mit einer Labor Gewebe, dann verwenden Sie einen Pinsel, um Probe in das Sieb eingefangen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,5 ml Methanol zu übertragen. Hinweis: Wenn mehrere Szintillationsgefäße im Einsatz sind, führen Sie die Schritte 2.12 und 2.13 ein Fläschchen zu einer Zeit, zu Probe von Trocknen auf Zellsiebe verhindern. </li><li> Sobald die Probe auf den Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt, entfernt Methanol mit einer Pipette. Sicherzustellen Probe auf den Boden des Rohres abgewickelt. </li><li> Spülen Probe im Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von ungefähr 0,5 ml Methanol zu Rohr. Warten Sie dann begleichen Probe zu entfernen Methanol mit einer Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 15 dreimal. </li><li> 0,5 ml Methanol zu dem Rohr, und speichern Sie dann in eine -20 ° C-Gefrierschrank für die spätere Verwendung. </li></ol> 3. Rehydrierung und Herstellung der Probe für Immunfärbung <ol><li> Entfernen von Methanol aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipette, so dass die Probe in der Röhre. Shop Methanol Abfälle in die entsprechenden Abfallbehälter bis zum Zeitpunkt der ordnungsgemäßen Beseitigung. Hinweis: Um Beschallung Effizienz zu steigern, verwenden Sie nicht mehr als 3 mm von Probe an der Unterseite des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen abgerechnet. Überschüssige Probe kann in ein separates Röhrchen mit einer Pipette vor dem Beginn der Rehydration über Schritt übertragen werden. Schneiden der Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge verwendet werden, um ein Verstopfen der Pipettenspitze zu verhindern. </li><li> 1,0 ml einer 50% Methanol / Phosphatpuffer Tween (PBTw) Lösung in das Röhrchen und Rock für 3 min. </li><li> Methanol-Lösung zu entfernen, um die ordnungsgemäße Abfallbehälter und spülen mit 1,0 ul PBTw zweimal. Nach jedem Auswaschen damit die Probe vor dem Abziehen des PBTw mit einer Pipette zu begleichen. </li><li> 1,0 ml Rinderserumalbumin / Phosphat-gepufferte Tween (BBTw) zu mischen, um das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf einer Wippe, ermöglichen die sample, um sich niederzulassen und entfernen Sie die BBTw mit Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.4 zwei Mal darauf achten, dass so viel wie möglich zu entfernen BBTw ohne Probe nach dem letzten Waschen verlieren. </li><li> 0,5 ml BBTw auf das Rohr und den Schlauch auf Eis. </li></ol> 4. Die Beschallung der Probe <ol><li> Stellen Sie die Beschallungs zu 10% maximale Amplitude und Benennung einer Laufzeit von 2 sec konstant Beschallung. Hinweis: Diese Einstellungen sind spezifisch für die in den Materialien und Geräte Tabelle angegeben Ultraschallgerät und kann Optimierung für verschiedene Beschaller verlangen. </li><li> Vor der Beschallung von Proben, reinigen Sie die Sonde Ultraschallgerät, indem Sie die Sondenspitze in einem 50 ml konischen Röhrchen mit VE-Wasser und führen Ultraschallgerät zur Reinigung der Sonde gefüllt. Trockenbeschallungssonde mit Labor Gewebe nach der Flucht. </li><li> Tauchen Sie die Sonde in die Mikrozentrifugenröhrchen enthaltenden Probe, so dass es etwa 3 bis 4 mm über der Probe positioniert und starten Beschallung. </li><li> Entfernen Sie die microcentrifuge Rohr und legen Sie es auf Eis für mindestens 30 Sekunden, um Wärme von der Beschallung zu zerstreuen und lassen Probe am Boden des Mikrozentrifugenröhrchen zu begleichen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.3 und 4.4 nach Bedarf auf das Alter der Probe verarbeitet werden. Hinweis: Für eine optimale Beschallung Probenvolumen, Embryonen jünger als 17 Stunden nicht Beschallung benötigen, aber diejenigen zwischen 17 und 24 h (Stufe 17 / Früh L1) benötigen zwei sonications. Larven zwischen 24 - 36 (Anfang / Mitte L1), 36 - 48 (Mitte / Ende-L1), 48 - 60 (Anfang / Mitte-L2), 60-72 (Mitte / Ende-L2), 72-84 ( Früh L3), 84-96 (Anfang / Mitte-L3), 96-108 (Mitte / Ende-L3) hr verlangen 5, 9, 11, 13, 15, 18 und 22 jeweils sonications. Siehe Diskussion zur weiteren Ausarbeitung an Beschallung Zeiten. </li><li> Spülen BBTw zweimal mit 1,0 ml. Nach jeder Spülung damit die Probe vor dem Bezug von BBTw mit einer Pipette zu begleichen. </li><li> 1,0 ml BBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf der Wippe, damit die Probe absetzen und entfernen Sie die BBTw mit Pipette. &lt;/ Li&gt; <li> Wiederholen Sie Schritt 4.7 zwei Mal. </li></ol> 5. Immunfärbung <ol><li> Blockieren Probe durch Zugabe von 5% Normalserum in BBTw auf die Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt. Entfernen Block nach Schaukel 1 