Die Autoren möchten die folgenden Auszeichnungen NIH / subawards für die Unterstützung dieser Forschung zu bestätigen: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08 und P51OD011104.

1. Kalibrieren Mesodissection Instrument mit 2id Imaging Software Die 2id Imaging-Software wird entweder als Software oder des Programms für den Rest dieses Artikels bezeichnet werden. Dieser Schritt ist notwendig, um das Bild korrekt zu verfolgen sowie mehrere Dia-Rahmen auszurichten. <ol><li> Schalten Sie Gerät und Computer. </li><li> Offene Software und wählen Sie &quot;Kalibrierungsinstrument&quot;. </li><li> Kalibrieren Stufe Reise mit dem Joystick. Bewegen Bühne obere linke Position. Drücken Sie auf &quot;Set&quot; unter Schritt 1 in Programm. </li><li> Bewegen Bühne, um richtige Position zu senken. Drücken Sie auf &quot;Set&quot; unter Schritt 2 in Programm. </li><li> Kalibrieren Aspiration, indem Sie zuerst &quot;Z-Taste&quot;, um Kopfeinheit zu erhöhen. Drücken Sie auf &quot;absaugen Puls&quot; und &quot;Dissektion&quot;-Taste auf dem Joystick, bis Kolbensteuerstange erreicht Spitzenposition. Drücken Sie auf &quot;Set&quot; unter Schritt 3 des Programms. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Reset absaugen &amp;# 8221; -Taste. Sobald der Kolben hält an der unteren Position drücken Sie die &quot;Set&quot; in Schritt 4. </li><li> Klicken Sie auf das &quot;scale Register&quot;. </li><li> Zeigen Kalibrierung Lineal auf leere Seite. </li><li> Fokus Mikroskop, wenn nötig. </li><li> Zeichnet eine Linie zwischen den zwei Maßstäbe mit der Maus. </li><li> Geben Sie Abstand in Feld Schritt 2 Drücken Sie die &quot;Compute&quot;-Taste. Gekennzeichnet. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Fadenkreuz&quot;. Drehen Sie die Motordrehzahl auf 1. </li><li> Setzen Sie in den Kopf xScisor Montage. Niederkopf-Anordnung in z-Achse Bereitschaftsstellung mit der Taste &quot;z-Achse&quot;-Taste. HINWEIS: Die Kopfanordnung ist die große Struktur auf der Oberseite der Dissektionsinstrument. Die xScisor wird als Verbrauchs Mühle Bit für den Rest dieses Artikels bezeichnet werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Dissektion engagieren&quot;-Taste am Joystick. HINWEIS: Diese Taste ist auf der Oberseite des Joysticks befinden. </li><li> Drehzentrum visuell definieren. Um dies zu tun, bewegen Zentrum von Fadenkreuz über Drehzentrum mit definierend-Parameter in Schritt 1 des Programms. Verwenden Sie die Pfeile nach oben und unten in der &quot;x&quot; und &quot;y-Achse&quot; Bars, um die Pixel einstellen, um Fadenkreuz auszurichten. Klicken Sie auf &quot;Fertig&quot;-Registerkarte. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Home&quot;-Symbol. HINWEIS: Dies wird durch eine Haus-Bild in der rechten oberen Ecke vertreten. </li></ol> 2. Neues Referenzbild <ol><li> Zeigen H &amp; E-Rutsche auf der Bühne. Zeigen lichtundurchlässige Abdeckung oben auf der Folie. Fahren Sie das Gerät mit dem Joystick auf den gewünschten Bereich der H &amp; E-Rutsche. Speichern Sie die generierte Bild. HINWEIS: Entweder die Registerkarte &quot;capture Referenz&quot; oder Registerkarte &quot;sezieren&quot; kann verwendet werden, um diesen Schritt abzuschließen. </li></ol> 3. Richten Tissue für Dissection <ol><li> Klicken Sie auf die &quot;sezieren Gewebe&quot; Option auf dem Home-Bildschirm. </li><li> Füllen Sie die &quot;Betreiber&quot;, &quot;Dissektion Zugangsnummer&quot;, &quot;Referenz-Zugangsnummer&quot;, &quot;xScisor Barcode-Nummer,&quot; &amp; #8220; Dissektion Flüssigkeit Los-Nummer &quot;,&quot; xScisor Größe &quot;und&quot; Beschreibung &quot;in der Registerkarte&quot; Einstellungen &quot;. </li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;finden Gewebe&quot;. </li><li> Import Referenzbild zuvor gespeichert. </li><li> Legen Sie eine ungefärbte FFPE Rutsche von 5 Mikrometer Dicke auf der Bühne. Bewegen Stufe auf den gleichen Bereich wie der in dem Referenzbild dargestellt. Klicken Sie auf &quot;Bild einfügen&quot;-Registerkarte. