Este trabalho foi apoiado em parte pelas Bolsas de Investigação Scholar (116403-RSG-09-082-01-MGO) da American Cancer Society e fundos intramurais de Wake Forest University Health Sciences para GS. DBS foi apoiado pelo NCI treinamento concessão 5T32CA079448.

1. Geração de Construções shRNA <ol><li> Identificar uma seqüência de siRNA-alvo (20-23 nucleotídeos) com base em critérios previamente publicados, 6 ou usar um servidor de algoritmo baseado na web, como o &quot;Finder alvo siRNA&quot; de Ambion e GenScript. </li><li> Sintetizar oligonucleótidos com base no desenho da Figura 1 e exemplo sequências na Tabela 1. Efectuar a amplificação por PCR usando o P1 e P2 oligonucleótidos (30 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 seg, anelamento a 60 ° C durante 30 seg, e alongamento a 72 ° C durante 30 seg) e um plasmídeo portador do U6 ou H1 promotor como um modelo. Purifica-se o produto de PCR utilizando uma coluna de purificação de PCR. Digerir por BamHI e HindIII e purificar o ADN digerido usando uma coluna de purificação de PCR. Recozer o P3 e P4 oligonucleótidos (2,5 pmol / uL de cada uma em 100 uL de 50 mM de Tris • HCl, pH 8,0) por ebulição durante 5 min e arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. Digerir um vec lentiviralTor, tal como o descrito na Figura 2A, por BamHI e EcoRI, e executar gel purificação. </li><li> Efectuar uma ligação de 3-fragmento com o BamHI / EcoRI-vector digerido, uma BamHI / HindIII digerido com fragmento de PCR e um par de oligonucleótidos hibridados (formando HindIII e locais EcoRI nas duas extremidades) a uma razão molar 1:10:10 (Figura 1). </li><li> Transforme altamente eficiente E. competente células de Escherichia DH5a utilizando o produto ligado. Rastreio das colónias, usando os oligonucleótidos P5 (no vector) e P6 (no promotor H1 ou U6). 7 </li><li> Preparar DNA de plasmídeo a partir das colónias positivas com um kit comercial e confirmar a presença da inserção por BamHI / EcoRI e electroforese digestão de DNA de agarose. Região a sequência contendo o promotor e shRNA usando P5 oligonucleótido. </li><li> Use plasmídeo de DNA ou Midi-Maxi preparação de kits (-endotoxina livre é preferido) para preparar o DNA lentivírus carregando a expressão shRNAcassete. Determinar a concentração de DNA medindo a absorção a 260 nm. Verificar a pureza de ADN, utilizando o rácio 260 nm nm/280 e certificar-se que cai no intervalo de 1,8 a 2,0. Verifique a integridade lentivírus plasmídeo usando eletroforese em gel de agarose. ADN para transfecção deve ser super-enrolada. </li></ol> 2. Transfection Lentivirus Precauções: lentivirais são derivadas do vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) do genoma e replicação incompetente. Eles têm sido amplamente utilizados na entrega de genes, devido à capacidade de infectar tanto dividindo e não-células em divisão. No entanto, dois grandes riscos existem nos estudos utilizando lentivírus. (1) O potencial de geração de replicação competente lentivírus. Este risco pode ser muito reduzido se o sistema de geração de terceira lentiviral é usado. (2) O potencial para oncogênese. Este risco pode ser agravado se as inserções realizadas são oncogênicos ou reprimir supressores de tumor.As actividades de investigação envolvidos em HIV baseada lentivírus deve seguir as &quot;considerações de Biossegurança para Pesquisa com lentivirais&quot; do NIH ( <a href="http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html</a> ) e exigem uma aprovação do Comitê de Biossegurança de instituição de um investigador. Geralmente, reforçada Biossegurança nível-2 (BSL-2) de contenção é necessária para o ambiente de laboratório se lentivirais são utilizados. <ol><li> Placa de 4 × 10 6 HEK 293T células com DMEM completo (DMEM fornecido