Wir danken T. Hung, MC. Tsai, O. Manor, E. Segal, M. Kuroda, T. Swigut, und I. Shestopalov für Diskussionen. Unterstützt von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung von Singapur (CC), NIH R01-R01-und CA118750 HG004361 (HYC) und California Institute for Regenerative Medicine (HYC). HYC ist ein Early Career Wissenschaftler des Howard Hughes Medical Institute.

1. OEM Anwendungen Design Anti-sense DNA Fliesen Sonden für die selektive Abrufen von Ziel-RNA von Chirp. <ol><li> Design-Antisense-Oligo Probes mit dem Online-Sonde Designer bei <a href="http://singlemoleculefish.com">singlemoleculefish.com</a> 18. </li><li> Verwenden Sie diese Parameter: Anzahl der Sonden = 1 Sonde / 100 bp Länge von RNA; 2) Ziel GC% = 45, 3) Oligonukleotid-Länge = 20; 4) Abstand Länge = 60-80. Brechen RNA in Segmente, wenn zu lange für den Konstrukteur. Lassen Sie Regionen von Wiederholungen oder weitgehende Homologie. </li><li> Auftrag Antisense-DNA-Sonden mit BiotinTEG am 3&#39;-Ende Ende. </li><li> Markierungs-Sonden entsprechend ihrer Position entlang der RNA. Trennen Sie sie in zwei Pools, so dass die &quot;geraden&quot; Pool enthält alle Sonden Nummerierung 2, 4, 6, usw. und die &quot;ungeraden&quot; Pool enthält Sonden Nummerierung 1, 3, 5, usw. verdünnen Pool von Sonden bis 100 uM Konzentration und Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Alle Experimente sind mit handelsüblicherBeide Pools, die als interne Kontrollen für einander zu dienen. Echte RNA-abhängige Signal vorhanden wäre von beiden Pools, während Sonden-spezifischen Geräusche wäre einzigartig für jeden Pool. Dies gilt sowohl für CHIRP qPCR-und Chirp-seq. </li></ol> 2. Ernten Sie die Zellen Sammeln Zellen, die für die Chirp-Experiment verwendet werden. <ol><li> Kultivieren von Zellen in Gewebekulturplatten oder Kolben bis zur Konfluenz. Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) einmal und trypsinieren. Quench mit Trypsin&gt; 2x Volumen von Medien, Pipette auf und ab, um Zellen zu verdrängen und resuspendieren in einzelne Zell-Suspension. Übertragen Sie alle Medien und resuspendierten Zellen in 50 ml Falcon-Röhrchen. 20 Millionen Zellen sind in der Regel ausreichend für ein CHIRP Probe. </li><li> Spin-Zellen bei 800RCF für 4 min. Aspirieren Medien und resuspendieren 40 Millionen Zellen in 40 ml PBS, Rohre verbinden, wenn nötig. Spin-Zellen bei 800RCF für 4 min. Dekantieren PBS, sorgfältig auf einem Winkel die verbleibende Flüssigkeit abzusaugen. </li></ol&gt; 3. Cross-Link-Cells und Sammeln Zellpellet Crosslink gesammelten Zellen mit Glutaraldehyd zu RNA-Chromatin-Wechselwirkungen zu erhalten und bereiten Zellpellet. <ol><li> Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie 1% Glutaraldehyd in PBS Raumtemperatur. Bereiten Sie 10 ml pro 10 Millionen Zellen (0,4 ml 25% Glutaraldehyd Lager + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyd muss frisch verwendet werden. </li><li> Tippen Sie unten auf Falcon-Röhrchen, um Pellets zu entfernen. Resuspendieren Zellpellet in 