Die Autoren möchten sich bei allen Mitgliedern des Labors von Dr. Barletta und Dr. Powers für hilfreiche Kommentare bei der Entwicklung des Protokolls. Wir danken Wendy Austin für hilfreiche Diskussionen und Korrekturlesen des Manuskripts. Die Arbeit in diesem Manuskript beschrieben wurde durch Samen Pilotbeihilfen jeder Ermittler oben von der University of Nebraska-Lincoln Redox Biology Center (parent Grant # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI) aufgeführt finanziert. Darüber hinaus danken wir Dr. Ofelia Chacon für die Bereitstellung von Mitteln aus ihrem R21 Zuschuss (1R21AI087561-01A1) für Forschung Lieferungen und Mr. Halouska partielle Gehalts Unterstützung NMR-Techniken in dieser Veröffentlichung enthaltenen standardisieren.

Ein. Protokoll Text Dieses Protokoll zeigt die Anpassung der NMR-Methodik auf M. Tuberkulose (Klasse III-Agent). Daher müssen Biosafety Level 3 (BSL3) Praktiken zu beachten bei der Durchführung von M. Tuberkulose-Forschung in einem jährlich zertifizierten Labor. Exposition gegenüber Labor erzeugten Aerosole ist die wichtigste Gefahren durch Personal, das mit diesen Mikroorganismen auftreten. Die folgenden Verfahren werden an unserem Institut durchgeführt und Variationen auf der Institutional Biosafety Committee, basiert auf Empfehlungen existieren. Gemeinsame persönliche Schutzausrüstung wird aus einem Tyvek Anzug, bouffant Kappe, Booties, N95 Atemschutzmaske, Schutzbrille, Ärmeln und einem doppelten Paar Nitril-Handschuhe bestehen. Arbeiten, bei denen M. tuberculosis Kulturen und / oder Manipulationen mit offenen M. Tuberkulose Behälter in der Art A2 oder B2 biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt. Kunststoff-saugfähigen Papier ist auf der w platziertBetriebsstrom Oberfläche. Alle Materialien / supplies zu entsorgen oder entfernt werden aus der Anlage muss in zwei biohazard Taschen platziert und dekontaminiert werden durch Autoklavieren. Arbeitsflächen und Geräte im Schrank (FastPrep-24 Lyse Homogenisator, Spektralphotometer, Eimer mit Eis, etc.) verwendet muss nach jeder Arbeitssitzung mit 1% Amphyl (tuberkulozid, bakterizide, fungizide und viruzide Mittel) desinfiziert werden. M. tuberculosis Kulturen müssen unter doppelter Containment für den Transport zu größeren Anlagen außerhalb der biologischen Sicherheitswerkbank wie Gefriergeräte, Inkubatoren, Zentrifugen, Kühlschränke platziert. Zentrifugation mit beiliegenden Sicherheitshinweise Tassen und O-Ring Schraubverschluss Röhrchen durchgeführt. Zur weiteren Analyse außerhalb des BSL3 Labor werden zellfreie Extrakte durch einen 0,2 um Filter oder Mikroorganismen Wärme bei 95 ° C für 15 min getötet filtriert. 2 Proben werden ausplattiert, um die Abwesenheit von koloniebildenden Einheiten vor der Entfernung aus Containment verifizieren. <ol><li> Übertragen 110 ml Middlebrook 7H9 komplette Medien enthaltend Polysorbat 80 (Tween 80, um Verklumpen zu verhindern) Brühe (MADC-TW) oder einem geeigneten Medium in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Dreifachen Kulturen pro Bedingung werden routinemäßig gewachsen, wenn mittels 13 C-Metaboliten, und zehn identischen Kulturen werden für 1D 1 H NMR Profilierung gewachsen. Für zwei Bedingungen (z. B. mit und ohne Zusatz von Wirkstoff), doppelte Volumen Kultur pro Wiederholung können gezüchtet und aufgeteilt in zwei identische Kulturen. Alle Rezepturen Reagenz und Lösung befinden sich am Ende des Protokolls bereitgestellt. </li><li> Beimpfen Brühe mit 0,150 ml M. Tuberkulose 50% Glycerin Lager (lassen auf Eis auftauen). Siehe Hinweis 1 unten. </li><li> Lassen die Kultur bei 37 ° C wachsen Schütteln bei 100 Upm für ungefähr 6 Tage (OD 600 von 0,6 bis 0,8). Siehe Anmerkung 2 unten. </li><li> Wenn keine Antibiotika, alternative Zugänge oder andere Behandlungen notwendig sind, sind die Kulturen bereit, geerntet werden. Wenn Behandlungen verwendet werden, weiterhindirekt