<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die dreidimensionale Struktur des Cystatin-B-Komplex (blau) mit Papain (gelb). Mutierte Cystatin B Rückstände werden in rot dargestellt. 1. Principles of Label-free Interaction Analysis mit Biacore Systeme In einem typischen label-freien Bindungsstellen Experiment mit einem Biacore System mit der Bezeichnung ein Biomolekül die &quot;Liganden&quot; an die Oberfläche eines Sensorchips verbunden ist. Ein System von Flow-Kanäle bringt seinen Bindungspartner, so genannten &quot;Analyt&quot;, in Kontakt mit der Chip-Oberfläche, wo Detektion erfolgt. Wenn der Analyt an den Liganden bindet, ist die daraus resultierende Veränderung in akkumulieren Masse an der Oberfläche von Surface Plasmon Resonance (SPR) nachgewiesen. Die SPR Reaktion ist proportional zur Menge der bindenden Analyten. Da die Bindung in Echtzeit gemessen wird, kann die kinetische Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für eine spezifische Wechselwirkung bestimmt werden. Von dieser Konstanten ist es möglich, die Affinität als die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante zu berechnen. Es ist auch möglich, Affinität von steady state verbindliche Daten zu berechnen. Eine ähnliche Methode kann auch verwendet werden, um die Konzentration eines Proteins, das spezifisch an einen Liganden auf der Oberfläche zu bestimmen. 2. Analysieren kinetischen Eigenschaften eines Protein-Protein-Interaktion In Biacore X100 kann kinetische Analyse unter Verwendung von Single-Cycle-Kinetik werden. In einem Single-Cycle-Kinetik-Experiment wird eine Konzentrationsreihe des Analyten in einer einzigen Analyse-Zyklus ohne Regeneration der Oberfläche in zwischen den Injektionen injiziert. Daher ermöglicht Single-Cycle-Kinetik kinetische Analyse, wenn es schwierig ist, geeignete Regeneration Bedingungen zu finden. Sobald die Daten für eine kinetische Experiment gesammelt worden ist, erzeugt Biacore X100 Auswertesoftware die Werte von k a, k d und K D durch Anpassung der Daten an ein Interaktionsmodell. 3. Ansätze zur Bestimmung von Protein-Konzentration Die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen ist für das Verständnis ihrer Funktion wichtig. Charakterisierung der Bindung von Proteinen an andere Proteine, Nukleinsäure-oder kleinen Molekülen ist von grundlegender Bedeutung für die biochemische Forschung, und findet Verwendung in vielen anderen Bereichen, einschließlich der Wirkstoffforschung. Für eine genaue Messung der Wechselwirkung Kinetik zwischen zwei interagierenden Proteinen ist es wichtig, die Konzentration der spezifisch bindenden Proteins in der experimentellen Probe, die als Analyt verwendet wird wissen. Ein Spektralphotometer Lesen der A 280 oder kolorimetrischen Assays wie der Einsatz von Bradford-Reagenz wird häufig verwendet, um Gesamt-Protein-Konzentration bestimmen. Allerdings kann Proteinverunreinigungen das Ergebnis beeinflussen. Noch wichtiger ist, sind sowohl aktive als auch inaktive Formen des Proteins in der Gesamt-Protein-Konzentration enthalten. Besonders im Fall von rekombinanten Proteinen, die inaktiv sein können durch falsche Faltung, ist es wichtig, den Anteil der spezifisch bindenden Proteins in der Probe zu bestimmen. In Biacore X100, kann die Konzentration in Bezug auf spezifische Bindungsaktivität entweder durch Vergleich der verbindliche Antwort Ebenen auf eine Eichkurve von einem bekannten Standard, oder indem Sie die in jüngerer Zeit eingeführt Methodik Calibration-Free Konzentration Analysis (EUFA) abgeleitet bestimmt werden. EUFA nicht auf einen Standard zu setzen. Daher ist EUFA besonders nützlich im Falle eines Studiums mutierte Formen von Proteinen, in denen Normen sind in der Regel nicht zur Verfügung. In einem EUFA Experiment wird die anfängliche Bindung Rate bei verschiedenen Flussraten unter Bedingungen gemessen, wenn Diffusion der Probe auf der Chip-Oberfläche geschwindigkeitsbestimmend ist. Der Diffusionskoeffizient des Analyten sind die Abmessungen der Messzelle und die Strömungsgeschwindigkeiten berücksichtigt bei der Berechnung der spezifischen Bindung Konzentration von der anfänglichen Bindung Rate 1,2. In einer Kinetik-Experiment wird die Konzentration des Analyten in die Berechnung der kinetischen Verein konstant gehalten und die Affinität aus den experimentellen Daten verwendet. EUFA und kinetische Messungen in Biacore-Systemen sowohl auf die gleiche Wechselwirkung Eigenschaften zurückgreifen. Daher ist die Verwendung der spezifischen Bindung Konzentration von Biacore-Analyse bestimmt, anstatt Gesamt-Protein-Konzentration, erhöht die Zuverlässigkeit der Ergebnisse. 