Diese Arbeit wurde von den National Institutes of HealthGrants DK85035 und DK074797 (IH) unterstützt.

1. Worm Stämme <ol><li> Erhalten C. elegans Wildtyp N2 Bristol-Sorten von Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) und halten sie auf NGM-Platten ausgesät mit E. coli-Stamm OP50 7. Hinweis: Transgene Wurm Stämme IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) verwendet wurden, wie zuvor beschrieben, erzeugt 11. IQ6011 können aus dem entsprechenden Autor angefordert werden. </li></ol> 2. Herstellung des modifizierten C elegans Wohn-und Reproduktion Medium (mCeHR) Bereiten mCeHR flüssigen Medien wie unten 12 beschrieben. Diese axenischen flüssigen Medien können die Würmer ohne zusätzliche Nahrungsquellen wachsen. Führen Sie alle Manipulationen axenischen flüssigen Medien und axenischen Würmer mit streng sterilen Bedingungen, wie einer Steril. <ol><li> Erhalten Ultra pasteurisierte fettfreie Milch aus einem Lebensmittelgeschäft. Verwenden Sie die Kühl proKanal und nicht die Raumtemperatur Produkt. Vor der in mCeHR Medium, streifen verwenden Sie die Milch auf Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platten und Inkubation für 3 Tage bei 30 ° C und 37 ° C, um die Sterilität zu überprüfen. Bringen Sie die Milch auf 50 ml sterilen Röhrchen und bei -80 ° C </li><li> Bereiten Sie jede der folgenden Komponenten kombinieren und in der Reihenfolge und Mengen gegeben, um 1 l mCeHR vorbereiten (Tabelle 1A): 10 ml 2 mM Cholin Disäure Citrat, 10 ml Vitamin-und Wachstumsfaktor-Mix (siehe Rezept in Tabelle 1B), 10 ml von 2,4 mM myo-Inositol, 10 ml 2 mM Hämin Chlorid, 250 ml deionisiertes Wasser. Bewerben Absaug-und Filter durch ein 0,22 um Filtereinheit. </li><li> 20 ml der Nukleinsäuremischung (Rezeptur in Tabelle 1C) wurden 100 ml Mineralmischung (Rezeptur in Tabelle 1D), 20 ml 170 mg / ml Lactalbumin-Hydrolysat, 20 ml essentielle Aminosäuren, 10 ml nicht-essentiellen Aminosäuren Säuren mit 20 ml 450 mM KH 2 PO 4,50 ml von 1,45 M D-Glucose, 10 ml 1 M HEPES, Natriumsalz, 250 ml entionisiertem Wasser. </li><li> Absaugen zu filtern sterilisieren der Komponenten. Entfernen Sie den Filter und 1 ml 5 mg / ml Cholesterin. Sicherzustellen, dass der pH-Wert des Mediums beträgt etwa 6-6,5. Anmerkung: Diese Lösung kann bei -80 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. </li><li> Mit 20% (v / v) organische Ultra pasteurisierte Magermilch auf die mCeHR Medium vor der Verwendung. Verwenden Sie gewissenhaft steriler Technik (zum Beispiel in einer Steril) beim Öffnen und Aliquotierung die Milch. Lagern Sie das Material bei 4 ° C </li></ol> 3. Bereiten C. elegans für die Kultur in Axenic mCeHR Flüssigmedium <ol><li> Wachsen Würmer auf zehn 60 mm NGM-Platten, bis es viele graviden Würmer und eine minimale Menge an OP50 E. coli auf den Platten. </li><li> Entfernen Sie die Würmer von jeder Platte durch Spülen mit 5 ml M9-Puffer (Rezept in Tabelle 1F), und verbinden in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Lassen Sie die Würmer zu sEttle, indem man das Rohr auf 5 bis 10 Minuten stehen dann vorsichtig den Überstand mit dem E. coli. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 2x so viel von den restlichen Bakterien wie möglich vor der Fortsetzung des Verfahrens zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Würmer in 0,1 N NaCl in einem Volumen, das ein Vielfaches von drei ist, beispielsweise 1,5 ml, 3 ml oder 6 ml in denen einzelne Würmer in dem Rohr zu erkennen. </li><li> Bleichen die Würmer durch Zugabe von 5 N NaOH und 5% Natriumhypochlorit (Bleichmittel)-Lösung in einem Verhältnis zum 01.02.06 Wurm Federung. Beispielsweise 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% Natriumhypochlorit: 6 ml des Schnecken Suspension. Mischen Sie die NaOH und Bleichmittel, bevor Sie mit der Schnecken Federung. </li><li> Wirbel die Lösung kräftig, bis graviden Würmer gelöst und nur Eier in der Suspension (etwa 5 bis 10 min) sichtbar sind. Beobachtung des Prozesses unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops mit einem 10X-Objektiv. </li><li> Nachdem die Würmer vollständig gelöst, die sofort zu pelletierenEier bei 800 × g für 45 sec bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und spülen das Pellet zweimal mit 10 ml sterilem Wasser durch Zentrifugieren des Pellets bei 800 × g für 45 sec bei 4 ° C. </li><li> Nach dem Bleichen das Ei übertragen Pellets in ein 25 cm 2-Gewebekulturkolben mit 10 ml mCeHR Medien mit 100 ug / ml Tetracyclin ergänzt. Führen Sie diesen Vorgang mit sterilen Techniken. Wenn gewünscht, fügen Sie zusätzliche Antibiotika, darunter 250 ug / ml Nalidixinsäure, um das Bakterienwachstum in den axenischen Flüssigkulturen zu verhindern. </li><li> Flüssigkulturen bei 20 ° C inkubieren auf einem Schüttelinkubator bei etwa 70 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überprüfen Sie die Würmer täglich zu beachten die Phase der Entwicklung und der Wachstumsrate. Hinweis: Worms wird zunächst langsam wachsen und erfordern 7 bis 10 Tage, um trächtig zu werden. Da die Würmer akklimatisieren zu dem flüssigen Medium der Erzeugungszeit wird auf etwa 4 Tage Wildtyp (N2) Würmer verringern. </li><li> Nachdem die Würmer Entwickelt, um der schwangeren Bühne in flüssigen Medien, übertragen den Wurm Kultur zu einem konischen Rohr und Pellet die Würmer bei 800 g für 5 min bei 4 ° C mit einem Ausschwingrotor. </li><li> Entfernen des Überstandes und vorsichtig resuspendieren Schnecken Pellet in einem gleichen Volumen von 0,1 M NaCl. Verwenden Sie beispielsweise 10 ml 0,1 M NaCl für Würmer in 10 ml mCeHR kultiviert. Lassen Sie die Würmer für 5 min auf Eis zu begleichen. </li><li> Führen Sie die Schritte wie oben in 3.5-3.8 beschriebenen Bleichverfahren und ermöglichen die Würmer, für eine zweite Generation in den axenischen flüssigen Medien wachsen. Falls erforderlich, das Antibiotikum wieder um das Bakterienwachstum zu hemmen. </li><li> Auch hier ermöglichen die Würmer zu gravid werden dann Pellet resuspendieren und die Würmer in 0,1 M NaCl wie in den Schritten 3.12 und 3.13 beschrieben, dann wieder wie in den Schritten bleichen 3.5-3.8 beschrieben, um eine synchronisierte Bevölkerung zu produzieren. Wachsen die L1-Larven Würmer in flüssigen Medien ohne Antibiotika von