Stunde. Hinweis: Verwenden Sie normale Serum von den Arten, bei denen die Sekundärantikörper erzeugt werden. </li><li> Verdünnen primären Antikörpern anzueignen Arbeitskonzentration in 5% Normalserum / BBTw Lösung. </li><li> Gesteinsprobe in primäre Antikörperlösung A / N bei 4 ° C oder für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 22 ° C beträgt. Hinweis: Antikörper Inkubationszeiten und Temperaturen können variieren. O / N-Inkubation bei 4 ° C oder 3 Stunden bei Raumtemperatur ist in der Regel ausreichend. Jedoch kann ein zweitägiger Inkubationszeit Färbung Qualität zu verbessern, vor allem mit älteren Proben oder bei niedriger Affinität primäre Antikörper verwendet werden. Längere Inkubationen werden typischerweise bei 4 ° C durchgeführt. Ähnliche Überlegungen sind bei der Verwendung Sekundärantikörper (siehe 5.10) vorgenommen werden. </li><li> Erlauben Probe absetzenBoden des Mikrozentrifugenröhrchen. Abziehen primären Antikörper mit Pipette. Antikörper für die Wiederverwendung zu speichern, falls gewünscht. </li><li> Gründlich zweimal mit 1,0 ml BBTw. Nach jeder Spülung ermöglichen Probe vor Abziehen BBTw mit einer Pipette zu begleichen. </li><li> 1,0 ml BBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 3 min auf der Wippe, erlauben Probe sich niederzulassen und zu entfernen BBTw mit Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.6 fünfmal. </li><li> Block Probe durch Zugabe von 5% normalem Serum / BBTw Lösung des Reaktionsgefäß. Entfernen Block nach Schaukel für 30 min bis 1 Stunde. Hinweis: Diese zusätzliche Sperr Schritt ist nicht erforderlich, kann aber Qualität der Färbung auf spezifische Antikörper zu verbessern. </li><li> Verdünnen Sekundärantikörper, um angemessene Arbeitskonzentration in 5% normalem Serum / BBTw Lösung. </li><li> Wickeln Mikrozentrifugenröhrchen in Aluminiumfolie zu reduzieren Ausbleichen durch Lichteinstrahlung. Gesteinsprobe in sekundären Antikörperlösung für 12 bis 48 h bei 4 ° C oder für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 22 ° C beträgt. </li><li> Erlauben Probe zur Unterseite der Mikrozentrifugenröhrchen zu begleichen. Abziehen Sekundärantikörper mit Pipette. </li><li> Gründlich zweimal mit 1,0 ml PBTw. Nach jeder Spülung ermöglichen Probe vor dem Abziehen des PBTw mit einer Pipette zu begleichen. </li><li> 1,0 ml PBTw in das Fläschchen und Rock. Nach 5 min auf der Wippe, damit die Probe absetzen und entfernen Sie die PBTw mit Pipette. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.13 dreimal. </li><li> Optional: Fügen DAPI verdünnt 1: 1000 in PBTw. Gesteinsprobe in Aluminiumfolie eingewickelt für 3 min; entfernen Sie dann DAPI-Lösung mit einer Pipette. Spülen Sie fünfmal mit 1,0 ml PBTw, so dass Probe, bevor Sie PBTw mit Pipette zu begleichen. </li><li> Fügen 80-100 ul 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) Lösung für Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. Hinweis: Eine weitere Glycerin-basierte Anti-Fade Mittel kann ersetzt werden. </li></ol> 6. Analyse <ol><li> Vor der Montage Probe auf Objektträger, einen zusätzlichen 5 - 10 ul DABCO / p-phenylenediamine (PPD) Antifade Lösung für Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Probe kann auf Objektträger ohne Dissektion hinzugefügt werden. Probenvolumen zu einer Folie hinzugefügt variiert mit Deckglas Größe. Beim Pipettieren Probe auf Objektträger kann die Pipettenspitze aus mit einer Rasierklinge auf Probe Scher verhindern geschnitten werden. Es ist oft nützlich, um Probe in Reihen für die einfache Analyse säumen. Die Zugabe von PPD als zusätzlicher Antibleichmittel nicht erforderlich, kann aber die Photobleichung zu verhindern, wenn die Proben langfristig gespeichert. </li><li> Stellen sanft Deckglas über Probe. Dann sichere Deckglas an Ort und Stelle mit Nagellack. </li><li> Ansicht montiert Probe mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal.">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li><li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+identity,+morphology,+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila.">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll liefert ein Verfahren zur Immunfärbung erfolgreich in situ gezielt Drosophila embryonalen und larvalen Geweben, wodurch die Notwendigkeit für die Präparation. Nach vor-Protokolle für die Färbung frühen Embryonen 1,2,3 ist der Chorion-Membran mit 50% Bleichmittel (NaOCl) entfernt. Proben werden in Formaldehyd und Methanol fixiert. Weil die Larvencuticula verursacht älteren Probe zu schweben, wird die gesamte Probe dann durch eine Zell-Sieb geleitet, um Larven Retention...