zu Schritt 5. Verschmutzung Tests phänotypische Analyse, PCR-Tests: Entfernen einer 0,5-ml-Probe von jeder Flasche, in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bei 4 ° C für Kultur Titration und Qualitätskontrolle zu übertragen. Siehe Anmerkung 3 unten. An diesem Punkt, fahren Sie mit Schritt 6 fort. </li><li> Entfernen Kolben aus Shaker und führen Sie die gewünschte Behandlung (z. B. fügen Medikament oder Metaboliten). Ort flaschen wieder in den Shaker geben und inkubieren für einen zusätzlichen Zeitraum (zB 6-18 h). Am Ende dieser Zeit nehmen weitere 1,0 ml Aliquots und bestimmen OD 600. Entfernen einer 0,5-ml-Probe von jeder Flasche, in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bei 4 ° C für Kultur Titration und Qualitätskontrolle zu übertragen. </li><li> Ort Kulturen auf Eis für 5 min. Nach diesem Schritt verlassen Zellen auf Eis während des gesamten verbleibenden Protokoll. Ernte Kulturen durch Zentrifugation bei 2.000 × g und 4 ° C für 15 min in 50 ml Röhrchen mit einer Tischzentrifuge. Jede Kultur wird vier Röhren mit je 25 ml (insgesamt 1 erfordern00 ml erforderlich ist, um ein ausreichendes Signal-zu-Rausch für 2D 1 zu erhalten H-13 C-NMR-Experimente, in denen nur 50 ml pro Kultur für 1D 1 H-NMR-Experimente erforderlich ist). </li><li> Waschen jedem Zellpellet zweimal mit eiskalter ddH 2 O (ca. 15 ml das erste Mal, und 10 ml zum zweiten Mal) durch die Zentrifugation oben beschriebenen Parameter. Für das zweite waschen, kombinieren die 10 ml Aliquots in das gleiche Rohr vor dem Spinnen. Zellpellet in einem Endvolumen von 1,0 ml ddH 2 O (müssen für Zellpellet Lautstärke). Wenn eine einzelne Zellsuspension frei von Verklumpungen bei diesem Schritt gewünscht wird, können die Zellen kurz beschallt werden und / oder durch einen 27-G-Nadel dreimal. Alternativ kann das Zellpellet bei -80 ° C eingefroren und gelagert werden bis zur weiteren Verarbeitung. Im letzteren Fall werden gefrorenen Pellets auf Eis vor Resuspendierung aufgetaut. Resuspendieren der Zellpellets in einem Endvolumen von 1,0 ml ddH 2 O wie oben angegeben. </li><li> Transfer die 1,0 ml Zellsuspension auf eine 2,0 ml Schraubverschluss Röhrchen mit Lysing Matrix B (0,1 mm Silica-Kügelchen). Legen Sie die FastPrep-24 Lyse Homogenisator im Biosicherheitswerkbank. Setze die Proben in den Probenhalter, Befestigen der Retention sprach Platte oben auf dem Rohr. Verarbeiten der Proben für 60 sec in dem Homogenisator bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 6 m / sec. </li><li> Dreh die Proben in einer Mikrozentrifuge bei 15.000 × g und 4 ° C für 10 min bis Pellet Zelltrümmer und intakten Zellen. </li><li> Überstand entfernen und Pass Probe durch einen Spritzenfilter (0,2 pm) in einem sterilen Röhrchen. Platte 0,1 ml Probe (oder einem repräsentativen Anteil der Probe, wie z. B. 10%) auf MADC Agar, um zu überprüfen, dass keine lebensfähigen Zellen. Die Ermittler können auch bei mehr als einem Filtrationsschritt und / oder Überprüfung der Anwesenheit von lebensfähigen Zellen in den Extrakten mittels Live-dead Färbeverfahren um so zu verhindern oder zu identifizieren, mögliche biologische Sicherheit betrifft. Einfrieren Proben in einem Ethanol-Trockeneisbad aufzubewahrenbei -80 ° C, bis sie bereit sind, lyophilisiert und in einem NMR-Anlage verarbeitet werden sollen. </li><li> Nach 2 Monaten, überprüfen Platten, um die Abwesenheit von koloniebildenden Einheiten verifizieren. Wenn keine CFU gefunden werden, können Proben aus der BSL3 Labor gebracht werden. Die weitere Analyse erfolgt in einem Standard-NMR-Anlage, die in der Regel dient Multi-User und betreibt unter keinen spezifischen Einschließungsmaßnahmen Anforderungen durchgeführt. </li><li> Lyophilisieren die Proben bis zur Trockenheit, dann in 0,7 ml-NMR-Puffer und Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen resuspendieren. Zentrifuge für 3 min bei 13.000 x g. Entfernen Sie 0,6 