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;align&quot;. Benutzen Sie die Maus und die zugehörigen Pfeile, um das Referenzbild auf die ungefärbten Bild auszurichten. </li></ol> 4. Kommentieren Slide <ol><li> Klicken Sie auf der Registerkarte &quot;kommentieren&quot;. </li><li> Benutzen Sie die Maus, um einen Kreis um den gewünschten Bereich der Folie, die mikrodissektiert werden ziehen. </li></ol> 5. Legen Verbrauchs Mühle Bit <ol><li> Füllen Verbrauchs Mühle bisschen mit gewünschten Puffer, hier PKD-Puffer, indem Sie den Kolben nach oben und unten in einer flüssigen Bewegung mehrere Male. Stellen Sie sicher, um Luft auszuschließenBlasen. </li><li> Heben Z-Achse mit der Taste &quot;Z-Achsen-Button&quot;. </li><li> Legen Verbrauchs Mühle in Bit Maschine. Tun Sie dies, indem Sie den Verbrauchs Mühle Bit in den oberen Teil der Maschine, so dass die weiße Linie auf der Gerätelinien mit der schwarzen Linie auf der Verbrauchs Mühle wenig. Drücken Sie auf &quot;Aspiration-Reset&quot;-Taste, damit Kolben, um in die richtige Position abgesenkt werden. HINWEIS: Es sollte einfach sein, die Verbrauchs Mühle bisschen gleiten. Wenn es nicht sicher, dass die Kerben korrekt ausgerichtet sind. </li><li> Nieder Z-Achse durch erneutes Drücken &quot;Z-Achse&quot;-Taste. </li></ol> 6. Dissect Tissue (Abbildung 4) <ol><li> Öffnen Sie Registerkarte &quot;sezieren&quot;. </li><li> Schalten Motor und Aspiration Geschwindigkeiten bis 1. </li><li> Aktivieren Sie &quot;Show-Tracking&quot;-Box. Anmerkung: Dies ermöglicht es dem Benutzer, den sezierten Bereich während der Dissektion Prozess zu visualisieren. </li><li> Einmal fertig zu sezieren, weiterhin halten Sie die Taste &quot;engagieren&quot; sowie &quot;absaugen &amp; #8221; Joystick-Taste während der Bewegung in einer Richtung gegen den Uhrzeigersinn, um Gewebe zu sezieren. </li><li> Fahren Sie gegen den Uhrzeigersinn, bis die sezieren absaugen &quot;voll&quot; Registerkarte wird rot. </li></ol> 7. Leeren und entfernen Verbrauchs Mühle Bit <ol><li> Legen Sie eine 0,5 ul-Mikrozentrifugenröhrchen unter der Spitze des Verbrauchs Mühle wenig. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Aspiration&quot; Steuerstange schnell auf Probe in Mikrozentrifugenröhrchen auszuwerfen. </li><li> Drücken Sie mit erhöhter Kraft zu gebrauchten Verbrauchs Mühle Bit auszuwerfen. </li><li> Spülen Gewebefragment durch Ziehen Kolben zurück. Drücken Sie den Kolben nach vorne, um verbleibende Probe in Verbrauchs Mühle etwas auszudrücken. Das Gewebefragment wird nun im Mikrozentrifugenröhrchen enthalten sein. </li></ol> 8. Lyse Probe mit Proteinase K Verdauung durch Wärmebehandlung Gefolgt <ol><li> In 70 ul TE pH 8,5, 5 ug Proteinase K, um Gewebeprobe gewonnen. </li><li> Zeigen Probe in programmierbare Heizkörper-Schüttler. </li><li> Vollständige Verdauung mit programmierbaren Heizkörper-Schüttler bei der folgenden Einstellung: 60 ˚ C für 30 min bei 1.500 min; 82 ˚ C für 15 min bei 1.500 min; und 25 ˚ C für 1 min bei 450 UpM. Die Probe ist nun bereit für Downstream-Anwendungen. </li></ol>

