Wir danken Mitglieder der Miller-Labor für die Diskussion und die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem New Investigator Award von der Nathan Shock Center of Excellence in der Basic Biologie des Alterns zu DLM und den National Institutes of Health Award R00 AG030550 zu DLM unterstützt.

1. Bau von Klimakammern <ol><li> Wählen Sie den kleinsten vernünftigen Volumen der Kammer für den Umfang des Projekts erforderlich sind. Kammer muss aus Gas (O 2) undurchlässigen Material. Pyrex Kristallisation Gerichte, Anaeropack Boxen, oder große Stimmen-Acryl-Boxen (Ellard Instrumentation), verwendet werden kann. Wir haben festgestellt, dass 9 50 mm-Platten in einem 100 x 50 Kimex Kristallisationsschale passen. Glasplatten als Deckel für Pyrex Kristallisation Speisen verwendet werden. </li><li> Bohren Sie ein Loch in der ausgewählten Kammer und passen mit einem Kunststoff Luer zu Schlauchstutzen (Cole Parmer). Fittings können durch Rohrverschraubung oder mit Epoxy gesichert werden. Installieren eines ähnlichen Montage auf der gegenüberliegenden Seite des Behälters zu ermöglichen, um Gas zu fließen und aus der Kammer. Wenn möglich, ausgeglichen werden, um Löcher turbulente Mischung zu erhöhen. </li><li> Erhalten Druckgasbehältern mit definierten O 2-Konzentrationen (saldiert mit N 2), die Standard zertifiziert sind für O 2 COntent oder, für anoxische Bedingungen, reines N 2 (&lt;10 ppm O 2). Verwenden Sie automatische Umschaltung Regulatoren für längerfristige Studien zu verhindern, dass der Sauerstoffgehalt in den Kammern. </li><li> Organismus auf Hypoxie wurde gezeigt, dass temperaturabhängigen 15 sein. Rl die Kammer in einem Inkubator, können verschiedenen Temperaturen gehalten werden. Die Temperaturen in einem Inkubator kann ungleichmäßig und als solche, ist es ratsam, die Verwendung eines Temperatur-Datenlogger, um ständig die Temperatur im Inneren der Kammer zu machen. </li></ol> 2. Anschließen des Gas zu der Klimakammer <ol><li> Für alle Verbindungen, verwenden Sie ein Achtel-Zoll-Außendurchmesser Schlauch entweder durch Schnappverbindungen oder Klemmringverschraubungen verbunden. Schlauch sollte undurchlässig und nicht reaktiv mit O 2, wie beispielsweise fluoriertes Ethylen-Propylen (FEP) oder Nylon (Cole Parmer). Für eine schematische Darstellung des Setup abgeschlossen, siehe Abbildung 1. </li><li> Verbinden Sie den COM-gedrückt Gastanks zu einer Absperreinrichtung, wie ein Mass Flow Controller (Sierra Instruments) oder Rotameter (Aalborg). Sicherstellen, dass vor dem Druck des Tanks innerhalb des Bereichs der Durchflußeinrichtung und die Schlauchtülle ist. Zwei-Stufen-Regler werden im Allgemeinen verwendet, mit der zweiten Stufe gesetzt, um den gewünschten Druck [Siehe Abschnitt drei zur Auswahl der geeigneten Flussrate] </li><li> Hydrat das Gas durch Blasenbildung durch destilliertes Wasser mit einer Gaswaschflasche mit Fritte Zylinder, dann direkt in einen der Anschlüsse auf der Klimakammer, so dass der zweite Beschlag offen für Gas-Ausstoß (siehe Abbildung 1). Für kurzfristige Studien, schützt gegen Feuchtigkeit Gas Platte Austrocknung, sondern Luftfeuchtigkeit Überwachung kann notwendig sein, für Langzeitstudien. </li><li> Dow Corning Vakuumfett verwendet, um die Kammer abzudichten. Platz Gewichte auf dem Deckel der Kammer, um sicherzustellen, eine luftdichte Abdichtung. Um einen dichten Abschluss und ausreichende Strömung zu bestätigen, halten Sie einen kleinen Pool von Wasser in der Handfläche von yunsere behandschuhten Hand auf