Drosophila-Embryonen und Larven bieten ein hervorragendes Modell, um Entwicklungsprozesse in vielen Organen und Geweben zu untersuchen. Imaging von einzelnen Zellen ist notwendig, um die komplexen Umgebungen, in denen Zellen entwickeln oft festzustellen, die in diesen Studien notwendig. Visualisierung von Zellen im Gewebe durch Immunfärbung erreicht werden. Gut beschriebene Immunfärbung Protokolle für embryonale Gewebe Drosophila &lt;17 Stunden nach der Eiablage (AEL) 1-3 existieren. Jedoch kann eine Schutz Kutikula Formen gegen Ende der Embryogenese und verhindert wirksam Antikörper Permeation. Somit sind diese Immunfärbung Protokolle ineffizient bei der Analyse von Gewebe in der späten Phase Embryonen und in nachfolgenden Stufen der Larvenentwicklung (1. Larvenstadium (L1), 2. Larvenstadium (L2), und 3. Larvenstadium (L3)). Diese Ineffizienz erlegt eine Barriere, um unser Verständnis der dynamischen Prozesse, die während dieser erweiterten Entwicklungsphase 4 auftreten. Tissue Dissektion ist eine weit verwendete Technik, um diese Barriere zu umgehen 5-7. Allerdings kann Dissektion beweisen ineffizient. Die Extraktion kann durch Schwierigkeiten bei der Lokalisierung oder Isolieren embryonalen und Larvengewebe belastet werden. Darüber hinaus kann die physische Entfernung von Zielgeweben Schäden durch Zerreißen oder sie verstoßen, sie in ihrer Gesamtheit zu extrahieren verursachen. Ultraschallbehandlung ist ein Verfahren, das die Schallwellen verwendet, um intermolekulare Wechselwirkungen stören. Es wurde verwendet, um die Integrität des Drosophila Larvencuticula um Immunfärbung entwickeln neuronalen Zelltypen 6 zu stören. Dieses Protokoll wurde angepasst, um im Spätstadium der embryonalen und Larven Gonaden, die so klein wie 50 um im Durchmesser 8-10 sein können Immunfärbung. Durch solche Studien hat der Prozess der männlichen Keimbahn-Stammzellen (GSC) Nischenbildung im späten Stadium charakterisiert Drosophila-Embryos 8-10 und Mechanismen, die der Stammzellentwicklung und difzierung im späten Stadium der embryonalen Keimdrüsen und Larven sind aufgeklärt worden 9-12. So stellt Beschallung eine effiziente Alternative zu Gewebedissektion die schwierig sein kann, weil der Gewebegröße. Darüber hinaus ermöglicht es die Immunfärbung von Drosophila Gewebe in situ, so dass Zellen im Kontext des Gesamtorganismus und die Aufrechterhaltung in situ Morphologie. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Fluoreszenz-Immunfärbung von Spätstadium der embryonalen bis Anfang / Mitte L3 Gewebe in situ. Analyse von Drosophila Gonaden und Nervengewebe in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, um die Wirksamkeit dieses Protokoll zu demonstrieren. Weiterhin kann diese Immunofärbungsprotokoll angepasst anderen Drosophila-Gewebe sowie Gewebe in anderen Organismen mit einem äußeren Nagelhaut zu analysieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1: Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)</td>
			<td>For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)</td>
			<td>For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4</td>
			<td>Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEMS</td>
			<td>0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH</td>
			<td>Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>37% formaldehyde by weight in methanol</td>
			<td>Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>n-Heptane</td>
			<td>CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Methanol</td>
			<td>CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Tween (PBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%</td>
			<td>Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O</td>
			<td>Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td>To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol</td>
			<td>In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution</td>
			<td>1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)</td>
			<td>Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple juice plates</td>
			<td>To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O</td>
			<td>Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept 10%</td>
			<td>To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol</td>
			<td>Store aliquots at -20 degrees C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast paste</td>
			<td>~50 g Dry Active Yeast</td>
			<td>Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2: Staining Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571 //// Stock at 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-Vasa</td>
			<td>1:250</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Ruth Lehmann</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Fasciclin III</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>7G10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-1B1</td>
			<td>1:4</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>1B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guniea pig anti-Traffic Jam</td>
			<td>1:2500</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prospero</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Prospero MR1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-Elav</td>
			<td>1:30</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Rat-elav 7EBA10 anti-elav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Repo</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>8D12 anti-Repo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa546</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-guniea pig Alexa633</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rat Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3: Materials and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Cages</td>
			<td>Hand-made; Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101</td>
			<td>Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model: Branson Digital Sonifier 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model #: 102C (CE)</td>
			<td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-25-20</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software</td>
			<td>Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.</td>
			<td>Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>450-0020</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sonication-facilitated immunofluorescence staining of late-stage embryonic and larval drosophila tissues in situ

