Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (K22NS050137 zu JCB) unterstützt.

1. Zellkultur <ol><li> Kortikalen Neuronen isoliert und gezüchtet Verwendung der vorher beschriebenen Techniken und plattiert auf Kulturschalen mit Glasboden (MatTek Corporation, Ashland, MA) mit Poly-D-Lysin und Laminin 1 beschichtet. </li></ol> 2. Vorbereitung der Stammlösungen für die fluoreszierenden Sonden TMRM und H 2 DCF-DA <ol><li> Bereiten Sie eine 10-mM Stammlösung von TMRM durch Auflösen von 5,0 mg TMRM in 1 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid. Vortex es für 1 min. Dann machen Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C, vor Licht schützen, und innerhalb von 1 Monat. </li><li> Als nächstes bereiten ein 10-mM Stammlösung von H 2 DCF-DA durch Auflösen von 4,87 mg H 2 DCF-DA in 1 ml wasserfreiem DMSO. Ebenso Vortex es für 1 min. Dann machen Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C, vor Licht schützen, und innerhalb von einer Woche. </li></ol> 3. Loading Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM und H 2 DCF-DA TMRM ist eine potentiometrische, zellpermeablen fluoreszierenden Indikator dafür, dass in der stark negativ geladenen Inneren der Mitochondrien akkumuliert. Es ist wichtig, die geringen Konzentrationen (10-50 nM-Bereich) von TMRM nutzen, um auto-Abschrecken der mitochondrialen TMRM zu vermeiden. Dann kann das Fluoreszenzsignal TMRM direkt Zusammenarbeit im Zusammenhang mit ΔΨm über die innere Membran der Mitochondrien. Ein Verlust von ΔΨm Ursachen TMRM von Mitochondrien, woraus ein Verlust der Fluoreszenzintensität auslaufen. H 2 DCF-DA ist zellpermeablen Sonde in DCF-DA durch intrazelluläre Esterasen umgewandelt, und die Oxidation führt in fluoreszierenden DCF. Die Endkonzentration von H 2 DCF-DA liegt zwischen 2-10 um und es sollte empirisch in Neuronen aus verschiedenen Hirnregionen abgeleitet getestet werden, da hohe Belastung Konzentrationen in der Sättigung des DCF-Fluoreszenz auch in Abwesenheit von H 2 O 2 entstehen könnten. Das Vorhandensein einer endogenen oder exogenen Oxidationsmittel (z. B. Stickstoffmonoxid, Wasserstoffperoxid) erhöht DFC Fluoreszenzintensität. Nachfolgend stellen wir ein Protokoll für die Be-Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM und H 2 DCF-DA. <ol><li> Zum Laden der Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM zunächst, waschen Sie die kultivierten Neuronen 3-mal mit Tyrode-Puffer (Text-Overlay: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glukose, 1,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES; pH-Wert auf 7,4 mit NaOH). Dann bereiten 20 nM von TMRM durch Verdünnen der 10 mM TMRM Lager 1 / 1000 mal in TB und fügen Sie dann 2 ul verdünnt TMRM pro 1 ml TB. Inkubieren Sie die Neuronen mit TMRM für 45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach 45 min, montieren Sie die Kulturschale auf der Bühne des Mikroskops und starten Bildgebung. </li><li> Zum Laden der Ratte kortikalen Neuronen mit H 2 DCF-DA, waschen Sie die kultivierten Neuronen 3-mal mit TB. Als nächstes bereiten 2 uM von H 2 DCF-DA durch Verdünnen der 10 mM H 2 DCF-DA Lager 1 / 10 mal in TB und fügen Sie dann 2 ul der verdünnten H 2 DCF-DA pro 1 ml TB. Dann inkubieren die Neuronen mit H 2 DCF-DA für 45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach 45 min, waschen Sie die Neuronen 4 mal mit TB, um überschüssige Fluoreszenzindikator vor Gewinnung von Bildern zu entfernen. </li></ol> 4. Live-Darstellung von Neuronen mit TMRM inkubiert, um ΔΨm bestimmen <ol><li> So führen Sie Live-Aufnahmen von Neuronen mit TMRM, konfokale Laser Scanning Mikroskopie (Text-Overlay: LSM 510, Carl Zeiss Inc.) inkubiert, mit der Anwendung von Live-Time-Serie Programm verwendet wird. Bewerben mit niedriger Auflösung und gedämpft Laserleistung (Text-Overlay: niedrige Auflösung: 256 x 256; Laserleistung: 1%), um die benötigte Zeit, um Bilder zu erhalten und zu vermeiden, Bleichen zu minimieren. </li><li> . Als nächstes stellen Sie den Fokus des montierten Neuronen mit TMRM geladen mit reflektiertem Licht. Untersuchen Sie die TMRM Fluoreszenz-Beleuchtung bei 514 nm und Detektion bei 570 nm. Stellen Sie die Erkennung Gewinn von einer Kamera direkt unterhalb der Sättigung. </li><li> Wenn alle Parameter, die Auflösung, Laserleistung, Erkennung Gewinn von einer Kamera, und Zeitraffer-Intervall gehören zu erlangen Bilder gesetzt werden; nicht ändern diese Einstellungen zwischen den Experimenten. Als nächstes ändern Sie das Feld. Starten Sammeln von Bildern. </li><li> Um zu testen, Änderungen in ΔΨm, können Reize wie 1 uM FCCP oder 2 pg / ml Oligomycin, angewandt werden, die deutlich depolarisieren oder hyperpolarisieren des mitochondrialen Membranpotentials, bzw.. Diese Veränderungen werden durch einen Rückgang in TMRM Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Ausgangswert Fluoreszenzintensität bei FCCP, oder eine Erhöhung der TMRM Fluoreszenzintensität bei Oligomycin reflektiert werden. </li></ol> 5. Live-Darstellung von Neuronen mit H 2 DCF-DA inkubiert, um festzustellen, ROS <ol><li> So führen Sie Live-Aufnahmen von Neuronen mit H 2 DCF-DA zunächst inkubiert, montieren Sie die Kulturschale auf der Bühne eines Mikroskops. Stellen Sie den Fokus der Zellen unsIng. reflektierte Licht. Untersuchen DCF-Fluoreszenz durch Anregung bei 488 nm und Emission bei 515 nm. </li><li> Als nächstes stellen Sie die Laserleistung auf 5-7%, Detektor zu gewinnen, und die Auflösung von 256 x 256. Ändern Sie diese Einstellungen zwischen den Experimenten. Dann legen Sie die Frequenz für den Erhalt von Live-Bildern mit der Zeitreihen-Programm. </li><li> Wählen Sie ein neues Feld und beginnen Erfassen von Bildern. Um Veränderungen in ROS Ebenen zu behandeln Zellen mit 100-200 um H 2 O 2. Dies wird durch einen Anstieg der DCF-Fluoreszenz-Intensität im Vergleich zum Ausgangswert Ebene reflektiert werden. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Verwenden region of interest (Text-Overlay: ROI)-Tool aus dem LSM-Programm, um die Bereiche auszuwählen. Dann messen Sie die TMRM oder ROS Fluoreszenzintensitäten. Wählen Sie ROIs von mitochondrialen Regionen oder ROIs aus dem gesamten Zellkörper in abgebildet Zellen, die Fluoreszenz-Intensitäten der TMRM oder ROS bzw. zu messen. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz-Intensitäten von allen ROIs jeder Zelle für TMRM oder aus ganzen Zellkörper für alle abzubildenden Zellen für ROS für jeden Zeitpunkt. Wählen Sie Regionen neben den Zellen, die Hintergrund-Fluoreszenz-Intensität zu berechnen. Nehmen Sie mehrere Messungen und Berechnung der durchschnittlichen Hintergrund Intensität. </li><li> Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenzintensität von durchschnittlich Fluoreszenzintensitäten ROIs in jeder Zelle für jeden Zeitpunkt mit Microsoft Excel. Nach Abzug Hintergrund Intensität, normalisieren die TMRM oder DCF-Fluoreszenz-Intensität auf die Grundlinie Fluoreszenz mit dieser Formel (Text-Overlay: AF = FF o / F o x 100, wobei F = Fluoreszenz-Intensität zu jedem Zeitpunkt, Fo = baseline Fluoreszenz). Verwenden Sie dann die Sigma Plot Programm, um die grafische Darstellung der Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität im Laufe der Zeit zu generieren. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1A zeigt ein Fluoreszenz-Bild der Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM inkubiert. Die Zugabe von FCCP, eines mitochondrialen Entkoppler, führt zu mitochondrialen Depolarisation und einen Verlust von TMRM Fluoreszenzintensität (Abb. 1B). Die Baseline TMRM Fluoreszenz Ebene bleibt vor der Zugabe von FCCP (die ersten 350 sec.; Abb. 1C) stabil. Quantitative Analyse der TMRM Fluoreszenz ändert sich im Laufe der Zeit zeigt eine signifikante Abnahme in TMRM Fluoreszenz nach Zugabe von FCCP (Abb. 1C). 1D zeigt die Fluoreszenz-Bild der Ratte kortikalen Neuronen mit DCF geladen. Die Zugabe von H 2 O 2 führt zu einer erhöhten DCF Fluoreszenz-Intensität in Zellkörper (Abb. 1E). Die Baseline-DCF-Fluoreszenz-Ebene bleibt unverändert (die ersten 120 sec) vor dem Auftragen von H 2 O 2. Zeitraffer-Messungen der DCF-Fluoreszenz zeigen seine stetige Ebenen, die Zunahme nach H 2 O 2-Behandlung (Abb. 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Einschätzung der mitochondrialen Membranpotentials und ROS Ebenen in lebenden Ratte kortikalen Neuronen. (A) Repräsentative Fluoreszenzbild der kortikalen Neuronen mit TMRM geladen. Nach dem Scannen der Grundlinie TMRM Fluoreszenz wurden Neuronen mit dem protonophore FCCP (1 uM) behandelt. Auf der rechten Seite ist eine Falschfarbendarstellung Intensität bar TMRM Fluoreszenz mit leuchtend gelben und schwarzen vertreten maximalen und minimalen Intensität, jeweils. Der Verlust von TMRM Fluoreszenz von der mitochondrialen Regionen zeigt den Zusammenbruch des ΔΨm auf FCCP Behandlung (Panel B). Die quantitative Darstellung der Veränderung in TMRM Fluoreszenzintensität zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach FCCP Behandlung ist in Panel C (D) Fluoreszenzbild Ratte kortikalen Neuronen mit H2DCF-DA geladen angezeigt. Nach der Bestimmung der Baseline-DCF-Fluoreszenz wurden die Zellen mit 200 uM H 2 O 2 behandelt, und die Veränderung der DCF-Fluoreszenz wurde beurteilt. Eine Erhöhung des DCF-Fluoreszenz spiegelt der Anstieg der ROS Ebenen auf H 2 O 2-Behandlung (E). Quantitative Analyse des Wandels in DCF-Fluoreszenz vor und nach der H 2 O 2-Behandlung ist in Panel F. Skala bar = 10 pm gezeigt Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi Live Cell Imaging von TMRM in kortikalen Neuronen vor und nach FCCP zusätzlich mit 40X-Objektiv. Die Falschfarben-Intensität zeigt ein Maximum (leuchtend gelb, bevor FCCP Addition) und zurück (rote Farbe, nach FCCP Addition) TMRM Fluoreszenzintensität nach FCCP hinaus. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">Klicken Sie hier, um Video anzusehen</a> Video. 7,5 - labmedia 2704_Joshi.avi Live Cell Imaging von DCF in kortikalen Neuronen vor und nach der H 2 O 2-Zugabe mit 40X-Objektiv. Die Baseline-DCF-Fluoreszenz hat hellgrüne Farbe in Zellkörper und H2O2 Zusätzlich erhöht sich die DCF Fluoreszenzintensität auf leuchtend grüne Farbe. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">Klicken Sie hier, um Video anzusehen</a>

