Diese Arbeit wurde vom NIH R01 AI073783 K. Teter finanziert. Wir danken Dr. Shane Massey um Hilfe bei der Entwicklung der subzellulären Fraktionierung-Protokoll und Helen Burress für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

1. Vorbereitung der Digitonin <ol><li> Add 500 mL 100% Ethanol zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in einem Heizblock bei 80 ° C für 10 min eingestellt. </li><li> Lösen von 2,5 mg Digitonin in 250 ul der beheizten Ethanol bis zu einer 1% Stammlösung von Digitonin zu produzieren. </li><li> So generieren Sie eine funktionierende Lösung von 0,04% Digitonin, dann werden 40 ul der Digitonin-Stammlösung zu 960 ul der HCN-Puffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-Ethylmaleimid, und ein Protease-Inhibitor Cocktail). </li></ol> 2. Zell-Rausch und Permeabilisierung Unsere Translokation Test kann auf eine Reihe von Toxinen und Zelllinien verwendet werden. Im Folgenden stellen wir ein detailliertes Protokoll für den Nachweis von Cholera-Toxin (CT). Eine Übersicht über die Vorgehensweise ist in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> HeLa-Zellen werden in 6-well-Platten mit 1 ml DMEM ausgesät ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika-Antimykotikumzu erreichen, 1x10 6 Zellen / Well nach einer Inkubation über Nacht bei 37 ° C. So generieren Sie genug zytosolische Toxin für reproduzierbare Detektion werden dreifachen Wells für jede Bedingung erforderlich. </li><li> Nach einer Inkubation über Nacht, ersetzen Sie das Kulturmedium mit 1 mL DMEM mit 100 ng / mL Gangliosid GM1. Dadurch erhöht sich die Anzahl der Bindungsstellen für CT, da die GM1-Rezeptor von CT in der Plasmamembran von Zellen, die eine Lösung von GM1 einlagern wird. </li><li> Nach einer 1 Std. Inkubation bei 37 ° C, entfernen Sie die GM1-haltigem Medium und die Zellen zweimal mit DMEM. Legen Sie dann die Zellen bei 4 ° C für 30 min in 1 ml DMEM mit 1 ug / ml CT. </li><li> Entfernen Sie das Toxin-haltigem Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit DMEM und inkubieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM bei 37 ° C für das gewünschte Zeitintervall (s). </li><li> Am Ende jeder Periode jagen, waschen Sie die Zellen mit PBS und Inkubation jede Vertiefung mit 250 ul 0,5 mM EDTA in PBS. Lassen Sie die Zellen sitzen für 10<html> min bei Raumtemperatur und entfernen Sie sie aus der 6-Well-Platte durch kräftiges Reiben mit einem p1000 Pipetman. Nach einem gut von Zellen gesammelt worden ist, kombinieren Sie es mit der zweiten und dann die dritte und aus dem gleichen Zustand. Zellschaber kann auch verwendet werden, um die Zellen zu sammeln. </li><li> Legen Sie der kombinierten Zellsuspension aus den drei replizieren Brunnen (750 ul Gesamtvolumen) in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen, und drehen Sie es in eine Tischplatte Mikrozentrifuge für 5 min bei 5.000 x g. Die Zellpellets der entspricht in etwa Größe sollte für alle Bedingungen erhalten werden. </li><li> Überstand verwerfen und Zellpellet in 100 ul des 0,04% funktionierende Lösung von Digitonin. Legen Sie die Zellsuspension auf Eis für 10 min. </li><li> Drehen Sie das Digitonin-permeabilisierten Zellen bei 16.000 xg für 10 min in eine Tischplatte Mikrozentrifuge. Übertragen Sie die Cytosol-haltigen Überstandsfraktion eine frische Mikrozentrifugenröhrchen, und behalten die Organellen-Pellet-Fraktion. </li></ol>Titel &quot;&gt; 3. Probenvorbereitung <ol><li> Cytosol-haltige Überstand-Fraktionen werden in HCN-Puffer auf ein Endvolumen von 1 mL verdünnt. Probenvolumina von mindestens 1 mL sind notwendig, um sicherzustellen, Luft aus dem 500 