ml und Transfer zu einem 5 mm-NMR-Röhrchen. Alternativ könnte lyophilisierten Proben zu einer externen Anlage als nicht-infektiöses regelmäßigen Proben verschickt werden. </li><li> NMR-Daten werden sofort aufgefangen. Trotz aller Vorsichtsmaßnahmen kann aktive Enzyme noch vorhanden sein und die Probe ist in der Regel nicht für längere Zeit stabil. Veränderungen in der NMR-Spektrum sind bemerkbar, wenn die Proben durchgeführt werden, bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für m linksehr als 1 Woche. Außerdem wird NMR Datenerhebung zwischen unbehandelten und Drogen behandelten Kulturen, wo die Proben nach dem Zufallsprinzip aus jeder Kategorie ausgewählt werden abgewechselt. Dadurch werden unnötige Bias weil eine bestimmte Kategorie hatte eine längere Verzögerung, bevor die NMR-Spektren wurden gesammelt. Eine Vorspannung in den Daten auftreten würde, wenn die NMR-Spektren für alle unbehandelten Proben wurden zunächst gesammelt und dann gefolgt von den Wirkstoff behandelten Proben. Wenn die Proben nicht sofort durch NMR analysiert werden sollen, sollten die Proben in 1 ml Eppendorfröhrchen bei -80 ° C gelagert werden </li><li> Nach dem Einlegen der Proben in einem BACS-120 Probenwechsler, Gerätekalibrierung, die ein paar Routine-Schritte wie Schloss, Shim, Abstimmung und Optimierung der 90 ° Impulslänge beinhaltet, ist erforderlich, um die Qualität der Ergebnisse zu maximieren. Eine einzelne Probe wird verwendet, um die 90 ° Pulslänge kalibrieren und stimmen das Instrument für die verbleibenden Proben. Sperren, Shim und NMR Datenerfassung für jede Probe ist eine automatisierte using ICONNMR und gradshim. </li><li> Ein 1D 1 H-NMR-Spektrum wird gesammelt, indem die Bruker zgesgp Impulsfolge mit Wasser Suppression mittels Anregung Bildhauerei. Insgesamt 32k Datenpunkte mit einem Sweep Breite 5482.5Hz, 128 Scans, und 16 Dummy-Scans verwendet werden. Ein 2D-1 H-13 C-HSQC-Spektrum gesammelt mit dem Bruker hsqcetgp Impulsfolge. Insgesamt 2048 Datenpunkte mit einem Sweep Breite von 5000,0 Hz ist auf dem direkten 1 H-Maß gesammelt und 64 Datenpunkte mit einem Sweep Breite von 18864,9 Hz entlang der indirekten 13 C Dimension. Das Spektrum wird mit 128 Scans und 16 Dummy Scans gesammelt, um gute Signal-Rausch erhalten. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein Flussdiagramm der experimentellen Verfahren dargestellt. NMR-Puffer Stammlösung von 50 mM Kaliumphosphat Schwabbelscheibeer mit 50 uM TMSP: <ul><li> 2,17 g K 2 HPO 4 (Kaliumchlorid Dinatriumhydrogenphosphat) </li><li> 1,70 g KH 2 PO 4 (Kaliumphosphat einbasischen) </li><li> 7,86 mg Natrium-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98%)) </li><li> Man löst in 500 ml von &quot;100%&quot; D 2 O </li><li> Die endgültige Lösung sollte mit einer pH-Wert 7,2 (unkorrigiert) sein </li></ul> MADC-TW oder MOADC-TW (1 L) <ul><li> 4,7 g Middlebrook 7H9 Bouillon Basis </li><li> 900 ml ddH 2 O </li><li> 2 ml Glycerin </li><li> Mischen Sie die Komponenten und Autoklaven für 25 min. Kühle Flüssigkeit zu berühren und fügen Sie die folgenden Lösungen: </li><li> 100 ml ADC bei der Vorbereitung MADC oder 100 ml OADC bei der Vorbereitung MOADC </li><li> 2,5 ml 20% Tween 80 (alternativ 1 ml nicht metabolisierbaren 20% Tyloxapol) </li><li> 10 ml 1% Cycloheximid </li></ul> ADC (1 L) <ul><li> 20 g D (+)-Glucose </li><li> 50 g BSA FractionV </li><li> 8,5 g NaCl </li><li> 800 ml ddH 2 O </li><li> Lösen Sie zusammen, die Lautstärke auf 1 L und sterilisieren mit 0,2 um Filter. Lagerung bei 4 ° C. </li></ul> Alternativ dazu OADC (1L) vorzubereiten, fügen Sie alle oben genannten Komponenten plus 50 ml 1% Ölsäure (Rezept unten macht eine 250 ml Charge) aufgeführt. Lösen Sie zusammen, die Lautstärke auf 1 L und sterilisieren mit 0,2 um Filter. Flasche muss in Alufolie und bei 4 ° C gewickelt werden <ul><li> 2,5 g Ölsäure </li><li> 250 ml 0,2 M NaOH </li><li> Auftau Ölsäure (verfestigt sich beim kälte) durch Erhitzen bei 55 ° C für 10 min und in den NaOH-Lösung und Wärme unter Rühren für 60 min. Store in sterile Glasflaschen, die in Aluminiumfolie eingewickelt werden. Seal Flaschen mit Parafilm und bei 4 ° C. </li></ul> Falls gewünscht, können Sie kommerziellen BD BBL Middlebrook ADC oder OADC mit Katalase Enrichment erwerben. 