저자 오징어 시설 지원이 원고에 대한 의견, 마이클 Hadfield 현장 수령시 도움 Kewalo 해양 연구소,이 프로토콜에 기여를위한 루비와 McFall-Ngai 실험실의 구성원에 대한 Gyllborg Mattias 감사드립니다. Mandel 연구소의 작품은 NSF IOS-0843633에 의해 지원됩니다.

1. 세균성 Inocula의 작성 <ol><li> 데이 0 오징어 접종, 접시 LBS에 관련된 박테리아 변종 13 한천 이전 이틀. </li><li> 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 박테리아를 품어. </li><li> 1 일 각 V. 중 하나를 식민지로 유리 문화 튜브의 중간 세 ML LBS의 예방 감염 fischeri 변형. 백업으로 튜브를 복제 준비합니다. </li><li> 날 2 (오징어 단계 3.7-3.10와 세균 단계 1.4-1.6 조정) 이전 접종 1 H, subculture 박테리아 유리 문화 튜브 3 ML의 LBS에 1:80 (37.5 μl)와 폭기 : 1 개 H 위해 성장. </li><li> 접종 이전 시료의 OD 600을 측정합니다. 일반적인 측정은 0.3-0.6 변형에 따라 있습니다. </li><li> Inoculum 볼륨 (μl) = 1.25 / OD 60 : 3-5 X의 대상 inoculum 내용 10 3 CFU / ML은 다음과 같이 inoculum 볼륨을 계산0 (예 : OD 600 = 0.5, 계산 inoculum 볼륨 = 1.25/0.5 = 2.5 μl).이 금액은 단계 4.1 오징어를 포함하는 바닷물에 직접 추가됩니다. 이 계산 V.의 여러 변종에 따라 조정해야 할 수도 있습니다 fischeri 또는 여기에 지정된 것보다 낮은 또는 높은 수준의 접종입니다. </li></ol> 2. Inocula의 열거를위한 한천 플레이트의 작성 <ol><li> 각 치료 단계 4.1 inoculum의 플레이트 샘플에 대한 레이블 LBS 플레이트 (대우 당 2). </li><li> 판 당 5 멸균 도금 구슬을 추가합니다. </li></ol> 3. 오징어 점이 모음집 <ol><li> 굴절계를 사용하여 인스턴트 바다의 염분을 측정하는 35 ‰로 조정합니다. </li><li> 필터 - 살균 인스턴트 오션 (FSIO)를 생성하는데, 여과 장치와 연결된 진공 라인 또는 진공 펌프를 사용하여 인스턴트 오션 1 패을 필터링합니다. 각 분배에 적극적으로 사전에 소용돌이에 의해 산소를 물. 일전자 필터 유닛은 2 일 동안 활용할 수 있습니다. </li><li> 두 (2) 일회용 샘플 그릇의 각으로 나누어지는 FSIO의 40-50 ML합니다. 라벨 earlies 같은 하나 timelies 같은 하나. </li><li> 피펫에게 가장 낮은 산등성이 위에 팁을에서 약 1 센티미터, (그림 3 참조) 절단하여 청소년 오징어 취득을위한 플라스틱 전송 pipettes의 초과를 준비합니다. 이것은 오징어 수령시 합격 할수있는 넓은 공간을 용이하게합니다. 거친 노출된 표면이있는 모든 전송 pipettes 폐기하십시오. </li><li> 준비된 전송 pipettes 사용하여 E. 수집 하룻밤 사이에 부화하고 FSIO의 earlies 그릇에 전송되는 scolopes. 조기 hatchlings 1 이상 H 위해 계란 시스템에 왔고 오염에 의해 식민지로 감염될 수 있습니다했습니다 V. 계란 시스템의 fischeri. 민감한 식민지 실험을 위해 earlies를 사용하지 마십시오. </li><li> 계란 탱크에게 새로운 hatchlings 때마다 30-45 분를 확인하십시오. 모든 hatchlings는 각 사용자 동안 해제되는 것을 보장도대체. FSIO의 timelies 그릇으로 전송 피펫, 그리고 예금과 hatchlings를 제거합니다. 적시에 수집 동물 식민지 실험에 사용할 수 있습니다. </li><li> 수집이 완료되면 (~ 45 분 황혼 이후), 주요 연구실로 오징어를 전송합니다. 경험적으로 그것은 3 시에 예방 접종에 대한 중단 실험실 조명 조건 하에서 동물을 식민지에 유리합니다. </li><li> 각각의 치료, 40 ML FSIO와 그릇을 준비합니다. (최대 N = 40 그릇 당) 분석을위한 그릇에 오징어를 추가합니다. </li><li> aposymbiotic (부정적) 제어로 추가 그릇을 준비합니다. </li><li> 각 치료 전용 전송 피펫을 준비합니다. </li><li> 2 %의 에탄올에 추가 오징어를 안락사. </li></ol> 4. 