<ol>
	<li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques:+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens.">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li><li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections.">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li><li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains.">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li><li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis:+what+we+don't+know+can,+and+does,+hurt+us.">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodissection+of+fibrous+tissue.">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li><li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penitentiary+or+penthouse+condo:+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe's+point+of+view.">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li><li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis.">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li><li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor,+SigH.">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li><li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH.">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li><li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection.">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li><li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro,+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth.">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li><li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis.">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li></ol>

Die Autoren beschreiben, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Mesodissection ist eine Technik, die RNA-Extraktion aus pathologischen Läsion gleitet durch eine Vielzahl von Krankheitserregern verursacht angewendet werden können. Es ist eine Notwendigkeit, dass der Benutzer verfolgt das Bild und das Bild richtig ausgerichtet ist. Um dies zu erreichen, muss das Gerät nach den Anweisungen auf dem Imaging-Software kalibriert werden. Bei der Analyse, wenn die Dia-und Interessengebiet seziert nicht passen, muss der Benutzer das Gerät neu kalibriert werden. Ein weiterer wichtiger Schr...

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Die Proben wurden traditionell von Hand aus entweder ganze Gewebe oder Folien mit einer Nadel und Skalpell mikrodissektiert. Dies erfordert eine klare Trennung zwischen dem Gewebeschnitt des Interesses und der umgebenden Gewebe Abschnitten 2. Mit den Fortschritten in der aktuellen Molekularprofilierungstechnologie hat es einen zunehmenden Bedarf an Gewebe auf zellulärer Ebene zu bewerten. Aufgrund der Einschränkungen der manuellen Mikrodissektion wurden Techniken wie LCM gegründet, um größere Isolation Präzision ermöglichen. Diese Technik ermöglicht es dem Forscher, bestimmte Zellpopulationen aus verschiedenen Zelltypen und Objektträger, die dann für nachfolgende Assays wie Genexpressionsprofile verwendet werden können, zu isolieren. Obwohl sehr effektiv für die nachgeschalteten Tests ist LCM nicht ohne Einschränkungen. Erstens ist LCM ein teurer und zeitaufwendiger Prozess. Darüber hinaus aufgrund der instabilen Natur der RNA, ist es oft eine Herausforderung, qualitativ hochwertige RNA aus Proben LCM 2 zu erhalten. Aufgrund der disadvantages von LCM, werden neue Fortschritte in der Technologie-Mikrodissektion noch benötigt es leichter zugänglich für eine größere Anzahl von Forschern in einem erschwinglichen und zeitkritische Art und Weise zu machen. Ein solcher Fortschritt in der Technologie-Mikrodissektion jetzt ist eine Technik, die als mesodissection bekannt. Bei dieser Technik wird eine Maschine zum Fräsen die kommentierte Gewebeschnitt von Interesse verwendet und saugt sie in eine Mühle Verbrauchs Bit 3. Weiter kann diese Probe in einem Sammelrohr angesaugt und für Downstream-Anwendungen verwendet werden. Die Vorteile dieses Systems sind, dass es wesentlich kostengünstiger und zeitempfindlich. Nach unseren Erfahrungen kann das System die Präparation eines Lungen Granulomgewebe Abschnitt in zehn Minuten. Auf der anderen Seite würde wahrscheinlich erfordern traditionelle LCM Stunden, um den Vorgang abzuschließen. Das System erlaubt es dem Bediener, eine Referenz Schlitten zu laden, um als Vergleichs sowie Werkzeug für Anmerkungen verwendet. Zusätzlich wird ein Bericht generiert umreißt the-Bereich der Folie, die seziert wurde. Es gibt zwei Hauptnachteile auf mesodissection. Obwohl wirksame Extraktion bei mehreren Zellen, ist es schwierig, eine einzelne Zelle zu isolieren. Darüber hinaus ist die Genauigkeit des erzeugten Bildes nicht so klar wie bei Verwendung anderer Abbildungs ​​Mikroskopen. Tuberkulose (TB) ist eine Infektionskrankheit, die großen Killer der Menschheit weltweit und Ergebnisse aus einer Infektion mit Mtb. In einer Mehrzahl von Individuen, Aerosole Mtb ausgesetzt wird, wird die Infektion latent beschränkt. In mindestens 10 Millionen Menschen jährlich, kommt es zu aktiven TB-Erkrankung 4. Während der latenten Infektion wird Mtb innerhalb pathologische Lungenläsionen als Granulome bekannte enthalten. So wurde argumentiert, dass das Ergebnis der Mtb-Infektion ist auf der Ebene des Granuloms 5 entschieden. Hier zeigen wir, wie mesodissection kann verwendet werden, um Granulome von Mtb microdissect verursacht werden. Die verwendeten Foliensind von FFPE Lungengewebe von infizierten Rhesusaffen. Für den Zweck dieser Demonstration werden wir Granulomen in ihrer Gesamtheit zu sezieren. Wir zeigen auch, dass RNA aus dem wiederhergestellten Gewebe extrahiert werden. Diese Technik kann auf Gewebeproben von verschiedenen anderen Proben aufgetragen und dann für eine Vielzahl von Downstream-Assays verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">MeSectr</td>
			<td style="width:113px;">AvanSci Bio</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:195px;">Mesodissector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">400 nm xScisors</td>
			<td>AvanSci Bio</td>
			<td></td>
			<td>Other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">THOR</td>
			<td>AvanSci Bio</td>
			<td></td>
			<td>Programmable Heater-Shaker</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop2000</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy FFPE extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:108px;">73504</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ovation RNA-Seq FFPE System&#160;</td>
			<td>Nugen</td>
			<td align="right">7150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:108px;">28104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel microdissection approach to recovering mycobacterium tuberculosis specific transcripts from formalin fixed paraffin embedded lung granulomas