nun an. </li></ol> 4. Synchronisieren von Worms aus FlüssigKultur <ol><li> Pellet zu resuspendieren und die Würmer in 0,1 M NaCl, wie oben in den Schritten 3.12 und 3.13 beschrieben. Bleach, wie oben beschrieben, in Schritten von 3,5 bis 3,8. </li><li> Resuspendieren Sie das Ei Pellet in 10 ml M9-Puffer und damit die Larven zu O / N bei 20 ° C auf einer rotierenden Plattform Schüttler schlüpfen. Hinweis: Die Eier werden in die L1-Larven schlüpfen, wird aber nicht weiter zu entwickeln, die Synchronisation der Würmer an der L1 Bühne. </li><li> Zur Erhaltung und Subkultur Würmer, Pellet-L1-Larven bei 800 g für 5 min, dann wieder zu suspendieren die Larven in 10 ml mCeHR und in ein 25 cm 2-Kolben. Ermöglichen die Würmer bei 20 ° C auf einer rotierenden Plattform wächst. Aufrechterhaltung einer maximalen Dichte von 3,000 Würmern / ml / cm 2, um eine angemessene Ernährung für die Würmer zu gewährleisten. Anmerkung: In diesem Stadium werden Antibiotika nicht erforderlich axenischen Bedingungen aufrechtzuerhalten, wenn die Verfahren unter Verwendung steriler Techniken in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt. Worms sollte täglich überwacht, um das Wachstum überprüft werden. </li></ol> 5. Freiezing und Auftauen Worms für Axenic Medium Kulturen <ol><li> Frieren axenischen asynchrone Wurm Kulturen oder synchronisiert L1-Larven in flüssigem Stickstoff. Pellet Würmer bei 800 × g für 5 min, dann in S-Puffer resuspendieren (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146,25 mM NaCl) unter Verwendung von 0,5 ml pro Ampulle. Gleiches Volumen von S-Puffer mit 30% v / v Glycerin zu jedem Fläschchen und übertragen die Würmer bis -80 ° C, bevor langfristige Lagerung in flüssigem N 2. Einfrieren etwa 1 x 10 &amp;sup6; Würmer pro ml in jeder Flasche. </li><li> Auftauen Würmer durch Inkubation der Röhrchen bei 37 ° C für ca. 2 min, bis fast die gesamte Eis geschmolzen ist. In einer Steril, übertragen Sie die Würmer in einen sterilen Kolben mit mCeHR und legen sie bei 20 ° C </li></ol> 6. Bestimmen Sie die Wirkung von Hämin Konzentration auf Wachstum und Reproduktion mCeHR <ol><li> Verwenden axenischen mCeHR Medien Nährstoff abhängige Wachstum von C. Assay elegans. Zur Bestimmung der Wirkung of Hämin Konzentration auf Wurm Wachstum und Entwicklung, verwenden synchronisiert axenischen N2 Würmer oder andere Stämme von Interesse. Synchronisieren L1-Larven, wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Am folgenden Tag, Pellet-und L1-Larven zählen synchronisiert und mit Wasser auf ein Wurm pro ul axenischen Medien. Machen Sie 10 mM Häminchlorid in 0,3 M NH 4 OH und auf pH 8 mit konzentrierter HCl. </li><li> In 800 ul mCeHR Medien zu einem 24-Well-Platte. Mit 100 Würmer in jede Vertiefung in 100 ul Medium. Hinzufügen Häminchlorid zu jeder Vertiefung in Konzentrationen im Bereich von 0 &amp;mgr; M, 1,5 &amp;mgr; M bis 1,000 &amp;mgr; M in dreifacher Ausführung. Sicherzustellen, dass alle Vertiefungen die gleiche Konzentration von 0,3 M NH 4 OH. Vorsichtig resuspendiert die Würmer vor dem Pipettieren, um sicherzustellen, dass 100 L1-Larven werden in jede Vertiefung