오징어 콜로니 <ol><li> 주 2 - P10 Pipetman를 사용하여, 각 치료를 위해 각 오징어 덮밥 (3.8 단계)로 박테리아의 계산 나누어지는 (단계 1.5) 분배. 즉시 3 시에 타이머를 시작합니다첫 번째 접종. </li><li> 각 치료의 경우 그릇의 가장자리 근처에 피펫을 넣어 약 10 초 동안 물 오징어를 섞어 반복하고 아래까지 pipetting하여 전용 전송 피펫과 그릇 &quot;소용돌이&quot;를 만듭니다. 혼합 철저한가 중요합니다. </li><li> 2.2 단계에서 LBS 한천 플레이트를 향해 각 그릇의 플레이트 50 μl가 (기술에 대한 치료 당 번호판이 50 μl 번호판을 복제합니다.) 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 알을 품다. </li><li> 각 치료 세차 그릇 (100 ML FSIO / EA)를 준비합니다. </li><li> 각 오징어에 대한 Drosophila 튜브를 (4 ML ​​FSIO / EA) 준비합니다. </li><li> 정확히 3 시에 후, 각각의 세차 그릇 (모든 치료 완료)로 오징어를 전송합니다. 이것은 접종 중지됩니다. </li><li> FSIO와 자체 Drosophila의 유리병에 각각 오징어를 전송 진행합니다. 각 치료 지정 전송 피펫을 사용합니다. </li><li> 일 / N로 돌아가려면 오징어 시설에 Drosophila 유리병의 쟁반으로 이동항공 라이트 사이클 동물 embryogenesis 동안 경험했다. </li><li> 3 일 - 각 오징어를 준비 Drosophila 튜브 (4 ML ​​FSIO / EA). </li><li> 22-24 H 포스트 - 접종시 황혼에 앞서, 새로운 Drosophila의 병을 각 오징어를 전송합니다. 각 치료 지정 전송 피펫을 사용합니다. </li><li> 일 4 - 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (1/squid)를 분류 준비합니다. </li><li> 이전 46-48 H 포스트 접종, 측정의 황혼과 Drosophila의 유리병 (6의 통합 및 뚜껑 폐쇄에 자동으로 읽기위한 luminometer 세트)의 각 오징어의 발광을 기록합니다. </li><li> 배경 발광에 대한 부정적인 통제 마찬가지로 모든 오징어를 포함하지 않는 FSIO있는 유리병을 측정합니다. </li><li> 단계 4.12에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 대략 700 μl의 볼륨의 각 오징어를 전송합니다. 판지 냉동실 상자로 이동합니다. 뚜껑이있는 상자에 배치되면, 아, 아닌 박테리아의 퇴학에 대한 가벼운 단서로 제거하지 마십시오L-이해. </li><li> -80 ° C에서 하룻밤 사이에 microcentrifuge 튜브를 고정. </li></ol> 5. 콜로니 레벨의 결정 <ol><li> 각 오징어 들어, 475 μl FSIO (또는 70% 인스턴트 오션을 autoclaved)로 두 (2) microcentrifuge 튜브, 각각 준비합니다. </li><li> 먼저 유봉을 청소하고 총 부스러기 및 / 또는 조직을 제거하는 Kimwipe를 사용하여 pestles을 준비합니다. </li><li> 장소는 95 % 에탄올을 포함하는 50 ML의 비커에 팁 다운 pestles. 에탄올은 약 3cm의 높이에 추가되어 있어야합니다. </li><li> 각 유봉 들어, 비커에서 제거하고 Kimwipe와 팁을 닦아냅니다. </li><li> 에탄올 욕조로 다시 유봉 수영 제거하고 삽입 (최대 팁) microcentrifuge 튜브 랙에 약 15 분 동안 완전히 건조한을 발표하실 수 있습니다. </li><li> microcentrifuge 튜브 랙에 해동의 오징어 (최대 N = 8). </li><li> 필요한 경우, 700 μl로 볼륨을 조정합니다. </li><li> 단계 5.5에서 유봉을 사용하여 잉크 SAC RUP 때까지 동물의 조직을 혼란tures (물이 어두운 회색 색상을 설정합니다.) </li><li> 유봉을 제거하고 모든 조직은 튜브에 남아 보장합니다. </li><li> 정확히 10 초 (타이머를 사용)의 소용돌이 조직 간단히합니다. </li><li> 조직이 10 분 동안 휴식을 허용합니다. 조직이 정착되고 박테리아와 잉크 용액에 남아 있습니다. 따라 계산은 박테리아 / 잉크 솔루션은 [] 희석 (즉, 700 μl의 E. scolopes 조명 장기 homogenate)입니다. 