die passende aus der Kammer auf und überprüfen Sie die Blasen. </li></ol> 3. Die Auswahl Durchfluss <ol><li> Unter der Annahme, perfekte Mischung, gibt es 90% Gasaustausch der gasförmigen Atmosphäre jedes Mal das Volumen der Kammer Fassung (Fick-Gesetz) ist. Zum Beispiel in einem 100 ccm Kammer mit einer Flussrate von 100 cm ³ / min, wird das ursprüngliche Haus Luft in der Kammer mit 90% des von Ihnen gewünschten Gas nach 1 Minute ausgewechselt werden, und wird asymptotisch vollständigen Austausch von 90% pro Minute danach. </li><li> Höhere Fließgeschwindigkeiten und kleinere Behälter wird Ihre gewünschte Sauerstoffkonzentration schneller zu erreichen. Für 100 x 50 Kimex Containern (400 cc), einer Flussrate von 120 cm ³ / min erreicht 99,9% Austausch in 10 Minuten (3 Austausch). Diese Durchflussrate ist für die meisten Sauerstoff-Bedingungen. Nach unserer Kenntnis hat es nicht eine systematische Untersuchung, wie sich die Rate der Änderung der O 2-Konzentration beeinflusst die Reaktion in C. elegans. </li></ol><ol><li> Worms die hypoxischen Bedingungen ausgesetzt häufig entkommen die Oberfläche der Agarplatten. Um dies zu verhindern, das einen Ring aus Palmitinsäure (10 mg / ml in Ethanol) um den Rand der Platten. Die Palmitinsäure wird aus der Lösung, wie die Ethanol verdampft und bildet eine physische Barriere. Palmitinsäure Barrieren wirken sich nicht auf Rate von Eier-und Fruchtbarkeit oder Lebensdauer in C. elegans 16,17. Burrowing nicht häufiger auftreten in hypoxischen Bedingungen, so sind zusätzliche vorbeugende Maßnahmen in der Regel nicht erforderlich. </li><li><ol><li> Generieren Sie synchronisierten Populationen durch Bleichen graviden Erwachsenen in einem kleinen Tropfen alkalische Bleichmittel-Lösung auf ungesetzte Nematodenwachstum Media (NGM) Platten 18. Im Gegensatz zu Standard-Großserienfertigung Hypochloritbleiche Protokolle, Pick 1-100 Tiere in einem Tropfen Bleichmittel-Lösung auf der Oberfläche eines NGM Platte, dann können die Bleichmittel-Lösung in die Platte aufnehmen <sup&gt; 18. Nach mindestens 12 Stunden, überweisen Sie den synchronisierten L1-Larven auf Platten mit Live-OP50 Bakterien geimpft. Alternativ kann man damit schwangeren Erwachsenen, um Eier auf dem Teller lag für 2-3 Stunden, um eine Gruppe von Würmern, die synchron entwickeln wird oder Pick L4-Larven aus einer gemischten Bevölkerung zu generieren. </li><li> Vermeiden Sie es, gebleicht Embryonen zu Hypoxie, da dies die Lebensfähigkeit 13 reduzieren können. Um jungen Embryonen (2-4 Zellen) zu sammeln, können trächtige Erwachsene in einer kleinen Menge Wasser mit einer Rasierklinge und Embryonen bewegt, um Platten mit dem Mund pipettieren für nachfolgende Exposition gegenüber Hypoxie gehackt werden. </li></ol></li><li> Dichtungsplatten in der Klimakammer. Kontrolltiere sollte Normoxie (Haus Luft) bei der gleichen Temperatur wie behandelten Würmern zu halten. Es gibt keinen Unterschied zwischen beobachtbaren Proben im Haus Luft gelassen und diese in einem identischen Haus mit Kammer strömende Luft über ihnen aufrechterhalten. Initiieren Sie Gasfluss und pflegen Belichtung für die gewünschte Zeit. Um die Einheitlichkeit in der Rampe zu gewährleisten, achten Sie darauf,ersetzen Sie das Wasser in der Gaswaschflasche vor der Belichtung. </li><li> Zum Nachweis Überleben von Embryonen, können die Würmer für 48 h nach Rückkehr in Raumluft zu entwickeln, zu welchem ​​Zeitpunkt sie sollte vierten Larvenstadium / Tag Erwachsene. Ergebnis für das Überleben, Zensur keine