Studien in Drosophila melanogaster Embryonen durchgeführt und Larven stellen eine wichtige Einblicke in Entwicklungsprozesse wie Zell Schicksal Spezifikation und Organogenese. Immunfärbung ermöglicht die Visualisierung von sich entwickelnden Geweben und Organen. Eine Schutz Kutikula, die am Ende der Embryogenese bildet Jedoch verhindert die Permeation von Antikörpern in der späten Phase Embryonen und Larven. Während Dissektion vor der Immunfärbung wird regelmäßig verwendet werden, um Drosophila Larven Gewebe zu analysieren, erweist es sich als ineffizient für einige Analysen, weil kleine Gewebe kann schwierig sein, zu lokalisieren und zu isolieren. Beschallung stellt eine Alternative zur Dissektion in Larven von Drosophila-Immunfärbung Protokolle. Es ermöglicht die schnelle, gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Late-Stage-Embryonen und Larven und pflegt in situ Morphologie. Nach Fixierung in Formaldehyd wird eine Probe beschallt. Probe wird dann auf die Immunfärbung mit Antigen-spezifischen primären ant unteribodies und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper zur Zielzelltypen und bestimmte Proteine ​​über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Während des Prozesses der Ultraschallbehandlung ist die richtige Plazierung einer Beschallungssonde über der Probe, sowie die Dauer und die Intensität der Beschallung, kritisch. Für hohe Qualität Flecken können Zusätzliche kleinere Änderungen zur Standard-Immunfärbung Protokolle erforderlich. Antikörper mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis, in der Regel längere Inkubationszeiten erforderlich. Als Beweis für dieses Konzept Beschallung-Protokoll erleichtert, zeigen wir Immunfärbungen der drei Gewebetypen (Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe) mit einer Reihe von Entwicklungsstufen.

Um die Wirksamkeit von Ultraschall-basierten Immunfärbung in der Analyse von Spätstadium der embryonalen und Larvengewebe in situ zu zeigen, wurden Wildtyp-Embryonen und Larven für Immunfärbung von Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe verarbeitet. Proben wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet und repräsentative Ergebnisse sind dargestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Protokoll ist während der späten embryonalen bis An...

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Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

12.5K Aufrufe.  College of William & Mary. Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae. 

Serie: Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Forschung

Biologie

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larven NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung für Formalin fixiert Nierengewebe

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...