1% Cycloheximid (100ml) </strong&gt; <ul><li> 1 g Cycloheximid </li><li> 100 ml ddH 2 O </li></ul> Auflösen und sterilisieren mit 0,2 um Filter. Lagerung bei 4 ° C. Achtung: Cycloheximid ist giftig so mit äußerster Sorgfalt. 20% (v / v) Tween 80 (100ml) <ul><li> 20 ml Tween 80 </li><li> 80 ml ​​ddH 2 O </li></ul> Alternativ wiegen 20 g Tween 80 (etwa 18,9 ml; Dichte 1,06 g / ml), auf 20% w / v-Lösung herzustellen. Wärme-Lösung auf 55 ° C für 30 min auflösen und mischen vollständig. Sterilisieren Flüssigkeit mit einem 0,2 um Filter. Bewahren Sie die endgültige Lösung bei Raumtemperatur. 20% (v / v) Tyloxapol (100ml) <ul><li> 20 ml Tyloxapol </li><li> 80 ml ​​ddH 2 O </li></ul> Alternativ wiegen 20 g Tyloxapol (ca. 18,2 ml; Dichte 1,1 g / ml), auf 20% w / v-Lösung herzustellen. Wärme-Lösung auf 55 ° C für 30 min bis dissolve und mischen vollständig. Sterilisieren Flüssigkeit mit einem 0,2 um Filter. Bewahren Sie die endgültige Lösung bei Raumtemperatur. Hinweis 1: Glycerol Bestände M. tuberculosis werden unter Verwendung des folgenden Protokolls. Stocking von M. Tuberkulose <ul><li> Wachsen M. tuberculosis in 50 ml MADC zur Sättigung (OD 600 = 1,5 bis 2,0) bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen (100 rpm). Je nach Beanspruchung, dafür wird er 7-14 Tage. </li><li> Spin Proben bei 2.000 × g bei 4 ° C für 15 min bis Pellet Kultur. Überstand entfernen. </li><li> Resuspendieren in 6 ml sterile 50% Glycerin. </li><li> Aliquot 1,5 ml in 4 Corning Kryoröhrchen und Label angemessen. </li><li> Unmittelbar Blitzeis Fläschchen in Ethanol / Trockeneis-Bad und bei -80 ° C. </li></ul> Hinweis 2: Beimpfen Stamm H37Rv (-80 ° C Aktien bis zu 1,5 Jahre alt) in 70 ml MADC Medien ergibt sich eine OD 600 &lt;/ Sub&gt; von etwa 0,6 nach 5 Tagen Wachstum bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen (100 rpm) in einem Innova 40 Shaker. Hinweis 3: Um Kultur Verunreinigungen testen, Ermittler könnte eine Kultur Aliquot auf Standard-Vollmedium impfen und überprüfen Abwesenheit von Wachstum nach Inkubation über Nacht. Routinemäßig werden Kulturen auf MADC Agar zur Koloniemorphologie beobachten und untersuchen, indem Phasenkontrast-Mikroskopie. Wenn gewünscht, Kulturen können durch PCR unter Verwendung überprüft werden IS 6110 Primer wie beschrieben. 3 2. Repräsentative Ergebnisse Eine Probe, die gut vorbereitet wird, wird ein NMR-Spektrum zu erhalten, ähnlich dem in 2 dargestellt. Dieses Spektrum ist eine Darstellung des M. tuberculosis Wildtyp metabolischen Pool. Die identifizierten Metaboliten sind direkt oder indirekt mit dem D-Alanin-pathway. Auch ist die Größe der Peakintensitäten proportional Metabolitkonzentrationen präsentierenim Zellextrakt. Deshalb Veränderungen in Peakintensitäten zwischen unbehandelten Kulturen, medikamentöse Behandlung und Mutanten können angeben, Störungen in Metaboliten und Stoffwechselwege. Der M. Tuberkulose 1D 1 H-NMR-Spektren wurden auf einem Bruker Avance 500 MHz-Spektrometer mit einer Dreifach-Resonanz, Z-Achsen-Gradienten Kryosonde ausgestattet gesammelt. Das Spektrum enthält ca. 400 Spitzen, von dem es möglich war, zu identifizieren und zu quantifizieren, 40-50 Metaboliten, einschließlich Aminosäuren, Nucleotidvorläufer und glykolytische und Zitronensäure Zwischenprodukte. Ein BACS-120 Probenwechsler mit Bruker Icon Software wurde verwendet, um die NMR Datenerfassung zu automatisieren. 