Würmer, die nicht berücksichtigt werden können. </li><li> Mit Tieren in Kontakt, um eine Hypoxie zu visualisieren, zu bewegen Würmer zu einem Rückgang der M9 auf einem 22 mm 2 Deckglas, und schwenken auf ein Kissen aus 2% Agarose in M9-18. Falls erforderlich, Levamisol (25 mM) oder Natriumazid (10 mM) als Anästhetikum verwendet. Natriumazid und Levamisol kann verwirren einige Beobachtungen aufgrund der Toxizität und sollte überlegt eingesetzt werden 19. </li></ol> 5. Schnelle Ernte des Hypoxie-exponierte Worms (Beispiel: Vorbereitung von Proben für HIF-1 Western-Analyse) Viele Hypoxie-induzierte Effekte sind schnell bei der Rückkehr in Raumluft umgekehrt, einschließlich der Wiederaufnahme der Eierproduktion 12, die Phosphorylierung von mitotischen Epitopein der Embryogenese 13 und den Abbau des HIF-1-Protein 9,20. Schnelle Isolierung von Tieren ausgesetzt Hypoxie ist erforderlich, um reproduzierbare Effekte in diesen Bedingungen zu erhalten. Mit diesem Setup können Tiere geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren in weniger als zwei Minuten. Während Handschuhfach Hypoxie Kammern für die Manipulation von Proben ermöglichen in anoxischen Bedingungen, beschränken ihre Kosten und Praktikabilität für die andere Bedingungen als Anoxie ihre Nützlichkeit. <ol><li> Wachsen Bristol N2 Würmer auf 4 10 cm hohe Wachstumsraten (HG)-Platten, bis ein Großteil der Würmer graviden Erwachsenen sind 18. Waschen Sie Würmer in ein 15 ml konischen Röhrchen, das eine 1:5 alkalische Bleichmittel-Lösung und Inkubation mit Rotation, bis Würmer zu lösen, nicht mehr als 5 Minuten 9 beginnen. Waschen Sie die Würmer dreimal mit M9, Abzentrifugieren bei 1500 xg zwischen jedem Waschen ohne Bremsen. </li><li> Platte gebleichten Embryonen auf 8 150 mm NGM-Platten und ermöglichen auf L4-Larven (~ 48 Stunden für Bristol N2 bei 22 ° C) zu entwickeln.Bewegen Platten zu Klimakammern und entlarven zu hypoxischen (1.000 ppm, 5.000 ppm) und anoxische (N2) Bedingungen für 4 Stunden. Die Belichtungszeiten werden je nach Versuchsaufbau variieren. Während der Exposition gegenüber Hypoxie hat eine unmittelbare Auswirkung auf Rate der Eiablage, zwei Zell-Embryonen nach 16-18 Stunden der Exposition 12 sterben. Mit diesem Aufbau Hypoxie Kammer wird der untere Grenzwert für die Belastung durch die Geschwindigkeit der Atmosphärenaustausch bis das Gleichgewicht erreicht beschränkt. </li><li> Beschriften Sie ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen und eine 15 ml konischen Röhrchen für jede experimentelle Probe. Würmer ausgesetzt Hypoxie eher zu den Seiten des Rohres während der Ernte zu halten. Um dies zu verhindern, Platz 100 ul 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in den einzelnen 15 ml konischen Röhrchen. Wenn SDS inhibiert Downstream-Anwendungen, Rinderserumalbumin (BSA) verwendet Festsitzen zu verhindern werden. Der routinemäßige Einsatz von SDS oder BSA scheint nicht eine scheinbare Unterschied haben. In 50 ul 2x Protein Loading-Farbstoff (4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol und einverfolgen Bromphenolblau in 30% Glycerin (w / v)) in den 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werfen Sie einen Dewar mit flüssigem Stickstoff bereit. </li><li> Zeit die Schritte nach dem Entfernen der Würmer von Hypoxie und aufzeichnen. Nehmen Sie den Deckel auf die Hypoxiekammer, nehmen Sie eine Probe Platte, und verschließen die Kammer. Verwenden Sie destilliertes Wasser, um die Würmer auf eine Nylon-Filter waschen und gießen Sie