Während es andere feste Kulturmethoden gibt, ist dies das erste feste Kultursystem, das eine automatisierte longitudinale Verfolgung des Lebens und der Gesundheitsspanne einzelner Tiere sowie die longitudinale Bildgebung von fluoreszierenden Biomarkern in einem System ermöglicht. Dieses Protokoll liefert vergleichbare Ergebnisse wie Standard-C.elegans-Experimente an festem NGM und ist sowohl mit aversiven Interventionen als auch mit direkter Live-Fluoreszenzbildgebung kompatibel. Dieses System wird für die Alternsforschung von unschätzbarem Wert sein, insbesondere im Hinblick auf die langfristige Exposition gegenüber Umweltstressoren und die Beobachtung der Gen- und Proteindynamik über längere Zeiträume.
Sowohl die Vermeidung von Verunreinigungen als auch die gleichmäßige Trocknung der Bohrlöcher sind eine Herausforderung. Wir haben wichtige Punkte im schriftlichen Protokoll hervorgehoben, um diese Probleme zu minimieren. Mahlen Sie zunächst 500 Milligramm feste Palmitinsäure in einem Mörser und Stößel.
Kombinieren Sie es mit 15 Millilitern TWEEN 20 in einem konischen 50-Milliliter-Fläschchen und mischen Sie es durch Wirbeln, um die Kristalle aufzulösen. Fügen Sie 17,5 Milliliter 100%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Lösung, um so viel Palmitinsäure wie möglich aufzulösen. Dann 17,5 Milliliter Reinstwasser dazugeben und kräftig wirbeln.
Erhitzen Sie die Lösung vorsichtig in einem Perlenbad bei 80 Grad Celsius, bis sich die Palmitinsäure vollständig aufgelöst hat. Das Perlenbad auf 80 Grad Celsius erhitzen. Aliquotieren Sie unmittelbar vor Gebrauch einen Milliliter der Palmitinsäure-Arbeitslösung pro Microtray in einen separaten sterilen Behälter und fügen Sie vor dem Erhitzen vier Mikroliter Nystatin pro einem Milliliter Palmitinsäurelösung hinzu.
Besprühen Sie nun innen und außen mit Ethanol bis zur Sättigung und schütteln Sie das überschüssige Ethanol ab. Um das Microtray zu sterilisieren, legen Sie die Platte und den Deckel separat in den UV-Vernetzer. Nach 20 Minuten den Teller und den Deckel umdrehen.
Als nächstes stellen Sie die konische 15-Milliliter-Durchstechflasche mit der Palmitinsäure-Arbeitslösung in das Perlenbad und lassen Sie alle sichtbaren Kristalle vor Gebrauch vollständig auflösen. Erwärmen Sie das Microtray, indem Sie es zwei Minuten lang mit aufgesetzten Deckeln auf die Kante legen, die das Perlenbad umgibt. Entfernen Sie den Deckel des Microtrays und geben Sie langsam 200 Mikroliter Palmitinsäure-Arbeitslösung über die Rückwand des Microtrays.
Setzen Sie die Deckel wieder auf und lassen Sie das Microtray zwei bis drei Minuten auf dem Perlenbad stehen, damit sich die Palmitinsäurelösung auf dem Boden des Microtrays absetzen kann. Drehen Sie das Microtray um 180 Grad und fügen Sie die Palmitinsäure-Arbeitslösung hinzu, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie lmNGM vor, indem Sie die im Manuskript beschriebenen Komponenten hinzufügen.
Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter lmNGM in jedes Mikrotablett, das auf der Bank platziert ist. Achten Sie darauf, das Microtray beim Nachfüllen der Pipette abzudecken, um eine Kontamination zu minimieren. Um die Microtray-Vertiefungen mit bakteriellem Futter zu besiedeln, zentrifugieren Sie eine Kultur, die über Nacht bei 3.500 G gezüchtet wurde, 20 Minuten lang.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterienkultur in zehnfacher Konzentration mit 85 millimolarer Natriumchloridlösung. Pipettieren Sie dann vorsichtig fünf Mikroliter zehnfach konzentrierte Bakterienkultur auf die Oberfläche des lmNGM in jede Vertiefung. Vermeiden Sie es, die Bakterienkultur über die Seite des Brunnens und in die Palmitinsäure laufen zu lassen, da dies Würmer anlockt, die Vertiefung zu verlassen.