gegeben. </li><li> Untersuchen Sie die Würmer täglich, und beachten Sie das Wachstum in jeder Konzentration in jede Vertiefung. Zähle die Anzahl der Würmer nach 9 Tagen Inkubation und zeichnen die Anzahl der Würmer / ml, die jedem HämKonzentration (Abbildung 1). </li></ol> 7. Wirkung von Hämin Konzentration auf Häm-Sensor Worms <ol><li> Inkubieren synchronisiert L1 Häm Sensor Würmer (Phrg-1 :: gfp) in mCeHR enthaltend 4 &amp;mgr; M, 8 &amp;mgr; M, 10 &amp;mgr; M und 20 &amp;mgr; M Hämin. </li><li> Bild die Würmer mittels Fluoreszenz der konfokalen Mikroskopie, 48 Stunden nach der Inkubation (Abbildung 2). </li></ol> 8. Verwendung mCeHR transgene C. generieren elegans Mit Mikropartikelbeschuss Hinweis: Das Verfahren zur Erstellung und Durchführung von Mikropartikelbeschuss mit unc-119 (ed3) Würmer in mCeHR gewachsen ist in Abbildung 3 13 skizziert. <ol><li> Worm Vorbereitung <ol><li> Übertragen etwa 1 x 10 6 asynchronen unc-119 (ED3) Würmer in 90 ml mCeHR Medien in einer 175 cm 2-Kolben eine Woche vor der Bombardierung. Lassen Sie die Würmer bei 20 ° C o wachsenna Schüttelplattform bei ~ 70 min (Abbildung 3-1). Hinweis: Eine Woche später, sollte der Wurm Dichte deutlich größer mit vielen Erwachsenen trächtige Würmer sein. Etwa 3 × 10 7 Würmer für Mikroteilchenbeschuß erforderlich. </li><li> Gefühlt JM109 E. coli ausgesät 10 cm NGM-Platten auf Eis. </li><li> Übertragen Sie die axenischen Würmer, zwei 50 ml konische Röhrchen zentrifugiert und die Würmer bei 800 g für 2 min. Aspiration des Überstands und Resuspendieren der Würmer in jedem Röhrchen in 50 ml M9-Puffer (Fig. 3-2). </li><li> Ermöglichen die erwachsenen Würmer durch die Schwerkraft für 10 bis 15 min auf Eis zu pelletieren. Hinweis: Die 2 ml Pellet sollte jetzt&gt; 90% erwachsenen Würmer. Diese 2 ml Pellet sollte etwa 5 x 10 &amp;sup6; Würmer und reicht für eine Mikropartikelbeschuss. </li><li> Bestreichen Sie die gesamte Oberfläche des Kühl JM109 ausgesät NGM Platte mit der 2 ml Pellet von Würmern. Lassen Sie die vollständig absorbiert werden Flüssigkeit verlassen dann die Plattefür 30 min auf Eis, bevor Sie fortfahren (Abbildung 3-3). </li></ol></li><li> Herstellung von Goldpartikeln <ol><li> Wiegen Sie 30 mg Goldpartikel in einem silikonisierten Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml 70% Ethanol und das Röhrchen vortexen für 5 min. </li><li> Ermöglichen die Röhre für 15 Minuten sitzen, dann Zentrifugieren bei 6.000 × g für 10 s, um die Goldpartikel zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze durch vorsichtiges Berühren der Spitze an der Seite der Röhre gegenüber den Goldpartikeln. </li><li> Waschen Sie die Goldpartikel mit 1 ml steriles Wasser, Wirbel für 1 min und kurz zentrifugieren bei 6.000 g für 10 Sekunden. Wiederholen der Waschschritt zweimal, dann Resuspendieren der Goldpartikel in 0,5 ml sterilem 50% Glycerin. Hinweis: Die Endkonzentration der Goldpartikel werden 60 mg / ml und es kann für 1 bis 2 Monate bei 4 ° C gelagert werden </li></ol></li><li> Bereiten Sie die DNA-Gold-Partikel-Mix <ol><li> Mähdrescher 10 &amp;mgr; g der gewünschten Plasmid-DNA mit 10 und# 956; g