1D 1 H-NMR-Spektren wurden unter Verwendung Anregung sculpting 4 bis effizient entfernen des Lösungsmittels und die Aufrechterhaltung eines flachen Basislinie, sodass keine Notwendigkeit Basislinie Auflistung, die Artefakte in den nachfolgenden Hauptkomponentenanalyse (PCA) oder Partial Least Squares orthogonalen Diskriminanzanalyse kann induzieren (OPLS- DA). A 1D 1 H-NMR-Spektrum wird bei 25 ° C mit einer spektralen Breite von 5482,5 Hz und 32K Datenpunkte gesammelt. Insgesamt 16 Dummy Scans und 128 Scans wurden verwendet, um das Spektrum zu erhalten. Der ACD Labs 1D-NMR-Prozessor-Software wurde auf semi-automatisch verarbeiten alle 1D 1 H-NMR-Spektren verwendet. Die Spektren wurden Fourier-Transformation, auslaufen, und bezogen auf den TMSP peak (0,0 ppm). Die NMRpipe Softwarepaket wurde verwendet, um einzeln verarbeiten 2D 1 H-13 C-NMR-Spektren und analysiert mit NMRDraw. Die Bruker FID Datendatei zuerst wurde in ein Dateiformat erkennbar NMRpipe umgewandelt und dann das Spektrum wurde fouriertransformierten, korrigierte Phase und Null gefüllt. Die beobachteten Spitzen in dem NMR-1D 1 H NMR-Spektrum und 2D 1 H-13 C-NMR-Spektrum sind bestimmten Metaboliten unter Verwendung von 1 H und 13 C-chemische Verschiebung Toleranzen von 0,05 und 0,50 ppm, und die Madison Metabolomics Consortium Datenbank (MMCD zugeordneten ), <sup&gt; 5 die BioMagResBank, 6 und das menschliche Metabolomanalyse Database. 7 Insbesondere sind die 1D-und 2D-NMR-Spektren manuell Spitze gepflückt, wo die Peak-Liste der NMR chemischen Verschiebungen wird dann auf die menschliche Metabolomanalyse Database hochgeladen. Die Metaboliten von der Human Metabolomanalyse Datenbank identifiziert sind, um das NMR-Spektrum sowohl die Maximierung der Anzahl der übereinstimmenden NMR Resonanzen und die Zugehörigkeit zu einer metabolischen Netzwerks zugewiesen. Jede Verbindung oder Metaboliten in der Regel mehrere CH-Paare und entsprechend mehrere NMR-Resonanzen. Somit kann die mehrere dieser NMR-Signale, die in der experimentellen NMR-Spektrum beobachtet werden, desto wahrscheinlicher ist der Metabolit vorliegt. Auch die Ermittlung mehrerer Metaboliten assoziieren mit den gleichen Stoffwechselweg erhöht die Wahrscheinlichkeit der richtigen Zuordnungen. Das Vorhandensein von Metaboliten und Stoffwechselwege sind mit dem Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome (KEGG) 8 und den MetaCyc Datenbanken überprüft. 9 Mycobacterium smegmatis ist ein nützliches Modell für M. Tuberkulose und anderen mykobakteriellen Erregern. Wie an anderer Stelle beschrieben, Proben von M. smegmatis könnte auch durch Ultraschall aufgebrochen werden. 10 <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3673/3673fig2.jpg" /> Abbildung 2. 1D 1 H NMR-Spektrum von Mycobacterium tuberculosis Zellextrakt. NMR-Peaks mit repräsentativen Metaboliten verbunden sind beschriftet. Abkürzungen sind: AMP, Adenosin Mono Phosphat; α-kg, α-Ketoglutarat; Glu, Glutamate, und Ala, Alanin.

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function:+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase.">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li><li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection.">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis.">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li><li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1.">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria:+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system.">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li><li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(LC-MS)+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery.">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li><li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy:+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox.">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li><li>Simpson, R. J., Inglis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).