1% Glutaraldehyd, beginnend mit einem kleinen Volumen zu Klumpen zu vermeiden, dann von oben bis zur vollen Lautstärke. Umkehren, um zu mischen. Crosslink für 10min bei Raumtemperatur auf einer End-to-End-Schüttler oder Rotator. </li><li> Quench die Vernetzungsreaktion mit 1:10 Volumen von 1,25 M Glycin bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Drehen am 2000RCF für 5 min. Absaugen des Überstandes und Waschen Pellet mit 20 ml PBS gekühlt einmal drehende 2000RCF für 5 min. </li><li> Aspirieren und resuspendieren Sie das wveraschten, vernetzten Pellet mit 1 ml gekühltem PBS pro 20 Millionen Zellen. Übertragen Sie jede ml in ein Eppendorf-Röhrchen und drehen sich mit 2000RCF für 3 min bei 4 C. Entfernen Sie so viel wie möglich mit PBS Pipettenspitze vorsichtig. </li><li> Flash-frieren der Zellpellets in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit. </li></ol> 4. Cell Lysis Lyse vernetzten Zellen zu Zelllysat vorzubereiten. <ol><li> Eingefrorene Zellpellets bei Raumtemperatur. Tippen schwer zu lösen und das Zellpellet zu mischen. Drehen Sie das Pellet bei 2000RCF für 3 min bei 4 ° C Mit einem scharfen 10 pl Pipettenspitze, um alle verbleibenden PBS zu entfernen. </li><li> Auf einer elektronischen Waage (Genauigkeit 1 mg) Tara die Masse eines leeren Eppendorf-Röhrchen (unsere Rohre wiegen 1,060 Gramm sehr konsequent). Wiegen Sie jedes Pellet und notieren ihr Gewicht. Eine volle 15 cm Schale aus vernetztem HeLa-Zellen in der Regel wiegt 100 mg. </li><li> Supplement Lysis Buffer (10x die Masse der Pellets, z. B. 1 ml für 100 mg) mit fresh Protease-Inhibitor, PMSF und Superase-in (siehe beigefügte Liste Puffer). Gut mischen. </li><li> Fügen 10X Volumen ergänzt Lysispuffer in jedes Röhrchen und das Pellet. Für kleine Pellets &lt;25 mg, in 250 ul ergänzt Lysepuffer resuspendieren. Die Aussetzung sollte glatt sein. Falls nicht, teilen Suspension in 500 ul Aliquots und verwenden Sie einen motorisierten Pellet-Mixer zu brechen Klumpen. Fahren Sie direkt mit Beschallung. </li></ol> 5. Ultraschallbehandlung Shear DNA durch Beschallung vernetzten Zelllysaten. <ol><li> Beschallen Zelllysat in Bioruptor in 15 ml Falcon-Röhrchen. Mit &lt;1,5 ml Lysat in jedem Röhrchen und für eine schnellere Beschallung, beschallen nicht mehr als zwei Rohre zu einer Zeit. </li><li> Mit Ultraschall in einem 4 ° C Wasserbad bei höchster Stufe mit 30 Sekunden ein, 45 Sekunden AUS Pulspausen. Überprüfen Sie Lysat alle 30 min. Weiter Ultraschallbehandlung, bis das Zell-Lysat nicht mehr trübe ist. Dies kann so wenig wie 30 Minuten und nicht weniger als 4 Stunden. Die Anzahlvon Rohren, wird das Probenvolumen, die Badtemperatur und die Dauer der Beschallung Zeit beeinflussen, wie lange der Prozess dauert. Tubes wird wahrscheinlich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten beschallen, so bündeln sie zusammen alle 30 Minuten und weiterzuverbreiten in Original-Röhren, um die Homogenität zu gewährleisten. Hinweis: Glutaraldehyd-vernetzten Zellen nehmen deutlich länger als