com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina), em 10 pratos de cultura durante a noite cm e a 37 ° C em um 5% de CO 2 incubadora. Substituir o meio com 5 ml de pré-aquecida Opti-MEM I reduzido Soro Media (Invitrogen). </li><li> Preparar Solução A: 10 ug de shRNA contendo vector lentiviral, 5 ug cada um dos Gener terceiroation plasmídeos lentivírus de embalagem (preparado com elevado grau de pureza; os três plasmídeos de empacotamento incluem VSV-G: para uma proteína de envelope, pRSV-Rev: para rev, e pMDLg / pRRE: para gag / pol, que são essenciais para a embalagem lentivírus), 36 ul de 2M de CaCl2, e 300 uL de água estéril. </li><li> Preparar Solução B: 300 uL de 2 × Hepes salino tamponado (281 mM de NaCl, 100 mM de HEPES, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, pH ajustado para 7,12 por NaOH 0,5 N e esterilizado por filtro de 0,22 um). </li><li> Cair lentamente a solução A na solução B enquanto borbulhar ar através da solução B com uma pipeta. Deixar o tubo à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lentamente deixar cair as soluções mistas A / B para o prato de cultura de células HEK 293T, preparado no passo 2,1 e incubar a 37 ° C em um 5% de CO 2 incubadora para 4-6 h. </li><li> Substituir o meio com 7 ml de meio DMEM completo. Após 24 h, adicionar uma 5 ml adicionais de meio DMEM completo. Colha o cont médioaining do lentivírus após a outra 24 h de cultura. </li><li> Girar o meio a 1.500 rpm, temperatura ambiente durante 10 min. Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de 0,45 uM e girar o fluxo através meio contendo o lentivírus por ultracentrifugação a 25.000 rpm (igual a 125.000 x g com um rotor SW28 balde oscilante, ultracentrífuga Beckman XL-90), 4 ° C durante 90 min. Decantar o sobrenadante para um recipiente com lixívia a 5% (concentração final). </li><li> Ressuspender o sedimento em lentivírus 0,5-1,0 ml de PBS frio e fazer alíquotas lentivírus em 50-100 ul por tubo. Armazená-los a -80 ° C. </li><li> O título do lentivírus pode ser determinada por kits comerciais (tais como QuickTiter Kit Quantificação Lentivirus a partir de células Biolabs, Inc.), por uma PCR em tempo real protocolo 8, ou por determinação do marcador co-expressa fluorescente utilizando microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo . Normalmente, um prato de cultura 10 centímetros, pode produzir cerca de 0,5-1,0 × 10 8 infecçãounidades infecciosas (IU). </li></ol> 3. Infecção e Caracterização de células infectadas <ol><li> De sementes as células a serem infectadas em 2 ml de meio completo em uma placa de 6 poços com confluência de 30-40% (cerca de 5-8 x 10 5 células, dependendo tamanhos de células). Cultura das células durante a noite a 37 ° C em um 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Substituir o meio com 1 ml de meio fresco contendo 8 ug / ml de polibreno (Sigma, Cat # H9268) ou 5 ug / ml de protamina (Sigma, Cat # P4020). </li><li> Determinar uma multiplicidade adequada de infecção (MOI) Gama de 9 para uma linha de células particular usando lentivírus com marcador fluorescente. Calcular ou determinar empiricamente a quantidade de lentivírus a ser utilizado para infectar a linha celular. Lentamente solte o lentivírus na placa e agite-o levemente para 10 seg. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C em um 5% de CO 2 incubadora durante 6 horas e depois substituir o meio com meio completo normal. </li><li> Pelo menos duas days após a infecção, verificar as células por microscopia de fluorescência para lentivírus que expressam marcadores fluorescentes e / ou adicionar o antibiótico correspondente ao meio para lentivirais que expressam os genes de resistência a antibióticos. Para um vector indutível, tal como um Tet-On sistema (Figura 2) cultura, as células em meio preparado com tetraciclina livre de FBS. Dividir as células 2-3 dias após a infecção. Retirar uma porção das células para testar knockdown gene induzível por cultura em meio de lhes fornecido com e sem 1,5 ug / ml doxiciclina (DOX) para igual ou superior a 2 dias. </li><li> Verifique o knockdown do gene por Western blot, PCR em Tempo Real ou imunomarcação ≥ 2 dias após a infecção, 2 dias após a seleção de antibióticos, ou (para um sistema induzível Tet-On) igual ou superior a 2 dias após a adição Dox. </li><li> Utilizar abordagens diferentes (tais como ensaios de proliferação celular, estudos de cultura de agar mole, ensaios de migração, ensaios de invasão e estudos formação de tumor) para determinar os efeitos do gene alvo knockdown sobre a malignidade das células. </li></ol> 4. Estudo de Modelo xenoenxerto Rato <ol><li> Limpe todas as superfícies de estetização do mouse e injeção de etanol a 70% para prevenir a infecção de camundongos. Anestesiar ratinhos nus atímicos (NCI-Frederick) usando 2% de isoflurano misturado com oxigénio em uma câmara de indução de anestesia 10 min antes da inoculação das células. Manter a anestesia com isoflurano a 1% misturado com oxigénio através de um cone de nariz. Realizar esta etapa em uma sala com excelente ventilação e anexar filtros de catadores isoflurano para a câmara de indução. </li><li> Propagar as células que carregam shRNAs. Use tetraciclina meio livre para Tet-On vetores induzíveis. Trypsinize as células e ressuspender-los em meio completo contendo 50% de Matrigel. Posicionar os ratinhos nus sobre uma almofada de aquecimento (30 ° C) e injectar 200 uL das células (1-10 × 10 6, dependendo da malignidade das células) para os ratinhos com 1-2 locais de injecção por rato. Usar seringas com 25.5-gauge agulhas para injecções subcutâneas, e agulhas de calibre 28-30 para injeções ortotópico. </li><li> Para vectores constitutivos Lentivirus, utilizar 2 grupos de ratinhos injectados com as células que expressam o gene alvo e uma shRNA shRNA mexidos. Para Tet-On vectores Lentivirus indutíveis, utilizam 4 grupos de ratinhos injectados com células que transportam o gene alvo e uma shRNA shRNA mexidos, fornecido com água normal e Dox (1,5 mg / ml) contendo água (2 × 2 shRNAs tratamentos = 4 grupos) . Substitua a água Dox contendo duas vezes por semana. </li><li> Monitorar o comprimento e largura dos tumores semanais ou quinzenais por um vernier paquímetro digital e calcular os volumes tumorais (V) por fórmula V = 1/2 (comprimento x largura 2) 10. Assegure-se que o volume do tumor não exceda as orientações do ACUC institucional (tais como, 10% do peso do corpo). Euthanize qualquer rato usando um protocolo aprovado pelo ACUC institucional se mostra qualquer sinal de ulceração ou necrose extensa, Infectio óbvion, sangramento descontrolado ou em estágio final da doença. </li><li> O crescimento tumoral e metástases podem ser monitorizados para as células tumorais que expressam inoculados um marcador bioluminescente 11, tal como luciferase de pirilampo. Limpe todas as superfícies de estetização do mouse e imagem por etanol 70% para prevenir a infecção de camundongos. Anestesiar os ratos tal como descrito no passo 4.1. Injectar luciferina (150 mg / kg) por via intraperitoneal. Colocar os ratos em uma câmara de imagem desinfectados de um sistema de imagem comercial, tal como um sistema de imagem IVIS (Caliper Life Sciences, Inc.). Ligue o alavanca anestesia para manter a anestesia por 1% de isoflurano misturado com oxigénio. Realizar este passo em uma sala com excelente ventilação. </li><li> Tome a primeira imagem, expondo 5 min e verificar a intensidade do sinal. Ajustar o tempo de exposição para obtenção de imagens com o sinal óptima contra fundo. Determinar o tempo de imagiologia