dann in das 15 ml konischen Röhrchen. Drehen Sie die Würmer, die in einem Desktop-Zentrifuge bei 1500 xg für 15-20 Sekunden mit Bremse. </li><li> Verwendung eines Vakuums an die meisten der aus dem Glas zu entfernen, wobei die Schnecke Pellet unberührt. </li><li> Mit einer Pipette, bewegen Sie den Wurm Pellet in 50 ul auf die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die Tube und tauchen Sie ein in flüssigem Stickstoff. </li><li> Wiederholen, bis alle Proben isoliert worden. Befolgen Sie diese Verfahren für die Stallluft Kontrollproben für Konsistenz. Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Organismal Effekte von Hypoxie zu sehendurch Prüfung der Realisierbarkeit bis zum Erwachsenenalter von C. elegans (Abbildung 2). Embryonen, die durch Wildtyp-Bristol (N2) und HIF-1 (IA04) Deletionsmutanten gelegt sind alle im Haus Luft O 2-Konzentrationen (210.000 ppm O 2) zu überleben. N 2 Würmer sind in der Lage, sich anzupassen und Erwachsenenalter überleben in 5.000 ppm O 2, während HIF-1-Embryonen nicht lebensfähig sind. Dies zeigt, dass HIF-1 essentiell für die Anpassung an die wechselnden Konzentrationen von Sauerstoff in der Umgebung 10 ist. Weder noch N2 HIF-1-Tiere können überleben Exposition gegenüber 1.000 ppm O 2. Visualisierung Wurm direkt in Hypoxie ist machbar mit der Verwendung eines Binokular und durchsichtigen Behälter (Abbildung 3). Durch die direkte Platzierung der Hypoxie Kammer auf der Binokular, gibt es keine Notwendigkeit, die Würmer aus Hypoxie Organismen zu entfernen, Reaktionen zu beobachten. Der Umfang kann mit Fluoreszenz-Flatscreen ausgestattet werden (wie in Abbildung 3 </strong&gt;), weiter auszubauen, welche Arten von Beobachtungen in Hypoxie, die möglich sind. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Abbildung 1. Beispiel Hypoxie Kammer. Richtung der Gasströmung durch Pfeile angedeutet. Das Gas wird in Druckgasbehältern mit definierten O 2-Konzentrationen (1) und einer Zweistufen-Druckregleranordnung befestigt ist (2) gespeichert. Gas tritt in den Boden des Strömungsrohrs (3), beim Verlassen des an der richtigen Strömungsrate. Gas strömt dann in die Blase Kolben (4), Hydratisieren des Gases (die korrekte Verbindung der Blase Kolben durch Beobachtung Blasen). Hydratisierte Gas strömt dann in die Kammer bei der Hypoxie Zuflussventilmechanismus (5), Aussetzen der Proben auf Hypoxie. Das Gas schließlich Öffnungen in den Raum durch eine Auslassloch in der Kammer gebohrt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Lebensfähigkeit von Embryonen ausgesetzt bis 1.000 ppm O 2, 5000 ppm O <sub&gt; 2 und Normoxie (~ 210.000 ppm O 2). Embryonen wurden jeweils Sauerstoffgehalt als Embryonen für 24 Stunden in einem kontinuierlichen Fluß Sauerstoffkammern ausgesetzt. Worms wurden normoxischen Bedingungen, dürfen bis zum Erwachsenenalter für 48 Stunden entwickeln bewegt, und dann trafen für die Lebensfähigkeit bis zum Erwachsenenalter. n&gt; 50, n = 5. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Abbildung 3. Visualisierung von C. elegans in Hypoxie mit Mikroskopie. Worms sind auf die Hypoxie mit den beschriebenen Methoden ausgesetzt. Die transparente Klimakammer (gebaut mit einer Pyrex Kristallisierschale und Glasplatte) wird direkt auf der Bühne eines Binokular gelegt. Zwei Ansichten werden gezeigt, darunter die gesamte ein Gasstrom einrichten, die andere nur mit der Kammer auf dem Mikroskoptisch.