Formaldehyd-Äquivalente beschallen. </li><li> Wenn Lysat klar macht, übertragen Sie 5 ul Lysat in ein frisches Eppendorf-Röhrchen. In 90 ul DNA-Protease K (PK) Buffer (siehe Liste Puffer) und 5 ul PK. Vortex zu mischen und kurz abzentrifugieren. Inkubieren für 45 min bei 50 ° C </li><li> Extraktion von DNA mit Qiagen PCR Purification Kit. Eluieren DNA in 30 ul Qiagen Elutionspuffer (EB) und überprüfen DNA-Größe auf 1% Agarosegel. Wenn Großteil der DNA-Abstrich ist 100-500 bp, Beschallung ist abgeschlossen. Wenn nicht, weiter beschallen. </li><li> Zentrifuge beschallten Proben 16100RCF für 10 min bei 4 ° C Kombinieren Sie Überstände, Aliquot in 1 ml Proben-und Flash-Freeze in flüssiger Gasdrucn. Lagerung bei -80 ° C. </li></ol> 6. CHIRP Hybridisieren biotinylierten DNA-Sonden an die RNA zu isolieren und gebundenen Chromatin. <ol><li> Auftauen Rohre Chromatin bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Hybridisierungspuffer (siehe Liste Puffer, für das 2 ml pro ml Chromatin). Vortex mischen. </li><li> Für eine typische CHIRP Probe mit 1 ml Lysat, entfernen Sie 10 ul für die RNA-INPUT und 10 ul für DNA-Input und-ort in Eppendorf-Röhrchen. Halten auf Eis bis zur weiteren Verwendung. </li><li> 1 ml Chromatin zu 15 ml Falcon Röhrchen. 2 ml Hybridisierungspuffer in jedes Röhrchen. Für Gesamtvolumen &lt;1,5 ml, Eppendorf-Röhrchen verwenden. </li><li> Auftauen Sonden bei Raumtemperatur. Nanodrop Sonden an Menge nach, wenn Sie es nicht in eine lange Zeit verwendet haben (100 uM Sonden sollten spec ~ 500-600 ng / ul mit Einzelstrang-DNA-Einstellung). Fügen Sie entsprechende Volumen von Sonden auf bestimmte Rohre (100 pmol Sonde pro 1 ml Chromatin, 1 ul 100 pmol / ul Sonde pro 1 ml Chromatin).Gut mischen. Bei 37 ° C für 4 Stunden unter Schütteln. </li><li> Mit 20 min übrigen für die Hybridisierung, bereiten Sie die C-1 magnetische Kügelchen (gelagert bei 4 ° C). Verwenden Sie 100 ul pro 100 pmol von Sonden. Waschen mit 1 ml Lysispuffer unsupplementierten dreimal mit dem Dynamag-2 Magnetstreifen zu trennen Perlen aus dem Puffer. </li><li> Resuspendieren Sie Perlen in ursprünglichen Volumens Lysispuffer; Ergänzung mit frischen PMSF, PI und Superase-in. Nach 4 Stunden Hybridisierungsreaktion abgeschlossen ist, werden 100 ul Kügelchen in jedes Röhrchen. Gut mischen. Bei 37 ° C für 30 Minuten unter Schütteln. </li><li> Bereiten Waschpuffer (5 ml pro Probe). Vortex mischen. Pre-warm bis 37 ° C. In PMSF vor der Verwendung. </li><li> Waschen Kügelchen mit 1 ml Waschpuffer fünfmal. Auf dem ersten Waschgang, verwenden Dynamag-15 Magnetstreifen zu trennen Perlen, dekantieren und Resuspension in 1 ml Waschpuffer. Übertragen Volumen auf 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Bei 37 ° C unter Schütteln für 5 min. </li><li> Bei nachfolgenden Wäschen, Spin-down jedes Röhrchen auf einem Minizentrifuge, Setzen Sie auf Probe Dynamag-2 Magnetstreifen für 1 min. Dekantieren, reinigen Sie Tropfen mit einem Kimwipe, in 1 ml Waschpuffer resuspendieren. Bei 37 ° C unter