Unser Protokoll hilft bei der Beantwortung der Fragen, wie körperliche Bewegung die Homöostase des Organismus unterstützt. Die Systeme ermöglichten es uns, direkte mechanische Effekte auf das Gehirn aus komplexen Konsequenzen körperlicher Aktivitäten wie Gehen und Joggen zu sezieren. Befestigen Sie zunächst den Beschleunigungsmesser mit chirurgischem Klebeband auf dem Kopf einer Ratte.
Nach vollständiger Erholung von der Anästhesie legen Sie die Ratte in die Laufbandmaschine. Stellen Sie das Laufband auf eine moderate Geschwindigkeit von 20 Metern pro Minute ein. Verwenden Sie die Anwendungssoftware, um die Größe der vertikalen Beschleunigungen entlang der X-, Y- und Z-Achse zu messen, wenn die Ratte das Laufband betreibt.
Passen Sie die von der Software erhaltenen Werte an die Frequenz der vertikalen Beschleunigung im PHM-System an. Stellen Sie die Amplitude der Schwingung der Plattform und die Rotationsgeschwindigkeit der propellerförmigen Nocke ein. Stellen Sie dann die Maus in Bauchlage, wobei sich der Kopf auf dem Oszillatable und der Rest des Körpers auf den statischen Plattformen befindet.
Schalten Sie den Motor ein, um die Plattform vertikal zu oszillieren, und wenden Sie PHM auf die Maus an. Stellen Sie im transparenten Kunststoffgehäuse die Videokamera mit einer Bildrate von 24 FPS auf, um den gesamten Raum aufzunehmen. Als nächstes intraperitoneal fünf Hydroxytryptophan an eine Maus verabreichen.
Setzen Sie die Maus in den transparenten Käfig und starten Sie die Aufnahme für 30 Minuten. Überprüfen Sie das aufgenommene Video mit 0,5-facher Geschwindigkeit und zählen Sie das Kopfzucken manuell. Rufen Sie die Kryosektionen des Mausgehirns aus der Folienbox ab.
Lassen Sie die Objektträger auf sauberen Tüchern bei Raumtemperatur, bis die Proben vollständig dehydriert sind. Verwenden Sie einen Flüssigkeitsblockerstift, um einen Kreis um das kryogeschnittene Gewebe zu zeichnen. Fügen Sie dann die TBS-T-Lösung hinzu.
Legen Sie angefeuchtete Tücher auf den Boden eines Tabletts, um eine feuchte Umgebung für die Objektträger zu schaffen. Nach einer Permeablisation mit TBS-T 4% Eselserum zur Blockierung hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie die Objektträger einmal durch Eintauchen in TBS-T für fünf Minuten.
Tragen Sie dann 100 Mikroliter entsprechend verdünnten primären Antikörper und Dappy Mix auf jeden Objektträger auf. Das Tablett abdecken und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation dreimal für jeweils fünf Minuten mit TBS-T abspülen.
Tragen Sie 100 Mikroliter entsprechend verdünnte Spezies auf fluoreszierende sekundäre Antikörper auf und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nachspülen mit TBS-T dreimal für jeweils fünf Minuten, montieren Sie die Dias mit Montagemedium und decken Sie die Dias mit Abdeckgläsern ab. Nach der Montage betrachten Sie die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Das PHM-System wurde so eingestellt, dass vertikale Beschleunigungsspitzen bei etwa 1,0 mal G erzeugt wurden, was denen der Rattenköpfe während des Laufbandlaufs entsprach. Die PHM-Anwendung bei Mäusen dämpfte signifikant ihre Kopfzuckenreaktion im Vergleich zu den Kontrollmäusen, die eine unterdrückende Wirkung von PHM auf die 5-HT2A-Rezeptorsignalisierung in den präfrontalen Kortexneuronen darstellen. Das Laufband in PHM verbesserte signifikant die Internalisierung des 5-HT2A-Rezeptors und die präfrontalen Kortexneuronen der Maus.
Die Quantifizierung von internalisierten und membranassoziierten 5-HT2A-Rezeptor-positiven Bereichen relativ zum neuen und positiven Bereich bestätigte diese Beobachtung. Die Immunfärbung und Quantifizierung der c-Fos-Expression in 5-HT2A-Rezeptor-positiven Neuronen zeigte, dass das Laufband, das in PHM lief, die 5-HTP-induzierte c-Fos-Expression herunterregulierte. Dies ist das nachgeschaltete zelluläre Ereignis der 5-HT2A-Rezeptoraktivierung und der PFC-Neuronen der Maus.
Mechanische Eingriffe können auf andere Körperteile als den Kopf angewendet werden, um die mechanischen Aspekte der Trainingseffekte zu untersuchen.