mL-Probenschleife vor der Injektion gespült wird. </li><li> Organellen-Pellet-Fraktionen werden in 1 ml HCN-Puffer mit 1% Triton X-100 resuspendiert. Der Zusatz von Waschmittel ist notwendig, um die Membran-umhüllten Pool Freisetzung von Toxinen. </li><li> Toxin-Standards in Konzentrationen von 100, 10, 1 und 0,1 ng / mL sind in HCN-Puffer hergestellt. </li><li> Parallel setzt der cytosolischen und Organellen-Fraktionen werden für einen Kontroll-Versuch bereit, die Treue der Fraktionierung Verfahren zu bestätigen. Fraktionen erzeugt, wie in Abschnitt 2 beschrieben sind, in 20 ul 4x Probenpuffer (cytosolische Fraktion) oder 120 ul 1x Probenpuffer (Organell-Fraktion) resuspendiert. Äquivalente Volumina der einzelnen Fraktionen werden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgelöst und sondiert by Western-Blot-Analyse zeigen, die Partitionierung einer zytosolischen Protein im Überstand-Fraktion und eine lösliche, wohnhaft ER-Protein in der Pelletfraktion 16-19. </li></ol> 4. SPR Präparat <ol><li> Die Reichert SR7000 SPR Refraktometer ist für SPR-Experimenten verwendet. </li><li> Legen Sie eine vergoldete Glasträger mit einer selbstorganisierten Monoschicht in die SPR Instrument. So aktivieren Sie den Sensor schieben, perfuse einer 1:1 (v: v) Lösung von 0,4 M EDC und 0,1 M NHS über die Rutsche für 10 min bei einer Flussrate von 41 ul / min. Alle nachfolgenden Infusionen wird die gleiche Durchflussmenge. </li><li> Zum Entfernen des EDC: NHS-Aktivierung Puffer, waschen Sie die Platte für 5 min mit PBS mit 0,05% Tween 20 (PBST). Die Platte enthält jetzt reaktiven Amid Anbindehaltung durch Entdeckeln durch die EDC: NHS-Lösung. </li><li> Perfundieren ein Anti-CTA-Antikörper über den aktivierten Sensor gleiten bei einer Verdünnung von 1:20.000 in 20 mM Natriumacetat (pH 5,5) für 15 min. Ein erster Tropfen auf den refraktiven index-Einheit (RIU) wird aufgrund der pH-Änderung zu sehen. Dies wird durch eine Erhöhung der RIU gefolgt werden, da die Antikörper durch die Amid-reaktive Anbindehaltung auf den Sensor schieben erfasst wird. </li><li> Entfernen ungebundener Antikörper aus dem Sensor Folie mit einem 5 Minuten PBST waschen. Die RIU-Signal durch das aufgenommene Antikörper produziert werden Plateau und zu stabilisieren, die Bereitstellung einer neuen Baseline-Signal. </li><li> Perfundieren 1 M Ethanolamin (pH 8,5) über den Sensor schieben für 5 min. Diese Kappen und inaktiviert alle ungebundenen Anbindehaltung auf den Sensor gleiten gelassen. </li></ol> 5. SPR-Analyse von Proben <ol><li> Um eine Baseline Lesen, perfuse PBST über den Antikörper-beschichteten Sensor für 5 min. </li><li> Perfundieren einer experimentellen Probe oder Toxin-Standard über den Sensor für 300 Sekunden. Entfernen Sie die Liganden aus dem Puffer und perfuse PBST über den Sensor für weitere 200 sek. </li><li> Nach jeder Perfusion, gebunden ist Toxin vom Sensor durch eine 100 sec waschen mit PBST bei pH 5,0 entfernt. Damit wird das Signalseine ursprüngliche Grundlinie Lesen, so dass eine weitere Probe auf dem gleichen Sensor verarbeitet werden. </li><li> Vor dem Laden einer neuen Probe, drücken Sie eine kleine Menge Luft durch die Probenschleife, um restliche Flüssigkeit aus dem Stand der Probe zu vertreiben. Unter Verwendung des Verfahrens in 5,2-5,4 dargelegt, haben wir bis zu 12 Proben auf einer Folie laufen ohne wesentlichen Verlust der Baseline-Signal. </li><li> Datenanalyse mit dem Scrubber 2-Software durchgeführt, und die Igor-Software ist für Abbildung der Herstellung verwendet. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Pertussis-Toxin (PT) ist ein AB-Toxin, das von der Zelloberfläche bewegt sich die ER vor der A-Kette (PTS1) tritt das Zytosol 3, 12. Wie in Abbildung 2 dargestellt, könnten unsere SPR-basierter Assay Translokation PTS1 im Cytosol berauscht CHO-Zellen zu erkennen. Es wurde kein Signal aus dem Cytosol von unintoxicated Zellen, die die anti-PTS1 Antikörper nicht mit einer Komponente des Host-Cytosol Kreuzreaktion bestätigt generiert. Diecytosolische Fraktion aus Zellen berauscht in Gegenwart von Brefeldin A (BfA) auch nicht, ein positives Signal zu erzeugen. BfA verhindert Toxin Transport zum ER-Translokation Seite 6-8, 12, 20-25 und damit eine Kette Auslieferung an das Cytosol. Am Ende eines jeden Versuchs, gebunden ist Toxin vom Sensor schieben beraubt. Dies erlaubt mehrere Proben auf einem einzigen Sensor gleiten zu sehen sein und dadurch zur Verfügung gestellt direkten Vergleich zwischen den Ergebnissen mit verschiedenen experimentellen Bedingungen. CT ist ein weiterer AB-Typ, ER-Translokation Toxin 4. In Abbildung 3A, wurde CTA1 in der cytosolischen Fraktion aus CT-behandelte HeLa-Zellen nachgewiesen. Dieser betonte, dass unsere Methodik mit mehreren Zelltypen funktioniert und kann an jeden Toxin, für die eine anti-A-Antikörper zur Verfügung angewendet werden. Es wurde kein Signal erkannt wird, wenn die cytosolische Fraktion von CT-behandelten Zellen über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTB-Antikörper (Abb. 3B) beschichtet perfundiert wurde und bewiesen damit, dass die CTA1Untereinheit, nicht aber die Zell-Bindung CTB Pentamer betritt das Cytosol. 3C zeigt das Signal vom Organell-Fraktion wird off-Skala im Vergleich zu den schwächeren Signal von der cytosolischen Fraktion. Dies stand im Einklang mit den bekannten Ineffizienz der CT Transport zum ER-Translokation Seite 6, 7, die wiederum begrenzt die Menge des Toxins, das Cytosol erreichen können. Darüber hinaus enthält der Organellen Bruchteil CT Holotoxins sowie ER-lokalisierte CTA1, so dass die resultierende SPR-Signal für die Organellen-Fraktion wird durch die zusätzliche Masse des Holotoxins-assoziierten CTB Pentamer aufgeblasen. So ist es nicht sinnvoll, Daten aus der Organellen und cytosolischen Fraktionen auf der gleichen Sensorgramm Grundstück. Unser Test kann überwachen die zeitabhängige Akkumulation von transloziert, zytosolische Toxin (Abb. 4). Die Zellen wurden nach CT bei 4 ° C ausgesetzt, eine Temperatur, die Toxin-Bindung an die Plasmamembran ermöglicht, sondern verhindert, dass die Internalisierung der Zell-assoziierten Toxins. Nach dem removal des ungebundenen Toxin, wurden die Zellen auf 37 ° C erwärmt Beide Toxin Transport zum ER und eine Kette Translokation in das Cytosol kann bei dieser Temperatur auftreten. Kein Toxin wurde im Cytosol 15 Minuten nach dem Erwärmen auf 37 ° C festgestellt Dies spiegelt die Verzögerungszeit für (i) Holotoxins Menschenhandel zum ER erforderlich; (ii) A / B-Untereinheit Dissoziation in der Notaufnahme, und (iii) Eine Kette Export in das Zytosol. Ein kleiner Pool von zytosolischen Toxin wurde nach 30 Minuten bei 37 ° C nachgewiesen, und nach und nach größere Mengen an zytosolische Toxin wurden nach dem 45 und 60 Minuten jagen Abständen erfasst. Selbst ein höheres Maß an zytosolische Toxin wurden nach einer 5-stündigen Verfolgungsjagd Intervall 17 erfasst und bewiesen damit, eine kontinuierliche, langfristige Lieferung von Zell-assoziierten Toxins an die Host-Cytosol. Unser Test kann auch erkennen, die Hemmung des Toxins Translokation in das Cytosol (Abb. 5). Zellen mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), ein chemisches Chaperon, dass die thermische Disord verhindert behandeltEring der isolierten CTA1 Untereinheit (T. Banerjee und K. Teter, unveröffentlichte Beobachtungen) zeigten niedrige cytosolische CTA1 im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen. Entfaltung des Toxin A-Kette eine Voraussetzung für die Translokation in das Cytosol 16-18, so dass die DMSO-induzierte Stabilisierung von CTA1 entsprechend verhindert die Bewegung aus dem ER ins Zytosol. Der Verein Geschwindigkeitskonstante (k a) von SPR Experimenten berechnet ist direkt proportional zur Konzentration des Liganden in der Perfusionspuffer 14, 15, 26. So ist es möglich, die Konzentration der cytosolischen Toxin aus einem Graphen bestimmen, dass Grundstücke der k-Werte für die Toxin-Standards als eine Funktion der Toxin-Konzentration. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die DMSO-induzierte Block des Toxins Translokation in Abbildung 5 dargestellt quantifizieren: die Standardkurve aus bekannten Konzentrationen des Toxins erzeugt wurde verwendet, um eine cytosolische CTA1 konzen berechnenion von 0,3 ng / mL für unbehandelte Zellen und 0,1 ng / mL für DMSO-behandelten Zellen (Abb. 6). Die Hemmung der CTA1 Entfaltung von DMSO so erzeugte eine 3-fache Reduktion der ER-to-Cytosol Translokation von CTA1. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> Abbildung 1. Protocol Überblick. (A) Zellen werden mit dem AB-Toxin bei 4 ° C, eine Temperatur, die Toxin-Bindung an die Zelloberfläche ermöglicht, sondern verhindert Toxin Endozytose. Die A-und B-Untereinheiten des Toxins durch rote und blaue Kreise dargestellt, jeweils. (B) Unbound Toxin wird aus dem Medium entfernt und die Zellen werden auf 37 ° C erwärmt, um Endozytose und retrograden Transport des Holotoxins die ER zu fördern. Holotoxin Dissoziation erfolgt in der Notaufnahme, die den isolierten A-Kette ins Zytosol, indem sie durch ein Protein-leitenden Kanals (s) in der ER-Membran eingeben können. (C) werden die Zellen mit Digitonin behandelt, um selektiv permeabilisieren das PlasmaMembran. (D) ist die Zentrifugation zur Partitionierung der Zellen in verschiedene cytosolische und Organellen Fraktionen verwendet. Das Cytosol ist aus der Zelle durch die Digitonin-generated Poren gepresst und ist in der Überstand entfernt. Die intakte, membrangebundenen Organellen sind in der Pellet-Fraktion gefunden. (E) Um die transloziert Pool von Toxin A-Kette in den Host-Cytosol zu detektieren, wird die überstehende Fraktion über einen SPR-Sensor mit einem Anti-A-Antikörper beschichtet perfundiert. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> Abbildung 2. Erkennung von PTS1 Translokation in den Host-Cytosol. CHO-Zellen wurden Puls-markierten bei 4 ° C für 30 min mit 1 ug / ml PT. Die Zellen wurden dann für 3 Stunden bei 37 ° C verfolgt in Toxin-freiem Medium enthält keine Zusätze (betrunken) oder 5 ug BfA / mL (+ BfA berauscht). Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin wurde Partition Zellextrakten in einzelne Organellen und Cytosol fracti verwendetons. Ein SPR-Sensor mit einer Anti-PTS1 Antikörper beschichtet wurde verwendet, um die cytosolische Pool von PTS1 aus unbehandelten oder BfA-behandelten Zellen zu erkennen. PTS1 Standards wurden über den Sensor als positive Kontrollen perfundiert, während die cytosolische Fraktion von unintoxicated Zellen über den Sensor schieben als negative Kontrolle perfundiert wurde. Am Ende eines jeden Versuchs, mußte Probe vom Sensor schieben beraubt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> Abbildung 3. Erkennung von CTA1 Translokation in den Host-Cytosol. HeLa-Zellen Puls-markierten bei 4 ° C mit 1 ug / ml CT wurden für 2 Stunden bei 37 ° C verfolgt in Toxin-freiem Medium enthält keine Zusätze (betrunken) oder 5 ug BfA / mL (+ BfA berauscht). Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin wurde Partition Zellextrakten in einzelne Organellen und cytosolischen Fraktionen verwendet. (A) Die cytosolische Fraktionen wurden über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTA-Antikörper beschichtet perfundiert. BekanntMengen von CTA wurden als positive Kontrollen verwendet, während das Cytosol von unintoxicated Zellen als negative Kontrolle verwendet wurde. (B) Die cytosolische Fraktion aus Zellen berauscht in der Abwesenheit von BfA wurde über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTB Antikörper beschichtet perfundiert. Ein gereinigter CTB Pentamer wurde über die Folie als eine positive Kontrolle perfundiert. (C) Die Organellen-Fraktion wurde mit solubilisierten 1% Triton X-100 vor Perfusion über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTA-Antikörper beschichtet. Zum Zwecke der Vergleichbarkeit wurden die cytosolische Fraktion (1 ml Endvolumen) aus dem gleichen Zellextrakt und ein CTA-Standard auch über den Sensor durchströmt. Für alle Platten, mußte Probe aus dem Sensor am Ende eines jeden Laufs beraubt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> Abbildung 4. Kinetik der CTA1 Eintrag in das Zytosol. HeLa-Zellen Puls-markierten bei 4 ° C mit 1 ug / ml CT wurden für 15, 30, 45 gejagt, oder 60 min bei 37 ° C in giftfrei mediuMeter Zum Nachweis der Translokation Pool des Toxins wurden zytosolischen Fraktionen aus Digitonin-permeabilisierten Zellen über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTA-Antikörper beschichtet perfundiert. CTA-Standards wurden über den Sensor durchströmt als auch. Am Ende eines jeden Versuchs, mußte Probe vom Sensor schieben beraubt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> Abbildung 5. Hemmung der CTA1 Translokation von DMSO. HeLa-Zellen Puls-markierten bei 4 ° C mit 1 ug / ml CT wurden für 2 Stunden bei 37 ° C verfolgt in Toxin-freiem Medium enthält keine Zusätze (betrunken) oder 10% DMSO (+ DMSO berauscht). Zum Nachweis der Translokation Pool des Toxins wurden zytosolischen Fraktionen aus Digitonin-permeabilisierten Zellen über einen SPR-Sensor mit einer Anti-CTA-Antikörper beschichtet perfundiert. CTA-Standards (100, 10, 1 und 0,1 ng / ml) wurden über den Sensor als positive Kontrollen perfundiert, nur die 1 und 0,1 ng / mL Standards sind für die Skalierung Zwecke gezeigt. Das Cytosol aus unintoxicated-Zellen wurde als negative Kontrolle verwendet. Am Ende eines jeden Versuchs, mußte Probe vom Sensor schieben beraubt. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> Abbildung 6. Berechnung der zytosolischen CTA1. K-Werten für die CTA-Standards aus Abbildung 5 wurden als Funktion des Toxins Konzentration aufgetragen. Die daraus resultierende Standardkurve wurde verwendet, um festzustellen, basierend auf den k-Werten der experimentellen Proben aus Abbildung 5, die Konzentration der zytosolischen CTA1 in unbehandelten und DMSO-behandelten Zellen. Toxin-Standards sind als ausgefüllte Kreise dargestellt; der unbehandelten Cytosol ist als offenes Quadrat dargestellt, und die DMSO-behandelten Cytosol ist als offener Kreis vorgestellt. Die Mittelwerte ± reicht von zwei unabhängigen Experimenten gezeigt.