Legen Sie den sterilen 3D-gedruckten Einsatz in eine sterile Single-Well-Platte. Setzen Sie das Microtray in den 3D-gedruckten Adapter in der Single-Well-Platte ein. Verteilen Sie die Wasserkristalle großzügig auf den 3D-gedruckten Einsatz zwischen der äußeren Vertiefung des Microtrays und der Innenwand der Single-Well-Platte.
Wenn Würmer nicht sofort hinzugefügt werden, verschließen Sie die Microtray, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Schließen Sie den Deckel des Tabletts und wickeln Sie alle vier Seiten mit einem einzigen Stück Parafilm ein, um das Microtray zu versiegeln. Wiederholen Sie den Versiegelungsschritt mit Parafilm noch zweimal für drei Schichten.
Fügen Sie einen Wurm pro Vertiefung hinzu, sobald sie das gewünschte Lebensstadium erreicht haben. Geben Sie 40 Mikroliter Waschmittellösung auf den Deckel einer Single-Well-Platte und verwenden Sie ein Arbeitstuch, um den Deckel gleichmäßig zu beschichten. Verwenden Sie zusätzliche Tücher, um die Waschmittellösung zu verteilen, bis die Sicht durch den Deckel nicht mehr verzerrt ist.
Dehnen Sie das erste Stück Parafilm leicht, um zwei Seiten des Tabletts zu bedecken. Wischen Sie die Oberseite des Fachs mit einem Task-Tuch ab und befeuchten Sie es mit 70%igem Ethanol, um Fingerabdrücke zu entfernen. Messen Sie die Lebensdauer, indem Sie vorsichtig auf die Seite oder Oberseite der Platte klopfen oder ein helles blaues Licht auf die Platte leuchten lassen und jedes Tier beobachten.
Erziele ein totes Tier, wenn es sich nicht innerhalb weniger Sekunden bewegt. Wiederholen Sie diese Aufgabe alle ein bis drei Tage, bis alle Würmer abgestorben sind. Führen Sie Fluoreszenzbildgebung an einzelnen Wells durch.
Die Exposition gegenüber Kupfersulfat und Dithiothreitol verkürzte die Lebensdauer und Gesundheit der Würmer signifikant. Im Gegensatz dazu verringerte Kupfersulfat den Anteil des Lebens, der bei guter Gesundheit verbracht wurde, während Dithiothreitol dies nicht tat. Kupfersulfat reduzierte die durchschnittliche Aktivität bei Individuen innerhalb der Bevölkerung in größerem Ausmaß als Dithiothreitol in allen Altersgruppen.
Der Populationsdurchschnitt der Einzeltierfläche unter der Lebenszeitaktivitätskurve wird durch Kupfersulfat oder Dithiothreitol erheblich beeinträchtigt. Die kumulative Aktivität für einzelne Tiere bis zum 10. Tag korreliert mit ihrer Lebensspanne für Dithiothreitol-herausgeforderte Tiere, nicht jedoch für unbehandelte Kontrollen oder kupfersulfatbelastete Tiere. Zwischen dem dritten und achten Tag des Erwachsenenalters wird ein drastischer Anstieg der KYNU-1-Expression beobachtet, und danach kommt es mit zunehmendem Alter zu einem progressiven Rückgang.
Die kumulative Expression von KYNU-1 mScarlet bis zum 14. Tag des Erwachsenenalters korreliert mit der Lebenserwartung der Tiere. Da die Expression von KYNU-1 über die gesamte Lebensspanne dynamisch ist, verglichen wir die Expression von KYNU-1 in verschiedenen Altersstufen mit dem Gesamtüberleben einzelner Tiere. Zu keinem Zeitpunkt korrelierte die KYNU-1-Expression signifikant mit dem Überleben.
Bei diesem Verfahren sind die wichtigsten Schritte die Zugabe der Palmitinsäure, das Pipettieren des Agars und das Einbringen der Würmer. Diese Technik ermöglicht die longitudinale Verfolgung der Lebens- und Gesundheitsspanne sowie fluoreszierender Biomarker in einzelnen Würmern in einer Weise, die direkt mit NGM-Assays vergleichbar ist.