Schütteln für 5 min. Wiederholen Sie dies für insgesamt fünf Wäschen. </li><li> Endlich waschen, resuspendieren Perlen gut. Nehmen Sie 100 ul und beiseite stellen für RNA-Isolierung. Reserve für 900 ul DNA-Fraktion. Legen Sie alle Rohre auf Dynamag-2 Magnetstreifen und Waschpuffer zu entfernen. Drehen Sie alle Röhrchen nach unten kurz, legen Sie sie auf Magnetstreifen. Entfernen Sie das letzte Stück der Waschpuffer vollständig mit einem scharfen 10 pl Pipettenspitze. </li></ol> 7. RNA-Isolierung Auszug RNA-Fraktion von Chirp Proben mittels qRT-PCR zu quantifizieren. <ol><li> Nehmen Sie 100 ul Wulst Proben und 10 ul RNA INPUT Probe. In 85 ul RNA-PK-Puffer pH 7,0 zu Input-RNA. Resuspendieren Sie Perlen in 95 ul RNA-PK-Puffer pH 7,0. Geben Sie 5 ul Proteinease K und inkubieren bei 50 ° C für 45 min mit Ende-zu-Ende zittern. </li><li> Kurz Spin-Down alle Rohre undkochen Proben für 10 min auf Heizblock bei 95 ° C </li><li> Entspannen Proben auf Eis, 500 ul TRIzol zugeben und kräftig vortexen für 10 sek. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. Bei -80 ° C oder fahren Sie mit Schritt 4 fort. </li><li> Geben Sie 100 ul Chloroform zu TRIzol behandelten Proben. Vortex kräftig für 10 sek. Drehen am 16100RCF auf einer Tischzentrifuge für 15 min bei 4 ° C </li><li> Nehmen Sie ~ 400 ul wässrige Überstand, die Vermeidung organischer und Schnittstelle. </li><li> Fügen Sie 600 ul (1,5 Volumen) 100% Ethanol und gut mischen. Spin Probe durch MIRNeasy Mini-Säulen. 1x waschen mit RWT (MIRNeasy Mini Kit), 2x mit RPE pro Protokoll des Herstellers. Man eluiert mit 30 ul Nuklease-freiem H 2 O (NFH 2 O). </li><li> Behandeln Sie die RNA-Eluats mit DNA-frei pro Protokoll des Herstellers. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, erwärmen die Probe für 15 Minuten bei 65 ° C zur vollständigen Inaktivierung jegliches verbleibende DNase. </li><li> Verwenden Sie 1 ul RNA isolieren pro Vertiefung für qRT-PCR-Analyse zu bestätigen lncRNARetrieval. GAPDH wird oft als negative Kontrolle verwendet. </li></ol> 8. DNA-Isolierung Auszug DNA-Fraktion von Chirp Proben durch Sequenzierung identifizieren oder zu quantifizieren, indem qPCR. <ol><li> Bereiten DNA Elutionspuffer (siehe Liste Puffer), 150 ul pro Probe, einschließlich DNA-INPUT. </li><li> Fügen Sie 1 0μL RNase A (10 mg / mL) und 10 ul RNase H (10 U / ul) pro ml DNA Elution Buffer und Wirbel zu mischen. </li><li> Resuspendieren jede Probe von Kügelchen in 150 ul DNA-Elutionspuffer mit RNasen. (INPUT resuspendieren DNA in 140 ul) bei 37 ° C für 30 min unter Schütteln inkubieren. </li><li> Separate Perlen und Überstand auf Dynamag-2 Magnetstreifen. Überstand entfernen und hinzufügen, um beschrifteten Röhrchen. </li><li> Bereiten Sie ein zweites Aliquot der DNA-Elutionspuffer mit 10 ul RNase A (10 mg / mL) und RNaseH (10 U / ul) genau wie in 8.2 getan). Fügen Sie 150 ul zu jeder Probe (einschließlich DNA-Input), inkubieren, Überstand entfernen. Sammeln Sie alle Überstand (Schulterd sein ~ 300 ul). </li><li> In 15 ul PK zu