</li><li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis.">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li><li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis:+an+unexpected+frontier.">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li><li>Who. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+Organization.">Health Organization.</a> Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).</li><li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensively+drug-resistant+tuberculosis.">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine beträchtliche Anzahl von Studien haben die Transkriptom-und Proteom-Profile von M. analysiert Tuberkulose unter einer Vielzahl von in vitro und in vivo-Bedingungen. 11-16 Letztlich Veränderungen in der Genexpression und Enzymaktivität von Variationen in den Konzentrationen der niedermolekulare Moleküle führen. Die vollständige Beschreibung dieser Verbindungen bildet den Metabolom. So können die Auswirkungen von Drogen und unterschiedlichen Wachstumsbedingungen a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> ADC Enrichment </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Sample Changer </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bruker Avance NMR </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Fraktion V </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml sterile Polypropylen </td></tr><tr><td> Kryoröhrchen </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2,0 ml sterile Polypropylen </td></tr><tr><td> Cyclohexanolximide </td><td> AG Scientific </td><td> C-1189 </td><td> Giftig </td></tr><tr><td> D (+) - Glucose </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Deuteriumoxid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyerkolben </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Sterile, abgeflachter, Polycarbonat, 0,22 um PTFE-Membran belüftete Kappe </td></tr><tr><td> Blitzeis Flask </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Gefriertrocknungsanlage </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4,5 L Benchtop </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> New Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> Benchtop Schüttler </td></tr><tr><td> Lysing Matrix B </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Lysis Maschine </td><td> MP Biomedicals </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 Broth </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR-Röhrchen </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> OADC Enrichment </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Ölsäure </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat Dibasic </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Kalium monobasisches </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - Microfuge 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Sealed und Polypropylen </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Mit bio-zertifizierten Abdeckungen </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge Isotope </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Spektralphotometer Küvetten </td><td> Rettungsleine </td><td> LS-2410 </td><td> 1,5 ml Polystyrol, 2 klare Seiten </td></tr><tr><td> Spritze </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Sterile, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Syringe Filter </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> 0,2 um sterile Celluloseacetat </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation of mycobacterium tuberculosis extracts for nuclear magnetic resonance metabolomic studies