des unc-119 Rettungs Plasmid in einem silikonisierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In 50 ul DI-Wasser und 100 ul gut resuspendiert Goldpartikellösung dann Wirbel für 1 min. </li><li> In 150 ul 2,5 M CaCl 2 und verwirbeln die Lösung erneut für 1 min. Zu dieser Lösung wurden mit 60 ul 0,1 M Spermidin und Wirbel für 3 bis 5 min. </li><li> Pulszentrifugieren Lösung bei 6.000 g für 10 sec, den Überstand und 300 ul 70% Ethanol. Vortex gut für 1 min, Puls-Zentrifuge bei 6.000 xg, den Überstand und resuspendieren in 170 ul von 100% Ethanol. Kräftig vortexen die Lösung für 5 bis 10 min Puls dann Zentrifuge und den Überstand entfernen. </li></ol></li><li> Bombardierung (Abbildung 3-3) Hinweis: Dieses Protokoll wird mit der in der Tabelle der Materialien / Ausrüstung angegebene Partikelliefersystem durchgeführt. Folgen Sie den Anweisungen für die Partikelliefer Instrument zur Verfügung. <ol> &lt;li&gt; Legen Sie ein Blatt Seidenpapier in einen 15 cm Teller. Mit einer Pinzette, tauchen sieben Makrocarrier einzeln in 100% Ethanol und legen sie auf das Gewebe zu trocknen. </li><li> Gründlich biolistischer Kammer, Macrocarrier Halter und Zieltafel mit 70% Ethanol reinigen. Reinigen und Autoklavieren die Bildschirme vor jedem Anhalten Bombardement Verfahren. </li><li> Laden Sie die macrocarrriers in die Halterung mit einer Pinzette und drücken in die Halterung mit der Sitz Tool. </li><li> Gleichmäßig verteilt 20 ul der DNA-beschichteten Goldpartikel in der Mitte jedes Macrocarrier und die Lösung dann vollständig trocknen. </li><li> Reinigen Sie die beiden Teile des Druckteiler mit Ethanol und montieren mit Ethanol gereinigt Berstscheiben. Schrauben Sie die Druckteiler montiert und Berstscheiben in der Bombardierung Kammer. </li><li> Bauen Sie eine autoklaviert Anhalten Bildschirm mit der Macrocarrier Halter und legen Sie das Gerät auf den Metallboden erforderlich und einrasten. </li><li> Legen Sie die zusammengebauten macrocarrier Vorrichtung in den biolistischer Kammer in der vorgesehenen Schlitz unterhalb des Druckteiler und richten Sie mit der Druckteiler. </li><li> Kleben Sie die offenen NGM-Platte mit den Würmern auf der Zielplatte Regal und schließen Sie die Tür der Kammer. </li><li> Um Würmer zu bombardieren, den Druck auf, was benötigt, um die Berstscheiben brechen. Schalten Sie die Vakuum bis 28 Zoll Hg Druck, und drücken Sie den Feuerknopf, bis die Scheiben bersten. </li><li> Lassen Sie die Vakuum und entfernen Sie die NGM-Platte aus dem Gerät. Waschen Sie die Würmer von der Platte und verteilen in zwanzig 10 cm NGM-Platten mit JM109 E. ausgesät coli (Abbildung 3-4). </li><li> Ermöglichen die Würmer über 10 bis 14 Tage bei 25 ° C wachsen und verhungern die Platten. Worms aus dem unc-119 Defekt gerettet werden normale Bewegung haben und in dieser Zeit identifiziert werden. Wählen Sie mindestens 10 &quot;Wildtyp&quot; Würmer aus getrennten Platten für die weitere Analyse wie diese stellen unabhängigen transgenen Linien (FigurE 3-5). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, gibt es keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikt.