4. Mit Biacore Analyse der Interaktion zwischen Cystatin B und Papain Charakterisieren Mammalian Cystatin B ist eine reversible, wettbewerbsfähige und tight-binding Protein Inhibitor der Papain-ähnlichen Cystein-Proteinasen, vor allem Cathepsin B, H, K, L und S. Diese Proteine ​​sind vor allem in nons beteiligtelektiven intrazellulären Proteinabbau. Cystatine sind davon ausgegangen, dass Zellen und Gewebe vor unangemessenen Proteolyse durch diese Enzyme zu schützen. Sie haben auch inaktivieren Cysteinproteinasen von Parasiten und Viren und können in der Verteidigung gegen eine Invasion von solchen Infektionserregern zu beteiligen. Darüber hinaus hemmen Cystatine mehrere Anlagen Cysteinproteinasen, wie Papain, die häufig als ein Modell-Enzym in Struktur-Funktions-Studien verwendet wird. Die dreidimensionale Struktur des Cystatin-B-Komplex mit Papain 3 zeigt, dass die Interaktion zwischen den beiden Proteinen durch hydrophobe Kontakte, die aus dem Inhibitor Seite, von der N-und C-terminalen Enden und zwei Haarnadelschleifen vorgesehen sind, dominiert wird ( Abbildung 1). In dieser Studie untersuchen wir die Bedeutung des C-terminalen Ende und der zweite Bindungspartner Schleife von Cystatin B für die Bindung an mit Rinder-Cystatin Papain B-Varianten mit Punktmutationen in Bereichen der Interaktion mit Papain. Wir bestimmen zunächst die spezifische Bindung Konzentration der vier Cystatin B-Varianten verwendet werden, sowie die des Wildtyp-Proteins. Sobald die spezifische Bindung Wirkstoffkonzentrationen Cystatin B bestimmt werden, sind die Geschwindigkeit und Affinitätskonstanten von Wildtyp und Mutante Varianten von Cystatin B Bindung an Papain gemessen Biacore X100. 5. Instrument und Reagenzien <ol><li> Die Cystatin B Varianten Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly sind Cys3Ser/Tyr97Ala und Cys3Ser hergestellt wie zuvor beschriebenen 4. Alle Mutanten enthalten eine zusätzliche Substitution von Cystein zu Serin an Position 3, um die Bildung von Disulfid-gebundene inaktive Dimere von Cystatin B. verhindern </li><li> Das Papain Ziel ist auch bereit, wie zuvor 5 beschrieben. Es ist S-(Methylthio) Papain (MMTS-Papain) mit einem Methylthiogruppe an Cys25 im aktiven Spalt, wodurch die Protease katalytisch inaktiv. </li><li> Biacore X100 mit Biacore X100-Plus-Paket dient zur Messung und Analyse der spezifischen Bindung Konzentrationen und Bindungskinetik. </li><li> MMTS-Papain auf Sensor Chip CM5 mit Biacore Amine Coupling Kit immobilisiert. </li><li> Die Pisten sind bei 25 ° C durchgeführt, und der Puffer 0,01 M Hepes pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,0034 M EDTA und 0,05% Polysorbat 20. </li><li> Zwischen den einzelnen Variante des Cystatin B, ist die Sensoroberfläche mit 20 mM NaOH für 30 Sekunden bei einer Flussrate von 10 ml / min regeneriert. </li></ol> 6.Immobilization der Ligand MMTS-Papain Kovalente Bindung von MMTS-Papain für EUFA Analyse EUFA beruht auf Messung der Bindung Rate unter Bedingungen, wo die Rate durch Diffusion von Analyt-Moleküle an die Oberfläche (Stofftransport Begrenzung) begrenzt ist. Dies ist durch eine hohe Immobilisierung Ebenen des Liganden begünstigt. Immobilisierung von MMTS-Papain wurde eingerichtet und laufen über die Immobilisierung Assistent von Biacore X100-Control-Software. <ol><li> Aktivieren Sie die Oberfläche in Flow-Zelle 2 durch Injektion einer Mischung von Succinimid (NHS) und Carbodiimid (EDC) für 7 Minuten bei einer Flussrate von 10 ml / min. Flow-Zelle 1 ist unverändert bleiben, um als Bezugsfläche verwendet werden. </li><li> Inject MMTS-Papain auf 50μg/ml in Natriumacetat-Puffer bei pH 4,5 für 15 Minuten bei einer Flussrate von 5 ml / min. </li><li> Ethanolamine ist für 7 Minuten bei einer Flussrate von 10 ml / min, um die verbleibenden aktiven Estern deaktivieren injiziert. </li></ol> Die gesamte Kupplung Verfahren sollte in Folge ~ 3000 RU MMTS-Papain in Flow-Zelle 2 immobilisiert. Kovalente Bindung von MMTS-Papain für kinetische Analyse Das gleiche Verfahren wird zur Immobilisierung von MMTS-Papain für kinetische Analyse, mit dem einzigen Unterschied, dass in kinetische Analyse, die Immobilisierung Ebene zu sein, um die Bindung Rate beschränkt wird durch Diffusion zu vermeiden geringen Anforderungen eingesetzt. Flow-Zelle 1 ist unverändert bleiben in diesem Schritt auch, um als Bezugsfläche verwendet werden. <ol start="4"><li> Nach Aktivierung der Oberfläche mit der Mischung von NHS und EDC als in 7.1 ist MMTS-Papain auf 1μg/ml für 50 Sekunden injiziert. Danach wird die Oberfläche mit einer Injektion von Ethanolamin als in Schritt 7.3 de-aktiviert. </li></ol> Die Kopplung Ebene sollte ca. 50 RU werden nach diesem Verfahren. 7. Bestimmen Cystatin B-Konzentration mit der EUFA Test <ol><li> Die EUFA Experiment ist nach der EUFA Assistenten in Biacore X100-Plus-Paket gesetzt. Etwa 10 nM Protein ist bei Flussraten 10 und 100 ml / min in zweifacher Ausfertigung für 48 Sekunden injiziert. Die Oberfläche ist mit 20 mM NaOH zwischen jedem Zyklus regeneriert. </li><li> Fügen Sie leere Spritzen für jeden Durchsatz. </li><li> Die Proteinkonzentration wird dann aus der Bindung von Daten (Abbildung 3) mit th bestimmte EUFA Auswertung Merkmal der Biacore X100-Plus-Paket Auswertesoftware. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Ergebnisse der EUFA Analyse von Wildtyp-Cystatin B. Die spezifische Bindung Konzentration Daten wurden von der Sensorgrammen bei Flussraten von 10 und 100 ml / min erhalten extrahiert. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Konzentrationen der Mutanten ermittelt A 280-Messung (n = 3) und EUFA (n = 2). Die Standard-Fehler werden durch Fehlerbalken bezeichnet. Das molare Absorptionskoeffizienten wurden berechnet, wie in (6) beschrieben. Ein großer Unterschied in der Konzentration Werte Cys3Ser/Leu73Gly Mutante durch die beiden Methoden bestimmt werden können beobachtet werden. </li><li> Beim Vergleich der Konzentration von A 280-Messung mit, dass durch EUFA bestimmt wird, ist es klar, dass, während in den meisten Fällen wird das Protein vollständig aktiv, für die Cys3Ser/Leu73Gly Variante, der Anteil der aktiven Proteins sehr gering ist (Abbildung 3). Die folgende Tabelle zeigt die Aktivitäten des Cystatin B Varianten bezogen auf das Gesamtgewicht Konzentrationen von A 280. <table border="0"><tbody><tr><td> Probe </td><td> EUFA in Bezug auf A 280 (%) </td></tr><tr><td> Wildtyp </td><td> 94 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 101 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 99 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 83 </td></tr></tbody></table></li></ol> 8. Die Messung der Kinetik des Cystatin B Bindung an Papain <ol><li> Basierend auf der EUFA Messungen, bereiten eine zweifache Konzentration Serie reichen von 2,5 bis 40 nM für jeden der Cystatin B-Varianten. </li><li> Die Kinetik Experiment wird mit Hilfe der Kinetik-Assistenten in Biacore X100 mit dem Single-Cycle-Ansatz aus. Die Oberfläche ist nicht zwischen den Injektionen regeneriert, aber nach dem Ende eines jeden Zyklus-Analyse unter Verwendung von 20 mM NaOH als Regenerations-Lösung. </li><li> Der Versuchsaufbau ist so, dass jeder Zyklus haltige Probe durch ein Leerzeichen Zyklus, in dem Puffer anstelle von Probe injiziert wird flankiert wird. </li><li> Verwenden Sie die Kinetik Auswertung Funktion in Biacore X100 um automatisch leere Subtraktionen Bezugspunkt abgezogen Daten vor dem Einbau einer 1:1-Interaktionsmodell. </li><li> Die experimentellen Daten für die Bindung von Cystatin B-Varianten zu Papain erhalten ist in Abbildung 4 dargestellt. Die folgende Tabelle fasst die Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten und das Gleichgewicht Dissoziationskonstanten in der kinetischen Analyse erhalten. <table border="0"><tbody><tr><td> Probe </td><td> k a (M -1 s -1) </td><td> k d (s -1) </td><td> K D (M) </td></tr><tr><td> Wildtyp </td><td> 1,8 x 10 6 </td><td> 0,41 x 10 -3 </td><td> 2,3 x 10 -10 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 1,7 x 10 -3 </td><td> 1,5 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 23 x 10 -3 </td><td> 2,2 x 10 -8 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 1,7 x 10 6 </td><td> 12 x 10 -3 </td><td> 7,1 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 0,9 x 10 6 </td><td> 0,53 x 10 -3 </td><td> 5,8 x 10 -10 </td></tr></tbody></table> <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Kinetic-Profile für Cystatin B Varianten Bindung an MMTS-Papain ermittelt Single-Cycle-Kinetik. Sensorgramme zeigen blank-und Referenz abgezogen Daten mit kinetischen fit für den 1:1-Interaktion-Modell in Schwarz überlagert. </li><li> Während der Verband Preise der Mutanten vergleichbar mit der des Wildtyp-Proteins (Abbildung 5, oben), kann die Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten der Mutanten höher sein um fast zwei Größenordnungen, mit einer entsprechenden Erhöhung des Gleichgewichts Dissoziation konstant (Abbildung 5, unten). <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Die Berechnungen der Geschwindigkeit und Affinitätskonstanten wurden die Konzentrationen von EUFA erzielt wurden. Die Änderungen von k a, k d und K D, mit der Mutationen sind in den Diagrammen dargestellt. </li><li> Da Probenkonzentration ist ein Parameter in die Berechnung des Vereins Geschwindigkeitskonstante aus den experimentellen Daten ist eswichtig, dass es korrekt ist. Mit der Konzentration auf die A 280 Messung statt EUFA basiert, würde zu dem Schluss führen, dass Leu73 ist wichtig für den Verein Rate, wo Ersatz scheint in etwa 10 mal langsamer als die anderen Verein Cystatin B-Varianten führen. Allerdings ist die spezifische Bindung Konzentration von EUFA gemessen nur etwa 10% des gesamten Proteins in diesem Fall. Wenn diese dies berücksichtigt wird deutlich, dass der Verein Rate für Leu73 ähnlich wie bei den anderen Varianten ist. Daher erlaubt EUFA für eine korrekte Beurteilung der k a und K D die damit die angemessene Interpretation der Wechselwirkung Mechanismus. </li></ol>