Mycobacterium tuberculosis ist eine der Hauptursachen der Sterblichkeit des Menschen auf einer globalen Skala. Die Entstehung der beiden Multi-(MDR) und extensiv-(XDR) resistente Stämme droht aktuellen Seuchenbekämpfung Bemühungen entgleisen. So gibt es ein dringender Bedarf an Medikamenten und Impfstoffen, die wirksamer als die gegenwärtig verfügbar sind zu entwickeln. Das Genom von M. Tuberkulose ist seit mehr als 10 Jahren bekannt, doch gibt es erhebliche Lücken in unserem Wissen von Genfunktionen und Wesentlichkeit. Viele Studien haben seit Genexpressionsanalyse an beiden transkriptomischen und Proteomik-Ebenen verwendet werden, um die Auswirkungen von Medikamenten, Oxidantien und Wachstumsbedingungen in globalen Muster der Genexpression zu bestimmen. Letztlich wird die endgültige Antwort dieser Veränderungen in der Zusammensetzung des metabolischen Bakterium einschließlich einiger tausend kleinem Molekulargewicht Chemikalien reflektiert. Vergleicht man die metabolische Profile von Wildtyp-und mutierten Stämmen, entweder unbehandelt oder treated mit einem bestimmten Wirkstoff, kann effektiv ermöglichen Zielidentifikation und kann zur Entwicklung von neuartigen Inhibitoren mit Anti-Tuberkulose-Aktivität führen. Ebenso können die Wirkungen von zwei oder mehreren Bedingungen auf der Metabolom ebenfalls bewertet werden. Kernspinresonanz (NMR) ist eine leistungsstarke Technologie, die zur Identifizierung und Quantifizierung von Stoffwechsel-Zwischenprodukte wird. Bei diesem Protokoll, Verfahren zur Herstellung von M. Tuberkulose Zellextrakten für NMR metabolomische Analyse beschrieben. Zellkulturen werden unter geeigneten Bedingungen und erforderlichen Biosicherheitsstufe 3 Containment, 1 geerntet gewachsen, und mechanischen Lyse unter Beibehaltung Kälte zur Konservierung von Metaboliten zu maximieren. Zelllysaten gewonnen werden, gefiltert sterilisiert, und bei extrem niedrigen Temperaturen. Aliquots von diesen Zellextrakte auf Middlebrook 7H9 Agar für koloniebildenden Einheiten der Abwesenheit von lebensfähigen Zellen zu überprüfen ausplattiert. Nach zwei Monaten Inkubation bei 37 ° C, wenn kein viLage Kolonien beobachtet werden, werden Proben aus dem Containment Anlage zur Weiterverarbeitung entfernt. Extrakte werden lyophilisiert, erneut in deuteriertem Puffer und injiziert in der NMR-Gerät, Erfassen spektroskopischer Daten, die anschließend einer statistischen Analyse unterzogen wird. Die beschriebenen Verfahren können sowohl für eindimensionale (1D) 1 H-NMR-und zweidimensionaler (2D) 1 H-13 C-NMR-Analysen angewandt werden. Diese Methode liefert zuverlässigere geringem Molekulargewicht Identifizierung von Metaboliten und mehr zuverlässige und empfindliche quantitative Analysen der Zellextrakt metabolische Zusammensetzungen als chromatographischen Methoden. Variationen der beschriebenen Verfahren nach der Zelllyse Schritt kann auch für parallele Proteomanalyse angepasst werden.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Die metabolomische Profil<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Wird nach Wachstum in Bouillon-Kulturen bestimmt. Bedingungen können variiert werden, um die Wirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln, Oxidantien und Anti-Tuberkulose-Mittel auf das metabolische Profil von diesem Mikroorganismus getestet werden. Verfahren für Extraktzubereitung gilt sowohl für 1D<sup&gt; 1</sup&gt; H und 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C-NMR-Analysen.

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

sample-preparation-mycobacterium-tuberculosis-extracts-for-nuclear

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Principles of Nuclear Magnetic Resonance

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15.2K Aufrufe.  University of Nebraska-Lincoln. Die metabolomische Profil Mycobacterium tuberculosis Wird nach Wachstum in Bouillon-Kulturen bestimmt. Bedingungen können variiert werden, um die Wirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln, Oxidantien und Anti-Tuberkulose-Mittel auf das metabolische Profil von diesem Mikroorganismus getestet werden. Verfahren für Extraktzubereitung gilt sowohl für 1D 1 H und 2D 1 H- 13 C-NMR-Analysen.

Serie: Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...