시리얼 1시 20분의 dilutions ([B] [C]) 아래에 설명되어 있습니다. </li><li> [B] 희석 들어, 단계 5.1에서 준비 microcentrifuge 튜브 중 25 μl []를 추가합니다. 와동. </li><li> [C] 희석의 경우, 25 μl를 추가 [B] 단계 5.1에서 준비 microcentrifuge 튜브 중 하나. 와동. </li><li> LBS 한천 배지를 향해 각 희석의 플레이트 50 μl, 2는 치료에 따라 복제합니다. </li><li> 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 번호판을 품어. </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> CFU / 조명 기관 (LO), coun을 계산하려면각 치료 접시 t 식민지가되는 10-400 식민지가 존재하고, 적절한 수식을 사용 : CFU / LO = ([] 접시 식민지) × 14, 또는 CFU / LO = ([B] 접시 식민지) × 280, 또는 CFU / LO = ([C] 접시 식민지) × 5,600. </li><li> 대수 규모의 개별 데이터 포인트와 medians 잡아. </li><li> 데이터는 종종 일반적으로 다른 차이와 함께 배포되지 않은, 그리고 outliers는 의미 생물 학적 정보를 포함할 수 있습니다. 따라서 비 파라메 트릭 테스트는 치료가 크게 차이가 있는지 여부를 결정하는 유용한 방법을 제공합니다. </li><li> 통계 분석을 위해 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용합니다. 이 치료법은 윌콕슨이 순위 합 테스트를 사용합니다. 보다보다 두 요법 간의 비교 들어, 적절한 사후 검사와 Kruskal-월리스 테스트를 사용합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 샘플 식민지 분석의 결과는 그림 4에 표시됩니다. 두 변종 <em&gt; V. 발광 여러 상대적인 수준을 전시 fischeri는 aposymbiotic (uncolonized) 컨트롤을 역임 여섯 오징어와 함께, 여섯 오징어로 주사 각각 있었다. E. scolopes symbiont, ES114 14, 그리고 밝은 Sepiola robusta symbiont, SR5 15,16. 비슷한 inoculum 수준 (그림 4A)는 3 시에 이내에 100 %의 식민지로 이어집니다. 48 H에서 발광 수준 (그림 4B)와 CFU 카운트는 (그림 4C) 변형의 식민지 능력을 평가하기 위해 결정됩니다. 특정 발광 (그림 4D, 당 세균)의 결정이 공생하는 동안 각 세균 변형의 밝기의 결정을 허용합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig1.jpg" /> 식민지 절차의 그림 1. 플로우 차트. 박테리아와 오징어가 지정한 inoculum에서 혼합 후, 별도로 수확한다. 오징어는 씻어되고 나서 3 시에, 24 H, 4에서 새로운 물로 전송<html> 8 H 포스트 접종. 48 H에서 발광 측정되고 동물 얼었어,이 동물을 표면 소독을 제공합니다. 라이트 - 장기 박테리아가 -80에서 가능한 남아있는 식민지 ° C을 한쪽 해동 (별도의 냉동 해동 사이클)를 통해. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig2.jpg" /> 균질화 및 박테리아의 희석 도금을 보여주는 그림 2. 플로우 차트. 직렬 20 배 dilutions 식민지가 박테리아의 열거에 적절한 다이나믹 레인지를 제공합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig3.jpg" /> 그림 3. 청소년 오징어를 손상시킬 수있는 좁은 구멍 ()에 적절하게 좁은 샤프트 테이퍼와 pipettes을 전송합니다. 가위 또는 면도날과 좁은 부분을 없애 버리려하고 전처리가 (B) 청소년 오징어를 전송하는 적절한 도구를 얻을. s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. 식민지 분석을위한 샘플 데이터입니다. inoculum 그릇에있는 박테리아의 (A) 수준. 개별 오징어의 (B) 발광. (C) 각 오징어의 식민지 카운트. 개별 오징어의 (D) 특정 발광. APO, Aposymbiotic (부정적인 제어를 uncolonized).