jeder Probe. Inkubieren bei 50 ° C für 45 Minuten unter Schütteln. </li><li> Pre-Spin-down-Gelb-Phase-Lock-Gel-Tuben (5PRIME). Transfer-DNA-Proben zu Phase-Lock-Gel-Tuben, und 300 ul PhOH: Chloroform: Isoamylalkohol pro Probe. Gebrauch kräftig schütteln, 10 min, und der Spin-Down auf einer Tischzentrifuge bei 16100RCF für 5 min bei 4 ° C Nehmen wässrigen von der Spitze (~ 300 ul). Add 3 ul GlycoBlue, 30 ul NaOAc und 900 ul 100% EtOH. Gut mischen und bei -20 ° C über Nacht. </li><li> Spin Proben 16100RCF für 30 min bei 4 ° C </li><li> Überstand vorsichtig dekantieren. 1 ml 70% EtOH und Wirbel zu mischen. Drehen am 16100RCF für 5 min. Überstand entfernen mittels einer Pipette. Luft für 1min trocknen. Resuspendieren in 30 ul EB. </li><li> DNA-Proben sind bereit für die Analyse von qPCR oder die Zubereitung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheken pro Illumina-Protokoll. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse 1 </strong&gt; zeigt die CHIRP Workflow. Eine erfolgreiche CHIRP Experiment typischerweise bereichert Ziel-RNA signifikant gegenüber nicht-spezifische RNAs. 2 zeigt Anreicherung von humanen Telomerase-RNA (TERC) aus HeLa-Zellen über GAPDH, ein reichlich zelluläre RNA, die als negative Kontrolle dient. Mehrheit der TERC RNAs (~ 88%) in der Zelle vorhanden, wurden von der Durchführung CHIRP gezogen, während nur 0,46% der GAPDH-RNA wurde abgerufen, was zeigt, einem Anreicherungsfaktor von ~ 200 fache. Unspezifische Sonden wie Sonden Targeting LacZ-RNA, die nicht in Säugetierzellen (2) ausgedrückt wird, können als zusätzliche negative Kontrollen verwendet werden. DNA-Regionen zu erwarten, um das Ziel zu binden lncRNA werden typischerweise über negativen Bereichen, wenn sie durch qPCR gemessen angereichert. 3 zeigt qPCR Validierung von vier HOTAIR-gebundenen Plattformen primäre humane Vorhautfibroblasten, dass wir durch Ausführen CHIRP-seq in der gleichen Zelllinie bestimmt, während TERC und GAPDH DNA Seiten an sichrve als negative Kontrolle Regionen. Sowohl &quot;gerade&quot; und &quot;ungerade&quot;-Sonde setzt erbrachten vergleichbare Anreicherung erwartet HOTAIR-gebundenen Seiten über Regionen negativ, ein Kennzeichen der wahren lncRNA-Bindungsstellen. Hochdurchsatz-Sequenzierung von Chirp angereicherte DNA ergibt sich eine globale Karte der lncRNA-Bindungsstellen. Die Drosophila lncRNA roX2 ist bekannt, mit dem X-Chromosom in einer Weise, die für die Dosierung Kompensation erforderlich ist interagieren. 4 zeigt roX2 Bindungsprofil über einen Abschnitt des X-Chromosoms. Sowohl &quot;gerade&quot; und &quot;ungerade&quot; Proben wurden sequenziert und ihre einzigartige Geräusche wurden eliminiert, um eine Spur von sich überlappenden Signale zu erzeugen. Jede &quot;Spitze&quot; hier zeigt eine starke Seite von roX2 bindend. Die komplette Liste der Spur und roX2 Zielgene in Chu et al. 2011 17. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufschema des Chirp-VerfahDure. Chromatin ist lncRNA vernetzt: Proteinaddukte in vivo biotinylierten Sonden hybridisiert Fliesen zu lncRNA zielen, und Chromatin-Komplexe werden unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen, gefolgt von strengen Wäschen.. Wir eluieren lncRNA gebundene DNA oder Proteinen mit einem Cocktail von RNase A und H. Eine mutmaßliche lncRNA Bindungssequenz orange schematisiert wird. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig2.jpg" /> Abbildung 2. CHIRP bereichert für den menschlichen TERC RNA. TERC-asDNA Sonden abrufen ~ 88% der zellulären RNA TERC und GAPDH nicht nachweisbar. LacZ-asDNA Sonden werden als negative Kontrollen verwendet und Abrufen weder RNAs. Mittel + SD dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig3.jpg" /> Abbildung 3. HOTAIR CHIRP-qPCR in primären humanen fürEskin Fibroblasten. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 und ABCA2 sind Bereiche, die mit HOTAIR interagieren. TERC und GAPDH diente als negative Kontrollen. Mittel + SD dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17 <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3912/3912fig4.jpg" /> Abbildung 4. CHIRP-seq Daten von roX2 RNA in Sl2 Drosophila-Zellen. &quot;Selbst&quot; und &quot;ungerade&quot; wurden getrennt sequenziert; ihre Daten zusammenführen, um gemeinsam nur Spitzen in beide reflektieren. Das fusionierte Bahn dargestellt. Zuvor in Chu et al. 2011. 17

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C. Chu Chang und HY sind als Erfinder auf einer Patentanmeldung auf dieser Methode benannt.

Hier beschrieben CHIRP-seq, ein Verfahren zur Zuordnung in vivo lncRNA Bindungsstellen genomweiten. Die wesentlichen Parameter für Erfolg sind die Split-Pools von Fliesen Oligonukleotid-Sonden und Glutaraldehyd-Vernetzung. Das Design der Sonden-Affinität ist einfach angesichts der RNA-Sequenz und erfordert keine Vorkenntnisse in der RNA-Struktur oder funktionellen Domänen. Unser Erfolg mit roX2, TERC und HOTAIR - drei ziemlich unterschiedlichen RNAs in zwei Arten - legt nahe, dass CHIRP-seq wahrscheinlich verallgemeinerbar zu viele lncRNAs ist. Wie bei allen Experimenten werden Pflege und angemessene Kontrollen erforderlich, um die Ergebnisse zu interpretieren. Verschiedene lncRNA kann Titration von Bedingungen, und vernünftige Änderung der Bedingungen, wie zB Auswahl von verschiedenen Affinitätssonden oder Vernetzer erfordern, kann auf unterschiedliche Aspekte der RNA-Chromatin-Wechselwirkungen. Wie Chip-seq sind nicht alle Bindungsereignisse unbedingt funktional, und weitere Studien sind erforderlich, um die biologischen Folgen der RNA-o ermittelnccupancy auf Chromatin. Dennoch sehen wir viele interessante Anwendungen dieser Technologie für Forscher anderer Chromatin-assoziierten lncRNAs, die jetzt in die Tausende 8,9. So wie ChIP-seq hat die Tür für genomweite Untersuchungen der DNA-Protein-Interaktionen eröffnet, kann CHIRP-seq Studien des &quot;RNA Interaktom&quot; enthüllen viele neue Wege der Biologie.

Buffer List:
Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20&deg;C.