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Verfahren stellt eine Strategie zur Konstruktion einer hypoxischen Umgebung, die für Umgebungen mit präzisen Konzentrationen von Sauerstoff, der im Labor gehalten werden können. Diese Kammern bieten eine einfache Methode zur Belichtung von Organismen auf bestimmte niedrige Konzentrationen von O 2 und die Überwachung der molekularen und physiologischen Ausgänge. Die Klimakammer beschrieben wird durch das Labor statt im Handel erworben und können so modifiziert werden, um die Bedürfnisse des Exper...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Schlauch (FEP und PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06.605 bis 27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE)&quot; R-3603 </td></tr><tr><td> Klemmringverschraubungen </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> 06.363 bis 58 (M. Koppler 1/16 &quot;) 06.363-62 (F-Koppler 1/16 &quot;) 06.363 bis 60 (M. Koppler 1/8 &quot;) 06.363-61 (F-Koppler 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Messkonus </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010073 (3 Ausgang) PMR1-013520 (1 Ausgang) </td></tr><tr><td> Mass Flow Controller </td><td> Sierra Instruments </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) </td></tr><tr><td> Druckgasbehälter </td><td> Airgas </td><td> Auf Bestellung &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Kunststoff Luer zu Schlauchtülle </td><td> Cole Parmer </td><td> 45505-41 (Serie 500 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Gegossenes Acrylglas-Boxen </td><td> Ellard Instrumentation </td><td> Auf Bestellung </td></tr><tr><td> Rohrverbindungsstücke (Messing oder Edelstahl) </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;Überwurfmutter) B-200-3 (1/8 &quot;T-Stück) B-400-Set (1/4 &quot;Aderendhülsen) B-QM2-B1-200 (QM Körper QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;male conn) </td></tr><tr><td> Dow Corning Vakuumfett </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPack Box </td><td> Misubishi Gas Chemical Company </td><td> R684004 (0,4 Liter) R685025 (2,5 Liter) R685070 (7,0 Liter) </td></tr><tr><td> Pyrex Gaswaschflasche </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Palmitinsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus-IgG-Meerrettichperoxidase </td><td> Southern Biotechnology Associates </td><td> 1032-05 </td></tr><tr><td> SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrat </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 Glaskristallisationsverfahren Gerichte </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on c. elegans

Sauerstoff ist für alle Metazoen, um zu überleben, mit einer Ausnahme 1 bekannt. Verminderte Verfügbarkeit von O 2 (Hypoxie) kann Verlauf einer Krankheit, eine normale Entwicklung oder Änderungen der Umgebungsbedingungen 5.2 entstehen. Das Verständnis der zellulären Signalwege, die bei der Reaktion auf Hypoxie beteiligt sind, konnten neue Einblicke in die Behandlungsstrategien bieten für unterschiedliche menschliche Erkrankungen, Schlaganfall, Krebs aus. Dieses Ziel wurde behindert, zumindest teilweise, durch technische Schwierigkeiten mit kontrollierter hypoxische Exposition in genetisch zugänglich Modell-Organismen verbunden sind. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ideal als Modellorganismus für das Studium der hypoxischen Reaktion geeignet, da sie einfach zu kultivieren ist und genetisch zu manipulieren. Darüber hinaus ist es möglich, die zellulären Reaktionen auf spezifische hypoxischen O 2-Konzentrationen, ohne Verwechslung wirksam, da C zu studieren elegans erhalten O 2 (und andere Gase) durch Diffusion, um eine erleichterte Atemwege 6 gegenüber. Faktoren bekannt, in der Reaktion auf Hypoxie beteiligt sind in C. erhalten elegans. Die tatsächliche Reaktion auf Hypoxie hängt von der spezifischen Konzentration von O 2 erhältlich ist. In C. elegans, Hypoxie mäßig einen Transkriptions-Reaktion vermittelt wesentlich durch HIF-1 löst, erfordert die hoch-konservierten durch Hypoxie induzierbare Transkription Faktor 6-9. C. elegans Embryonen HIF-1 in 5.000-20.000 ppm überleben O 2 7,10 . Hypoxie ist ein allgemeiner Begriff für &quot;weniger als normale O 2&quot;. Normoxie (normale O 2) können auch schwer zu definieren. Wir betrachten in der Regel Raumluft, die 210.000 ppm O 2 zu Normoxie zu sein. Es hat sich jedoch gezeigt, dass C elegans hat eine Präferenz für Verhaltens-O 2-Konzentrationen von 5 bis 12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. In larvae und Erwachsene, hif-1 wirkt, um Hypoxie-induzierte Diapause 5000 ppm O 2 12 zu verhindern. Allerdings ist hif-1 keine Rolle in der Antwort auf eine niedrigere Konzentration von O 2 (Anoxie, Arbeitsdefinition &lt;10 ppm O 2) 13. In Anoxie, C. elegans tritt in einem reversiblen Zustand der verschobenen Animation, in der alle mikroskopisch beobachtbare Aktivität aufhört 10. Die Tatsache, dass verschiedene physiologische Reaktionen treten bei unterschiedlichen Bedingungen unterstreicht die Bedeutung der mit experimenteller Kontrolle über die hypoxische Konzentration von O 2. Hier präsentieren wir eine Methode zur Konstruktion und Anwendung von Umweltmanagementsystemen Kammern, die zuverlässige und reproduzierbare hypoxischen Bedingungen produzieren mit definierten Konzentrationen von O 2. Der kontinuierliche Flow-Verfahren sorgt für eine schnelle Äquilibrierung der Kammer und erhöht die Stabilität des Systems. Zusätzlich kann die Transparenz undErreichbarkeit der Kammern ermöglichen eine direkte Visualisierung von Tieren, die auf Hypoxie ausgesetzt. Wir zeigen weiterhin, eine effektive Methode zur Ernte C. elegans Proben schnell nach Hypoxie, ist die Notwendigkeit, viele der schnell-umgekehrt Änderungen, die in Hypoxie 10,14 auftreten, zu beobachten. Diese Methode stellt eine wesentliche Grundlage, die leicht für individuelle Bedürfnisse Labor, einschließlich verschiedener Modellsysteme und einer Vielzahl von Gasen kann geändert werden.

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Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Die vorliegende Arbeit zeigt wie man mit kontinuierlichem Fluss Hypoxie Kammern zu verwenden, um Atmosphären mit definierten Konzentrationen von O generieren<sub&gt; 2</sub&gt;, Um biologische Reaktionen zu verstehen, um sank O<sub&gt; 2</sub&gt;. Dieses System ist einfach einzurichten und zu pflegen, und flexibel genug, um eine breite Palette von O anpassen<sub&gt; 2</sub&gt; Konzentrationen und Modellsysteme

Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren<em&gt; C elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

12.0K Aufrufe.  University of Washington. Die vorliegende Arbeit zeigt wie man mit kontinuierlichem Fluss Hypoxie Kammern zu verwenden, um Atmosphären mit definierten Konzentrationen von O generieren 2, Um biologische Reaktionen zu verstehen, um sank O 2. Dieses System ist einfach einzurichten und zu pflegen, und flexibel genug, um eine breite Palette von O anpassen 2 Konzentrationen und Modellsysteme

Serie: Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...