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저자가 공개하는 게 없다.

설명 식민지 분석은 통제된 실험실 환경에서 자연 공생 프로세스의 분석을 위해 수 있습니다. 따라서, 그것은 서로 다른 자연의 분리에 의한 돌연변이 종자에 의해 서로 다른 화학 정권 아래에서 식민지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 설명된 실험에서 유사 일반적 공생의 다양한 측면을 평가하는 데 사용됩니다. 식민지의 속도론은 우연 탐지기가 제거된있는 신틸레이션 계수기에서 자동으?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 유리 문화 튜브, 16 밀리미터 직경 </td><td> VWR </td><td> 47729-580 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 문화 튜브를위한 모자 </td><td> 어부 </td><td> NC9807998 </td><td></td></tr><tr><td> OD 600 결정에 대한 표시 분광 </td><td> Biowave </td><td> CO8000 </td><td> OD 600을 측정할 수있는 분광 광도계가 작동합니다. 이 기기는 유리 배양 튜브에 직접 액체가 OD 600을 측정할 수 있습니다. inoculum 계산의 일부 조정이 사용되는 장비에 따라 필요할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> GloMax 20분의 20 단일 튜브 Luminometer </td><td> Promega </td><td> E5311 </td><td> 터너 BioSystems 20/20n Luminometer에 상응. microcentrifuge 튜브 홀더가 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> GloMax 20분의 20 라이트 스탠다드 </td><td> Promega </td><td> E5341 </td><td> luminometer 교정하십시오. </td></tr><tr><td> 굴절계, 핸드헬드 </td><td> 포스터와 스미스 수상 </td><td> CD-14035 </td><td> 탈이온수 각각 사용하기 전에 보정. 소금을 빌드 - 업 방지하기 위해 탈이온수있는 모든 사용 후 린스. </td></tr><tr><td> 인스턴트 오션 (인공 해수 농축) </td><td> 포스터 &amp; 스미스 수상 </td><td> CD-16881 </td><td> 0.2 μm의 SFCA 필터를 통해 다음 필터, 굴절계를 이용하여 탈이온수 35 ‰에서 준비합니다. </td></tr><tr><td> 여과 장치 </td><td> Nalgene </td><td> 158-0020 </td><td> 계면 활성제가없는 셀룰로스 아세테이트 (SFCA) 멤브레인 0.2 μm의. 우리는 몇 가지 계면 활성제 함유 PES 필터와 가변 결과를 관찰했습니다. </td></tr><tr><td> 전송 Pipettes </td><td> 어부 </td><td> 13-711 -오전 9시 </td><td> 가위 또는 면도날을 사용하여 깔끔하게 피펫 팁의 직경을 증가시키고 오징어 hatchlings 손을 쓰고 피하기 위해 첫 번째 능선 위의 팁을 했네요. </td></tr><tr><td> 일회용 샘플 그릇 (플라스틱 tumblers) </td><td> 혜성 </td><td> T9S (9온스) </td><td> 상부 직경 3 접종을위한 그릇, ¼ &quot;더 낮은 직경이 ¼&quot;, 높이 3 &quot;. 그들이 오징어는 낮은 산소의 틈새에 갇혀받을 수있는 더 아래쪽 가장자리를, 없다로 갔었는 동질적인 환경을 만듭니다. 크기가 최적화됩니다 40-ML inoculum. webstaurantstore.com에서 가능 # 619PI9. </td></tr><tr><td> Drosophila 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89092-720 </td><td> 유리병 직경은 luminometer의 PMT에 오프닝과 일치합니다. </td></tr><tr><td> 1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브 </td><td> ISC Bioexpress </td><td> C-3217-1CS </td><td> 튜브 pestles의 모양에 맞게해야합니다. </td></tr><tr><td> 에탄올, 200 입증 </td><td> 어부 </td><td> BP2818-100 </td><td></td></tr><tr><td> Pestles </td><td> 킴블의 체이스 / Kontes </td><td> 749521-1500 </td><td></td></tr><tr><td> 도금 비즈, 5 밀리미터 직경 </td><td> 킴블의 체이스 </td><td> 13,500 오 </td><td> 튜브 및 압력솥 당 5 준비합니다. </td></tr></tbody></table>