In diesem Protokoll präsentieren wir eine modifizierte axenischen flüssigen Medien, die für eine schnelle mCeHR C erlaubt elegans Generation mit der Produktion einer großen Anzahl von Würmern. Dieses Bild zeigt mehrere Vorteile, wie die Würmer ohne Kontamination E. gewachsen coli oder bakteriellen Nebenprodukten und in Ernährungs-und toxikologischen Untersuchungen genutzt werden. Die Verwendung von E. coli oder anderen Bakterien in solchen Studien hat mehrere Nachteile...

Der Boden Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus in zahlreichen Studien von der Genetik zur Toxikologie verwendet. Als Ergebnis der 1 mm Größe, Generationszeit von vier Tagen Kultivierung einfache schnelle und große Zahlen Nachkommen haben diese Nematoden in einer Reihe von pharmakologischen und genetischen Bildschirme 1, 2 verwendet wurden. Forscher nutzen diese Wurm-Moleküle und Signalwege in Wirbelsysteme erhalten zu identifizieren. Diese Wege sind Zelltod-Signale, Wege des Alterns und der Stoffwechsel und das Nervensystem 6.3. Zusätzlich wird die Transparenz der C elegans können für die Erzeugung von transgenen Linien mit fluoreszierenden Reporter-Proteins, die direkt sichtbar ist, um die Genexpression und Proteinlokalisation Muster analysieren. In vielen Studien auf einem festen Agar-basierte Oberfläche mit Nematoden Wachstumsmedium (NGM) Platten oder in l dieser Nematoden gezüchtetiquid Kulturen ausgesät mit Escherichia coli als Nahrungsquelle 7,8. Diese bakteriellen Nahrungsquellen können biochemischen und toxikologischen Studien mit Störungen von bakteriellen Nebenprodukten, die die Interpretation der Ergebnisse zu verwechseln. Um diese Effekte zu vermeiden Compoundierung, C. elegans kann in einer keimfreien flüssigen Medien, die frei von Bakterien als Nahrungsquelle kultiviert werden. Mit Hilfe dieser Medien, erfolgreich wir Millionen von hochsynchrone Würmer für viele Standard-C kultiviert elegans Protokolle wie Microarray-Analyse von differentiell regulierten Gene in C. elegans ausgesetzt, um verschiedene Häm-Konzentrationen und Herstellung von transgenen Würmer Verwendung von Gen-Bombardement. Dieses Medium ist chemisch definiert und von einem Original-Rezept von Dr. Eric Clegg 9 formuliert modifiziert. Mit dieser mCeHR Medien, haben wir erfolgreich Gene in Häm-Homöostase beteiligt identifiziert, die als Häm-responsive Gene (HRG n) 10, was wärewurden nicht in regulären Wachstumsbedingungen, die NGM-Agar-Platten mit E. ausgesät nutzen möglich coli. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zur Einführung und Beibehaltung C. elegans auf E. gewachsen coli auf die axenischen mCeHR und nutzen diese Methode, um eine große Anzahl von Würmern zur Herstellung von transgenen C zu erhalten elegans Linien mit Mikropartikelbeschuss. Außerdem präsentieren wir Studien, die den Nutzen der Verwendung axenischen Medien für die Bestimmung der Nährstoffbedarf von C. zeigen elegans mit Häm als Beispiel. Diese Studien zeigen, dass die Verwendung mCeHR Medien ermöglicht schnelle Wachstum von einer großen Anzahl von C elegans für viele Forscher von Wurm genutzt Downstream-Anwendungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">M-2393</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">S-4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium citrate.H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CuCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C455-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MnCl2.4H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">M87-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">Z-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C70-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5 -phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine 2 - and3&#160; -monophosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">U-6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymine&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T0376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">N-Acetylglucosamine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>A3286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-Alanine</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td>S25648&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">p-Aminobenzoic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B-4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cyanocobalamine (B-12)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">V-2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Folinate (Ca)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-0761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacinamide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantetheine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantothenate (Ca)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td>
			<td style="width:108px;">ACRCS</td>