Mikrodissektion wurde zur Untersuchung von Gewebe an DNA-, RNA-und Protein-Ebene für über ein Jahrzehnt verwendet. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die häufigste Mikrodissektion Technik heute verwendet. Bei dieser Technik wird ein Laser verwendet, um fokal Schmelze eines thermoplastischen Membran, die einen dehydrierten Gewebeschnitt 1 überlagert. Der Gewebeschnitt Verbund wird dann angehoben und von der Membran getrennt. Obwohl diese Technik erfolgreich zur Gewebeuntersuchung verwendet werden, ist es zeitaufwendig und teuer. Weiterhin ist die erfolgreiche Abwicklung der Verfahren unter Verwendung dieser Technik erfordert die Verwendung eines Lasers, wodurch ihre Verwendung eingeschränkt wird. Eine neue erschwingliche und praktische Mikrodissektion Ansatz namens mesodissection ist eine mögliche Lösung, um die Fallstricke der LCM. Diese Technik nutzt die MESO-1/MeSectr System zu fräsen das gewünschte Gewebe von einem Schlitten montiert Gewebeprobe während gleichzeitig Aufnahme und Abgabe Flüssigkeit, um die gewünschte Gewebeprobe in erholenein Verbrauchs Mühle wenig. Bevor die Dissektion Prozess beginnt, richtet der Anwender die Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) gleitet mit einer Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)-Referenzrutsche. Danach annotiert der Bediener die gewünschte Dissektion Bereich und weiter zu den entsprechenden Segments zu sezieren. Das Programm erzeugt eine archivierte Bild der Dissektion. Der Hauptvorteil der mesodissection ist die kurze Dauer benötigt wird, um eine Folie zu zerlegen, wobei ein Durchschnitt von zehn Minuten von eingerichtet zu Generation in diesem Versuch probieren. Zusätzlich ist das System deutlich kostengünstiger und bedienerfreundlich. Ein kleiner Nachteil ist, dass es nicht so präzise wie Laser-Capture-Mikroskopie. In diesem Artikel zeigen wir, wie mesodissection kann verwendet werden, um RNA aus Folien aus FFPE Granulome durch Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht zu extrahieren.

Die oben genannte Protokoll zeigt, wie eine neue mesodissection Technik verwenden, um RNA aus FFPE-Gewebeschnitten zu extrahieren. Dieses Protokoll Wirksamkeit durch FFPE Folien Lunge Granulome von NHP mit MTB verschiedene infektiöse Stadien infiziert gezeigt. Fig. 1-3 sind Bilder des Instruments. Fig. 4 zeigt, wie die Dissektion Prozesses auftritt und das resultierende Bild durch die Software. Tabelle 1 erzeugten zeigt die Ergebnisse der RNA-Extraktion mit ei...

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A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

a-novel-microdissection-approach-to-recovering-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

7.9K Aufrufe.  Tulane National Primate Research Center.  Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome. 

Serie: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...