colonization of euprymna scolopes squid by vibrio fischeri

특정 박테리아는 동물 조직을 1-5으로 협회에서 발견된다. 이러한 호스트 세균성 협회는 (symbioses) (병원성) 해로운가 될 수없고 피트니스 결과 (공생)가없는, 또는 (mutualistic) 유익합니다. 많은 관심은 병원성 상호 작용 부여되어 있지만, 거의가 환경에서 공생 / 유익한 박테리아의 재현성 인수를 지시하는 프로세스에 대해 알려져 있습니다. 해양 그람 음성 세균 사이의 가벼운 장기 mutualism V. fischeri와 하와이 꼬리 자른 오징어, E. scolopes는 하나의 호스트 (E. scolopes)는 자사의 일생 6,7의 과정 전반에 걸쳐 하나의 세균 종 (V. fischeri)와 공생 관계를 수립하는 매우 구체적인 상호 작용을 나타냅니다. V. 제작한 Bioluminescence 이 상호 작용하는 동안 fischeri는 엑스타시의 안티 육식 혜택을 제공합니다 야행성 활동 8,9 중 scolopes 반면영양이 풍부한 호스트 조직을 제공 V. 보호 틈새 10과 fischeri. 각 호스트 생성하는 동안,이 관계는 따라서 공생 발전의 다양한 단계에서 세부 평가 수있는 예측 가능한 프로세스를 대표 recapitulated있다. 첫 번째 30~60분 내에 수집 symbiont없는 물로 전송하는 경우 실험실에서 청소년 오징어 해치 aposymbiotically (uncolonized), 그리고는, 실험 inoculum 6에 의한 경우를 제외하고 식민지하실 수 없습니다. 이 상호 작용함으로써 환경 11,12의 공생 미생물의 특정 취득으로 이어질 개별 단계를 평가하는하는 유용한 모델 시스템을 제공합니다. 여기 새로 aposymbiotic E.을 꾸몄다고 때 발생하는 식민지의 정도를 평가하는 방법을 설명 scolopes는 (인공)이 포함된 해수에 노출되는 V. fischeri 있습니다.이 간단한 분석은 접종, 자연 감염 및 복구에 대해 설명E.의 초기 조명 장기에서 세균성 symbiont의 scolopes. 케어는 특히 수질과 라이트 단서와 관련하여, 공생 개발하는 동안 동물을위한 일관된 환경을 제공하기 위해 가져옵니다. 설명 공생 인구를 특성화하기위한 방법은 bacterially-파생 bioluminescence (1) 측정 및 회복 symbionts의 계산 (2) 직접 식민지를 포함합니다.

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Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

방법에 의한 하와이의 꼬리 자른 오징어 절차를 간략하게 설명<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt;와 세균성 symbiont,<em&gt; 장염 fischeri</em&gt;, 박테리아에 의한 오징어 표시등 기관의 특정 식민지 수 있도록 도입 별도로하고 사육하고 있습니다. bacterially-파생된 발광에 의한 직접적인 식민지의 계산에 의한 식민지 감지 기능이 설명되어 있습니다.

의 식민지 Euprymna scolopes 오징어에 의한 장염 fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

19.8K 조회수.  Northwestern University. 방법에 의한 하와이의 꼬리 자른 오징어 절차를 간략하게 설명 Euprymna scolopes와 세균성 symbiont, 장염 fischeri, 박테리아에 의한 오징어 표시등 기관의 특정 식민지 수 있도록 도입 별도로하고 사육하고 있습니다. bacterially-파생된 발광에 의한 직접적인 식민지의 계산에 의한 식민지 감지 기능이 설명되어 있습니다.

비디오: Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

하여 세균없는 마우스 프로 그레시브 콜로니 동안 간장 신진 대사 변경 사항 평가 1 H NMR 분광학

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

TransFLP &amp;#x2014; A Method to Genetically Modify &lt;em&gt;Vibrio cholerae&lt;/em&gt; Based on Natural Transformation and FLP-recombination

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법<em&gt; 장염 cholerae</em&gt; 자연 변화와 FLP-재조합에 근거

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

의 검출을위한 더 민감하고 특정 원체 한천 배지의 개발<em&gt; 장염 비브리오 균</em&gt; 및 기타<em&gt; 비브리오</em&gt; 종

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

그룹 B의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술<em&gt; 콜레라 비브리오</em&gt; 임상 적 및 환경 적 분리 물

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...