<ol>
	<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures.">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+(AICD)+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics.">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li><li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species:+implication+for+cell+death.">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li></ol>

Wir haben eine Schritt-für-Schritt-Verfahren beschreiben, wie ΔΨm und ROS in Ratte kortikalen Neuronen mit dem fluoreszierenden Indikatoren TMRM und H 2 DCF-DA, bzw. festzustellen, vorgestellt. Für andere Zelltypen, ist es wichtig, empirisch bestimmt die endgültige Konzentration und Ladezeit für TMRM oder H 2 DCF-DA. Im Allgemeinen TMRM Konzentrationen liegen im Bereich von 20 bis 200 nM, und die Zelle Inkubationszeit mit TMRM variiert von 20 bis 60 min. Die Endkonzentration von H 2 DCF-DA reicht von 2-10 um, und die Inkubation von Zellen in einem Laden-Lösung mit diesem Indikator variiert von 30 bis 45 min. Es ist wichtig, die Laserleistung und Scan-Geschwindigkeit von unter die Bilder, um sowohl photo-Toxizität für die Zellen und Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (z. B. Flackern TMRM Fluoreszenz) in Ermangelung einer Stimulus zu vermeiden optimieren. Das optimierte optische Einstellungen sollten in einem Fluoreszenz-Signal, das nicht über oder unter gesättigten (Schwelle) in Abwesenheit des Stimulus führen. Die optimalen Bedingungen, um die Bilder aus einem ausgewählten Feld an einer bestimmten Laserleistung und eine Scan-Geschwindigkeit sammeln werden erzielt, wenn es keine Änderungen in der Fluoreszenz-Intensität der Sonde in das Fehlen jeglicher Anreiz für 10-15 min von Live-Bildgebung. Andere Fluoreszenz-Sonden an ΔΨm bestimmen, sind Rhodamin 123 und Tetra methyl Rhodamin Ethylester (TMRE). Allerdings waren sie zu finden, um die Atemwege Prozesse in isolierten Mitochondrien 2 hemmen. Wichtig ist, dass TMRM keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung bei niedrigen Konzentrationen 2 und hat einen geringen Phototoxizität und Ausbleichen 3 im Vergleich mit anderen Sonden. H 2 DCF-DA ist ein guter Indikator für ROS, wie sie ist gut in den Zellen erhalten und erkennt verschiedene Oxidantien, wie Peroxide, Superoxide und Salpetersäure Oxid 4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Glasboden Kulturschale </td><td> MatTek Inc. </td><td> P35G-1,5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons

Mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktion der Atmungskette zur ATP zu generieren. Ein signifikanter Verlust von ΔΨm macht Zellen von Energie mit anschließender Tod erschöpft. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind wichtige Signalmoleküle, aber ihre Häufung in pathologischen Zuständen führt zu oxidativem Stress. Die beiden wichtigsten Quellen von ROS in der Zelle sind Umweltgifte und den Prozess der oxidativen Phosphorylierung. Mitochondriale Dysfunktion und oxidativer Stress in der Pathophysiologie vieler Krankheiten in Verbindung gebracht, daher die Fähigkeit, ΔΨm und ROS bestimmen kann wichtige Hinweise über die physiologischen Zustand der Zelle und die Funktion der Mitochondrien liefern. Mehrere Fluoreszenzsonden (Rhodamin 123, TMRM, TMRE, JC-1) kann verwendet werden, um Δψm in einer Vielzahl von Zelltypen zu bestimmen, und viele Fluoreszenz-Indikatoren (Dihydroethidium, Dihydrorhodamin 123, H 2 DCF-DA) kann verwendet werden, um ROS bestimmen . Fast alle der verfügbaren Fluoreszenz-Sonden verwendet werden, um ΔΨm oder ROS beurteilen einzigen Wellenlänge Indikatoren, die erhöhen oder verringern ihre Fluoreszenzintensität proportional auf einen Stimulus, erhöht oder verringert die Höhe der ΔΨm oder ROS. So ist es unerlässlich, die Fluoreszenz-Intensität dieser Sonden an der Grundlinie auf und nach der Anwendung eines spezifischen Reiz zu messen. Dies erlaubt es, den Prozentsatz der Änderung in der Fluoreszenzintensität zwischen der Grundlinie Ebene und einen Stimulus zu bestimmen. Diese Änderung in der Fluoreszenz-Intensität spiegelt die Veränderung der relativen Werte von ΔΨm oder ROS. In diesem Video zeigen wir, wie die Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in Ratte kortikalen Neuronen beziehen sich auf die prozentuale Veränderung in TMRM Fluoreszenzintensität zwischen der Grundlinie auf und nach der Anwendung FCCP, eines mitochondrialen Entkoppler zu bestimmen. Die unteren Ebenen der TMRM Fluoreszenz aus FCCP Behandlung spiegeln die Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials. Wir zeigen auch, wie die Fluoreszenz-Sonde H 2 DCF-DA beziehen sich auf die Ebene von ROS in kortikalen Neuronen, zuerst an der Basislinie zu beurteilen und dann nach der Anwendung von H 2 O 2. Dieses Protokoll (mit kleinen Änderungen) kann auch verwendet werden, um Änderungen in ΔΨm und ROS in verschiedenen Zelltypen und in Neuronen von anderen Hirnregionen isoliert zu bestimmen.

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Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Wir demonstrieren die Anwendung der Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in kortikalen Neuronen, die relativen Veränderungen in TMRM Fluoreszenzintensität vor und nach der Anwendung eines bestimmten Stimulus zu bestimmen. Wir zeigen auch die Anwendung der Fluoreszenz-Sonde H<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA auf die relative Höhe der reaktiven Sauerstoffspezies in kortikalen Neuronen zu beurteilen.

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

64.7K Aufrufe.  Loyola University Chicago. Wir demonstrieren die Anwendung der Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in kortikalen Neuronen, die relativen Veränderungen in TMRM Fluoreszenzintensität vor und nach der Anwendung eines bestimmten Stimulus zu bestimmen. Wir zeigen auch die Anwendung der Fluoreszenz-Sonde H 2 DCF-DA auf die relative Höhe der reaktiven Sauerstoffspezies in kortikalen Neuronen zu beurteilen.

Serie: Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Forschung

Neurowissenschaften

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

Stimulusspezifische cortical Visual Evokierte potenzielle morphologische Muster

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

Bestimmung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in Ex-vivo-Netzhautgewebeproben

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...