<ol>
	<li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation.">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li><li>Sigmundsson, K., M&#226;sson, G., Rice, R., Beauchemin, N., &#214;brink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules:+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification.">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li><li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain:+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction.">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li><li>Pol, E., Bj&#246;rk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+(Stefin+B)+for+inhibition+of+cysteine+proteinases.">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li><li>Bj&#246;rk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes.">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li><li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li></ol>

Der Autor wird von GE Healthcare, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

In dieser Arbeit wurden vier Mutanten und Wildtyp Cystatin B produziert, um die Bedeutung der zweiten Schleife binden zu bewerten und C-terminalen Enden für die Interaktion zwischen Cystatin B und Papain. Diese Studie zeigt die Vorteile und die einfache Handhabung Biacore X100 um eine spezifische Bindung Konzentration zu bestimmen und die Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen zu analysieren, um Struktur-Funktions-Beziehungen zu verstehen. Wir haben gezeigt, dass die Messung insgesamt Proteinkonzentration offenbaren jedoch nicht die Protein-Varianten, die bindende Aktivität, die in diesem Fall führt eine signifikante Messfehler bei der Bestimmung der Bindungsaffinität und Kinetik reduziert haben. Die spezifische Bindung Konzentrationen des Cystatin B-Varianten wurden mittels EUFA mit Biacore X100. Mit Konzentration Messungen EUFA als Eingabe für die kinetische Analyse ergab zuverlässig bewerten und Affinitätskonstanten, so dass die richtige Interpretation der Wechselwirkung Mechanismus. Die verminderte Affinität der Mutanten wurden fast ausschließlich wegen eines erhöhten k d-Wert, während k eine nur geringfügig betroffen war. Dieses Verhalten zeigt, dass sowohl die zweite Bindungsstelle Loop-Region und dem C-terminalen Ende nicht für die Bindung von Inhibitor zu Papain wichtig. Stattdessen tragen sie zur Bindungsaffinität in erster Linie, indem der Inhibitor an das Enzym gebunden, sobald der Komplex gebildet hat.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1100-73</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 Plus Package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1007-98</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Sensor Chip CM5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-14</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Amine Coupling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetate buffer pH 4.5, 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1003-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1008-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Vials &Oslash; 11 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1002-87</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber caps, type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1004-11</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis 