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Vergleich zu bestehenden Methoden Unsere SPR-basierter Assay Translokation stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Methode zur Toxin Lieferung in die Host-Cytosol zu erkennen. Die Technik erfordert keine radioaktiven Markierung oder sonstige Änderungen, um das Toxin, und es kann auf jeden Toxin, für die eine anti-Toxin A-Antikörper zur Verfügung angewendet werden. Bestehende Methoden zur Toxin Passage in das Zytosol Monitor beruhen auch auf eine subzelluläre Fraktionierung Pro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Gangliosid GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Liste </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimid) </td><td> Durchstechen </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> Sigma </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA-Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anti-CTB Antikörper </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Refraktometer </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR-Sensor Dias </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB Toxine bestehen aus einer enzymatischen A-Untereinheit und einer Zell-bindenden B-Untereinheit 1. Diese Toxine sind in das extrazelluläre Milieu ausgeschieden, aber sie wirken auf Ziele innerhalb der eukaryotischen Cytosol. Einige AB Toxine Reise durch Vesikel Träger von der Zelloberfläche zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) vor dem Eintritt in das Zytosol 2-4. In der Notaufnahme, um die katalytische A-Kette distanziert sich von dem Rest des Toxins und bewegt sich durch ein Protein-leitenden Kanals erreichen ihren zytosolischen Ziel 5. Die transloziert, cytosolische Eine Kette ist nur schwer zu erkennen, weil Toxin Menschenhandel, die ER ist ein sehr ineffizienter Prozess: Die meisten verinnerlicht Toxin wird zu den Lysosomen zum Abbau geführt, so dass nur ein kleiner Bruchteil der Oberflächen-gebundenen Toxin gelangt der Golgi-Apparat und ER 6 -12. Zur Überwachung Toxin Translokation aus dem ER ins Zytosol in kultivierten Zellen, kombinierten wir eine subzelluläre Fraktionierung-Protokoll mit den highly empfindliche Nachweismethode der Surface Plasmon Resonance (SPR) 13-15. Die Plasmamembran der Toxin-behandelten Zellen selektiv mit Digitonin permeabilisiert, wodurch Sammlung eines zytosolischen Fraktion, die anschließend über einen SPR-Sensor mit einer Anti-Toxin A-Antikörper beschichtet ist, perfundiert. Die Antikörper-beschichteten Sensor kann erfassen und erkennen pg / mL Mengen von zytosolischen Toxin. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Kinetik der Toxin-Eintrag in das Zytosol zu folgen und hemmende Wirkung auf die Translokation Ereignis zu charakterisieren. Die Konzentration der zytosolischen Toxin kann auch aus einer Standardkurve mit bekannten Mengen von A-Kette Standards, die über den Sensor wurden perfundiert, festgesetzt werden. Unsere Methode stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Nachweis-System, das keine radioaktiven Markierung oder andere Änderungen an der Ziel-Toxin.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

In diesem Bericht beschreiben wir, wie Oberflächen-Plasmon-Resonanz verwendet wird, um Toxin Einreise in den Aufnahmemitgliedstaat Zytosol zu erkennen. Dieser hochempfindliche Methode lassen sich quantitative Daten über die Höhe der zytosolischen Toxin geben, und es kann zu einer Reihe von Toxinen eingesetzt werden.

Nachweis von Toxin Translokation in den Host-Cytosol von Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Aufrufe.  University of Central Florida. In diesem Bericht beschreiben wir, wie Oberflächen-Plasmon-Resonanz verwendet wird, um Toxin Einreise in den Aufnahmemitgliedstaat Zytosol zu erkennen. Dieser hochempfindliche Methode lassen sich quantitative Daten über die Höhe der zytosolischen Toxin geben, und es kann zu einer Reihe von Toxinen eingesetzt werden.

Serie: Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...