empiricamente, que é geralmente 1-5 min para os tumores subcutâneos. </li><li> Euthanize os ratos por um protocolo aprovadopelo ACUC institucional quando os tamanhos dos tumores atingem cerca de 1.000 mm 3, ou conforme especificado nas orientações ACUC. Ressecção de tumores do xenoenxerto, pesá-los e tirar fotos. Processar as amostras tumorais para estudos diferentes, tais como as análises patológicas para determinar a morfologia das células do tumor, e por Western Blot e estudos PCR em tempo real para testar a expressão do gene. </li></ol> 5. Os resultados representativos Este protocolo foi utilizado para estudar os efeitos de YY1 knockdown sobre a formação de tumor xenoenxerto de que expressam a luciferase do pirilampo-MDA-MB-231 células (células de adenocarcinoma de mama humano; Caliper Life Sciences) em ratinhos nus atímicos. A sequência alvo shRNA de YY1 humano é &quot;GGG AGA AGC AGC AGG TGC AGA T&quot;. Uma seqüência embaralhada &quot;GGG ACT ACT CTA ATT CGT CAT T&quot; também foi criado para um controle (cont) shRNA, que não tem similaridade significativa para qualquer transcrição conhecido. Os oligonucleótidos usados ​​para fazer Tet-On construções Lentivirus indutíveis, com YY1 como um exemplo, São apresentados na Tabela 1. Como resultado, dois lentivirais e PLU-Puro-Indu-YY1 Lentivirus e PLU-Puro-Indu-cont shRNA, foram construídos e eles foram usados ​​para produzir lentivírus. Utilizou-se estes lentivírus para infectar individualmente dois clones MDA-MB-231 de células (clones 1 e 3) que expressam tanto regulador tetraciclina (tetR) e luciferase do pirilampo. Populações de células policlonais foram obtidos após a selecção de puromicina. 3A Figura mostra Dox induzida knockdown YY1 nestes MDA-MB-231 células infectadas por lentivírus shRNA PLU-Puro-Indu-YY1. Utilizou-se as células do clone 3 policlonais infectadas individualmente por estes induzível YY1 shRNA e lentivírus cont Lentivirus e observaram que a depleção YY1 reduzida invasividade de MDA-MB-231 células (Figura 3B). As análises de Western blot confirmou Dox induzida silenciamento YY1 em MDA-MB-231 células com o shRNA indu-YY1, enquanto que as células que contêm indu-cont shRNA não mostraram este efeito (Figura 3C). Em seguida, utilizado<html> estas células para o estudo do rato modelo xenoenxerto. Em comparação com os grupos de controlo, os ratinhos implantados pelas células MDA-MB-231 com indu-YY1 shRNA e fornecido com Dox contendo água mostrou reduzida formação de tumores, quando visualizada por bioluminescência (Figura 4A) e determinado por pesos tumorais (Figura 4B ). YY1 silenciamento nestes tumores xenograft foi confirmada por estudos de Western blot mostrados na Figura 4C. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático para a geração de um construto shRNA e transcrição shRNA. O P1 iniciadores para P6 são mostradas (ver Tabela 1 para sequências, por exemplo). Pol III: RNA polimerase III (d):. Final digerido. O desenho não está em escala. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4129/4129fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . 2 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg / &quot;/&gt; Figura 2. Diagramas esquemáticos de (A) um vector lentiviral e (B) o mecanismo do Tet-On promotor indutível H1 utilizado para silenciamento do gene. O vector lentiviral foi reconstruída com base em pLL3.7 14. H1-Pr: H1 promotor; Ubc-Pr: Human promotor da ubiquitina C; Puro: puromicina; TRE: Tetraciclina elemento sensível; Dox: doxiciclina. TetR: regulador de tetraciclina. 5&#39;LTR, 3&#39;SIN-LTR e WRE são componentes essenciais de um vetor de 14 lentiviral. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig3.jpg" /> Figura 3. Dox induzida silenciamento YY1 e seu efeito sobre a capacidade de invasão de MDA-MB-231 células. A. YY1 níveis em duas populações de células policlonais derivados de tetR-expressando os clones 1 e 3 infectados por lentivírus shRNA PLU-Puro-Indu-YY1 e cultivadas na ausência e na presença de Dox. B. Boyden ensaio câmara de MDA-MB-231 células com shRNAs induzíveis. (* P &lt;00,05 versus outros três grupos). C. Representante Western blot de YY1 expressão nestes quatro populações de células. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig4.jpg" /> Figura 4. Efeitos de silenciamento YY1 induzida sobre a formação de tumor xenoenxerto pelo MDA-MB-231 células. A. Diagrama esquemático de implante de células (esquerda) e imagens representativas bioluminescentes capturadas pelo sistema de imagem IVIS menos 4 semanas (à direita) inoculação de células post. B. xenoenxerto pesos tumorais menos 4 semanas. * P ≤ 0,05. C. ocidentais blots de YY1 e β-actina de expressão em xenoenxertos de MDA-MB-231 células com indu-YY1 shRNA na ausência e na presença de DOX. Etiquetas na parte superior são os nomes dos ratos individuais. <table border="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotídeos </td><td> Seqüência (5 &#39;- 3&#39;) </td><td> Uso e localização </td></tr><tr><td> P1 (Tet-On H1) </td><td> cagt GGATCC CGA ACG CTG TCA TCA ACC ACG C </td><td> PCR; em 5&#39;-fim do promotor H1 </td></tr><tr><td> P1 (U6) </td><td> cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG </td><td> PCR; em 5&#39;-fim do promotor U6 </td></tr><tr><td> P2 (para YY1 com Tet-On H1) </td><td> CAGC AAGCTT GAA atc tgc tgc acc ttc tgc tcc c GGG ATC TCT ATC GAT AGG ACT GAA C </td><td> PCR; em 3&#39;-fim do promotor H1 Tet-On induzível </td></tr><tr><td> P2 (por YY1 com U6) </td><td> CAGC AAGCTT GAA atc tgc tgc acc ttc tgc tcc c aaa caa GGC ttt tct cca agg gat um </td><td> PCR; em 3&#39;-fim do promotor U6 </td></tr><tr><td> P3 (por YY1) </td><td> agc tt atc tgc tgc acc ttc tgc tcc c ttttt g </td><td> Para ser recozido com P4 </td></tr><tr><td> P4 (por YY1) </td><td> aattc aaaaa <strong&gt; ggg agc agc aga aga ta agg tgc </td><td> Para ser recozido com P3 </td></tr><tr><td> P5 (por pLL3.7) </td><td> ggg ggg tac AGT ACG gaa aga ata g </td><td> Para o rastreio de PCR, utilizado com P6 </td></tr><tr><td> P6 (para Tet-On H1) </td><td> GAT TTC GAA CCA CAC ATA GCG AC </td><td> Para a PCR de triagem, utilizado com P5 </td></tr><tr><td> P6 (por U6) </td><td> AGG AGT GTG TTG TGC TTC CTT TG </td><td> Para a PCR de triagem, utilizado com P5 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Oligonucleotídeos sintetizados usados ​​na geração de construções de shRNA. P1 e P6 seqüências para o U6 mouse e Tet-On induzíveis promotores H1 humanos são fornecidos. YY1 humano é usado como um exemplo, com uma sequência alvo de shRNA GGG ACG AGA AGC AGG TGC AGA T. As sequências específicas para YY1 são realçados. Duas sequências de P2 do YY1 são concebidos para os dois promotores, respectivamente. O U6 constitutivo / YY1 shRNA foi descrito anteriormente 15, enquanto que o Tet-On H1/YY1 foi utilizado neste protocolo. P5 é vetor específico e da seqüência de pLL3.7 14 é mostrado. As sequências de enzimas de restrição estão sublinhados, enquanto que as sequências de recozimento para os promotores durante a amplificação por PCR estão em itálico.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve um método para derrubar um gene usando shRNA e visualizar o seu efeito biológico utilizando imagiologia bioluminescente de crescimento de células tumorais in vivo. O local de destino de um shRNA não deve conter qualquer um dos três locais de restrição (BamHI, HindIII e EcoRI) utilizado para subclonagem. Num cenário raro quando qualquer destes sítios está presente, uma enzima de restrição adicional pode ser utilizada para a substituir na geração do construto. <p class="j...