In dieser Studie untersuchen wir die Wechselwirkung zwischen den Rindern Cystein Protease-Inhibitor Cystatin B und ein katalytisch inaktiver Form von Papain (Abb. 1), eine Pflanze Cysteinprotease, durch Echtzeit-label-free-Analyse mit Biacore X100. Mehrere Cystatin B-Varianten mit Punktmutationen in Bereichen der Interaktion mit Papain, hergestellt werden. Für jede Cystatin B-Variante ermitteln wir ihre spezifische Bindung Konzentration mit Kalibrier-freie Konzentration Analyse (EUFA) und vergleichen die Werte mit Gesamt-Protein-Konzentration erhalten, wie durch A bestimmt<sub&gt; 280</sub&gt;. Danach wird die Kinetik der einzelnen Cystatin B-Variante Bindung an Papain gemessen Single-Cycle-Kinetik (SCK). Wir zeigen, dass eine der vier Cystatin B-Varianten untersuchen wir nur teilweise aktiv für die Bindung. Diese partielle Aktivität, durch die EUFA offenbart, entspricht einem signifikanten Unterschied in den Verein Geschwindigkeitskonstante (<em&gt; K</em<sub&gt; A</sub&gt;) Und Affinität (<em&gt; K</em<sub&gt; D</sub&gt;), Im Vergleich zu den Werten errechnet Gesamt-Protein-Konzentration. Mit EUFA in Kombination mit kinetischen Analyse in einem Struktur-Funktions-Studie trägt dazu bei, zuverlässige Ergebnisse und hilft, die richtige Interpretation der Wechselwirkung Mechanismus zu machen.

Watch this Scientific Journal Video about The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis at JoVE.com

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Wir wenden label-free-Protein-Interaktion Analyse mittels Biacore X100 für Struktur-Funktions-Analyse der Bindung von mehreren Cystatin B-Mutanten durch kinetische Charakterisierung Papain. Calibration-free-Konzentration Analyse (EUFA) misst die Konzentration des Proteins mit behielt bindende Aktivität, ohne die Notwendigkeit für eine Standard-Kurve. Wir zeigen, dass die Bestätigung der Konzentrationen mit EUFA erhöht die Zuverlässigkeit der kinetischen Analyse und die kinetischen Konstanten zuverlässig bestimmt, auch wenn die Aktivität eines rekombinanten Proteins reduziert wird.

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

the-importance-correct-protein-concentration-for-kinetics-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

20.4K Aufrufe.  GE Healthcare Bio-Sciences AB. Wir wenden label-free-Protein-Interaktion Analyse mittels Biacore X100 für Struktur-Funktions-Analyse der Bindung von mehreren Cystatin B-Mutanten durch kinetische Charakterisierung Papain. Calibration-free-Konzentration Analyse (EUFA) misst die Konzentration des Proteins mit behielt bindende Aktivität, ohne die Notwendigkeit für eine Standard-Kurve. Wir zeigen, dass die Bestätigung der Konzentrationen mit EUFA erhöht die Zuverlässigkeit der kinetischen Analyse und ...

Serie: The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Forschung

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

Spot the Correct Tissue Every Time in Multi-Gewebe-Blöcke

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...