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
10 mM EDTA 
1% SDS 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer (for DNA)
100 mM NaCl 
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0) 
1 mM EDTA 
0.5% SDS 
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use
Hybridization Buffer
750 mM NaCl 
1% SDS 
50 mM Tris-Cl pH 7.0 
1 mM EDTA 
15% formamide (store in the dark at 4&deg;C) 
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use
Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) 
0.5% SDS 
Always add PMSF fresh before use
DNA elution Buffer
50 mM NaHCO3 
1% SDS
Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882-10x10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized pellet mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>V8185-904</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superase-in</td>
			<td>Ambion</td>
			<td><a href="http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?AM2696">AM2696</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>UCD-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (for sonication)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7626-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-01D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase H</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>R0601K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4875-100MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel Heavy</td>
			<td>5 PRIME</td>
			<td>2302810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:Isoamyl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Ricca</td>
			<td>RSOC0020-1C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4057-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10010-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (EB)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-027</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15515-026</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin isolation by rna purification (chirp)

Lange-kodierende RNAs sind wichtige Regulatoren der Chromatin Staaten für wichtige biologische Prozesse wie Dosiskompensation, Imprinting und Entwicklungsstörungen Genexpression 1,2,3,4,5,6,7. Die jüngste Entdeckung von Tausenden von lncRNAs in Verbindung mit spezifischen Modifikation Chromatin-Komplexe wie Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) vermittelt, dass Histon H3 Lysin 27 Trimethylierung (H3K27me3), breite Rollen für zahlreiche lncRNAs bei der Verwaltung von Chromatin-Staaten in einer Gen-spezifischen schlägt Mode 8,9. Während einige lncRNAs gedacht werden, um in cis auf benachbarte Gene arbeiten, arbeiten andere lncRNAs in trans zu weit entfernten Gene regulieren. Zum Beispiel sind Drosophila lncRNAs roX1 und roX2 bind zahlreichen Regionen auf dem X-Chromosom der männlichen Zellen, und entscheidend für Dosiskompensation 10,11. Allerdings sind die genauen Standorte von ihren Bindungsstellen nicht mit hoher Auflösung bekannt. In ähnlicher Weise können menschliche lncRNA HOTAIR PRC2 Belegung auf h beeinflussenundreds von Genen genomweiten 3,12,13, aber wie Spezifität erreicht wird, ist unklar. LncRNAs kann auch als Modulgerüsten dienen dazu, die Montage von mehreren Protein-Komplexe zu rekrutieren. Die klassische trans-agierende RNA-Gerüst ist die TERC RNA, die als Vorlage und Gerüst für die Telomerase-Komplex 14 dient; HOTAIR kann auch als Gerüst für PRC2 und einem H3K4 Demethylase Komplex 13 zu dienen. Frühere Studien Mapping RNA-Belegung am Chromatin haben gezeigt, wesentliche Einblicke 15,16, aber nur an einem einzigen Gen-Locus zu einer Zeit. Die Belegung der meisten Websites lncRNAs sind nicht bekannt, und die Rollen von lncRNAs in Chromatin Regulation wurden zumeist aus den indirekten Auswirkungen der lncRNA Störung abgeleitet. So wie Chromatin-Immunopräzipitation von Microarray-oder tief-Sequenzierung (ChIP-Chip oder Chip-seq bezeichnet) verfolgt hat, unser Verständnis von Protein-DNA-Wechselwirkungen im genomischen Maßstab verbessert, hier haben wir veranschaulichen eine recenTLY veröffentlichten Strategie zu lange RNA-Belegung genomweiten bei hoher Auflösung 17 Karte. Chromatin-Komplex, der durch Antisense-Oligonukleotide Tiling, der dann eine Karte der genomischen Bindestellen bei einer Auflösung von mehreren hundert Basen mit: Diese Methode, Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp) (Abbildung 1), basiert auf Affinität Erfassung von Soll-lncRNA Basis hoher Empfindlichkeit und geringem Hintergrund. Chirp ist auf viele lncRNAs, weil das Design der Affinitäts-Sonden ist einfach aufgrund der RNA-Sequenz und erfordert keine Kenntnis der RNA-Struktur oder funktionelle Domänen.

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Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chirp ist eine neuartige und schnelle Technik, um genomische Bindungsstellen der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) abzubilden. Die Methode nutzt die Spezifität der anti-sense-Oligonukleotide Fliesen um die Auszählung von lncRNA-gebundene genomische Stellen zu ermöglichen.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

chromatin-isolation-by-rna-purification-chirp

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

85.7K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine. Chirp ist eine neuartige und schnelle Technik, um genomische Bindungsstellen der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) abzubilden. Die Methode nutzt die Spezifität der anti-sense-Oligonukleotide Fliesen um die Auszählung von lncRNA-gebundene genomische Stellen zu ermöglichen.

Serie: Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...