Além do equipamento de laboratório comum utilizado para análises de RNA e de proteínas e cultura de células, os seguintes materiais e reagentes necessários para este protocolo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td></tr><tr><td> Biossegurança Gabinete adequado para contenção de Biossegurança Nível 2 </td></tr><tr><td> PCR termociclador </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga </td></tr><tr><td> Indução anestésica-câmara com catadores isoflurano </td></tr><tr><td> Paquímetro Digital </td></tr><tr><td> IVIS Imaging System </td></tr><tr><td> Altamente competentes DH5a E. coli </td></tr><tr><td> As enzimas de restrição EcoRI, BamHI, e HindIII </td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td></tr><tr><td> Terceira geração lentivírus plasmídeos embalagem VSV-G, pRSV-Rev e pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Lista de Materiais

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA de interferência (RNAi) inibe a expressão de genes por mRNAs alvo especificamente degradantes. Desde a descoberta da dupla hélice pequeno RNA de interferência (siRNA) no gene silenciamento 1, RNAi se tornou uma poderosa ferramenta de pesquisa em estudos da função gênica. Comparado com deleção genética, RNAi mediada silenciamento do gene possui muitas vantagens, tais como a facilidade com que é realizado e à sua adequação para a maioria das linhas celulares. Vários estudos têm demonstrado as aplicações da tecnologia de RNAi na pesquisa do câncer. Em particular, o desenvolvimento da tecnologia de ADN recombinante baseado em vectores para produzir pequena hairpin RNA (shRNA) dirigido pelo promotor de U6 ou H1 fez a longo prazo e gene induzível silenciamento 2,3 possível. A sua utilização em combinação com geneticamente modificadas vectores virais, tais como lentivírus, facilita altas eficiências de shRNA entrega e / ou a integração no DNA genómico de expressão shRNA estável. Nós descrevemos um pormenorizada sobred procedimento usando o DNA vector baseado em tecnologia de RNAi para determinar a função do gene, incluindo a construção de vectores que expressam lentivirais shRNA, a produção de lentivírus e infecção de células, e estudos funcionais usando um modelo de xenoenxerto de rato. Várias estratégias têm sido relatados na geração de construções de Lentivirus. O protocolo descrito aqui empregando amplificação por PCR e uma ligação de 3-fragmento pode ser usado para gerar directamente e eficientemente shRNA contendo construções de lentivirais sem deixar qualquer adjacente adicional de nucleótidos, a uma sequência de codificação shRNA. Uma vez que os cassetes de expressão shRNA criados por esta estratégia pode ser cortado por enzimas de restrição, eles podem ser facilmente transferido para outros vetores com diferentes marcadores fluorescentes ou antibiótico. Reagentes de transfecção mais comerciais podem ser utilizados na produção de lentivírus. No entanto, neste relatório, nós fornecemos um método econômico utilizando precipitação de fosfato de cálcio que pode atingir mais eficiência de transfecção de 90% emAs células 293T. Comparado com vectores de expressão constitutiva de Lentivirus, um sistema de shRNA indutível é particularmente adequado para derrubando um gene essencial para a proliferação celular. Nós demonstramos o silenciamento do gene de Yin Yang 1 (YY1), um oncogene potencial no câncer de mama 4,5, por um Tet-On sistema induzível shRNA e seus efeitos sobre a formação de tumores. A pesquisa com lentivírus requer revisão e aprovação de um protocolo de biossegurança pelo Comitê de Biossegurança da instituição de um investigador. Pesquisas usando modelos animais requer revisão e aprovação de um protocolo animal pelo Animal Care e do Comitê de Uso (ACUC) de instituição de um investigador.

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DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA de interferência (RNAi) possui muitas vantagens sobre knockout do gene e tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta em estudos de genes funcionais. A invenção da tecnologia de RNAi DNA vector baseado fez a longo prazo e knockdown induzível gene possível, e também aumentou a viabilidade de silenciamento do gene<em&gt; In vivo</em&gt;.

DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K visualizações.  Wake Forest University School of Medicine. RNA de interferência (RNAi) possui muitas vantagens sobre knockout do gene e tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta em estudos de genes funcionais. A invenção da tecnologia de RNAi DNA vector baseado fez a longo prazo e knockdown induzível gene possível, e também aumentou a viabilidade de silenciamento do gene In vivo.

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In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

Em função Assay Canine Muscle Vivo

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
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Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Não invasiva Intratraqueal intubação para estudar a Patologia e Fisiologia do Rato Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Usando Saccadometry com Estimulação Cerebral Profunda para estudar normal e patológico função cerebral

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...