			<td style="width:121px;">21663-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxal 5&#39;-phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-3657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxamine.2HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">Riboflavin 5-PO4(Na)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">R-7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Thiamine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-6,8-Thioctic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Choline di-acid citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">myo-Inositol</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-7520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">L-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">211065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Hemin chloride</td>
			<td style="width:108px;">Frontier Scientific</td>
			<td style="width:121px;">H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">HEPES, Na salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:108px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:121px;">F676-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11140-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalidixic acid sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>N4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td style="width:108px;">MP Biomedicals</td>
			<td>2194542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biolistic Delivery System</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>165-2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Gold particles (Au Powder)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">&#160;Ferro Electronic Material Systems</td>
			<td style="width:121px;">6420 2504, JZP01010KM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">or</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gold Particles 1.0 &#956;m</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>&#160;165-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

In diesem Protokoll stellen wir die benötigten Materialien und das Verfahren zur Herstellung von modifizierten C. E legans Gewöhnung und Wiedergabemedien (mCeHR). Darüber hinaus sind die Schritte zum Belichten Akklimatisierung und C. elegans auf E. gewachsen coli, um flüssige Medien axenischen beschrieben. Schließlich abwärts Experimente, die axenischen C nutzen elegans veranschaulichen die Vorteile dieses Verfahrens. Die Fähigkeit, zu analysieren und festzustellen, C. elegans Nährstoffbedarf wurde durch den Anbau von N2 Wildtyp-Würmer in axenischen flüssigen Medien mit unterschiedlichen Häm-Konzentrationen dargestellt. Dieses Verfahren kann mit anderen Nährstoffen repliziert werden, um die optimale Konzentration für Schnecken Wachstum und Entwicklung zu bestimmen, oder, um die toxikologischen Wirkungen von medizinischen Behandlungen zu bestimmen. Die Auswirkungen von verschiedenen Häm-Konzentrationen auf das Wachstum von Wildtyp-Würmer wurden durch qualitative mikroskopische Beobachtung und Quantifizierung von t bestimmter Anzahl der Würmer, die in jedem Häm-Konzentration wuchs. Zusätzlich kann die Wirkung von verschiedenen Nährstoffkonzentrationen durch Verwendung Würmer, Fluoreszenzsensoren, die auf Änderungen in den Nährstoff von Interesse reagieren auszudrücken getestet werden. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von Würmern leicht zur Erzeugung von transgenen C. elegans mittels Mikropartikelbeschuss erzeugt.

Kultivierung C. elegans in flüssigem Medium axenic Hilfsmittel bei der Bestimmung von Nährstoffen, die von Würmern erforderlich sind, ohne Störung durch von E. sekundäre Stoffwechselprodukte coli. Wildtyp N2 Würmer zu akklimatisieren mCeHR Medien innerhalb von drei Generationen und zeigen Wachstum vergleichbar Würmer auf NGM Bakterienplatten gewachsen. In der Tat, diese Würmer geworden schwangeren innerhalb von 4 Tagen im Vergleich zu 3,5 Tage für Würmer auf OP50 Bakterien gewachsen....

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Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans ist in der Regel auf festen Agarplatten oder in Flüssigkulturen ausgesät mit E. coli. Um bakterielle Nebenprodukte aus Verwechslung toxikologischen und Ernährungsstudien zu verhindern, verwendeten wir eine axenischen flüssigen Medium, CEHR, um für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen wachsen und synchronisieren Sie eine große Anzahl von Würmern.

Die Züchtung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K Aufrufe.  University of Maryland.  C. elegans ist in der Regel auf festen Agarplatten oder in Flüssigkulturen ausgesät mit E. coli. Um bakterielle Nebenprodukte aus Verwechslung toxikologischen und Ernährungsstudien zu verhindern, verwendeten wir eine axenischen flüssigen Medium, CEHR, um für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen wachsen und synchronisieren Sie eine große Anzahl von Würmern. 

Serie: Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Forschung

Biologie

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Die Züchtung

Zusammenfassung

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