Diese Arbeit wurde von Pilot-und Machbarkeitsstudie Zuschuss von UCLA-CURE Center, der Morbus Crohn und Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) und National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) Mittel zur Hon Wai Koon finanziert. Knochenmark Bestrahlung Operation wurde von Bernard Levin und Scott Kitchen of UCLA Center for AIDS Research Maus / Human Chimera Core-Anlage unterstützt. Durchflusszytometrie Operation wurde von UCLA Vector Core-Anlage unterstützt.

Ein. Before-you-Start Technische Überlegungen <ol><li> Wir empfehlen die Verwendung sowohl C57/BL6 Wildtyp-Mäusen und-Knockout-Mäusen für das Experiment, weil Mäuse mit entsprechenden CD-Moleküle von den großen Maus-Anbieter erworben werden kann. </li><li> Da es schwierig ist, die Wildtyp-Mäusen und Knockout-Mäusen gewonnen Spenderzellen nach Knochenmarktransplantation zu verfolgen, ist es notwendig, CD45.1 Mäuse verwenden, um Wildtyp-Mäusen darstellen. (CD45.1 C57/SJL WT Mäusen Jackson Laboratories stock # 002014). </li><li> Die meisten Mauskolonien sind CD45.2. Unsere Knockout-Mäuse gehören CD45.2 Genotyp (alternativ ein CD45.2 WT Mäusen Quelle: Jackson Laboratories stock # 000664). Die Bestimmung der CD45.1 oder CD45.2 Genotyp kann mit Durchflusszytometrie von Knochenmark und peripheren Blut, wie in Abschnitt 7 in diesem Protokoll erwähnt werden. </li><li> Mäuse nach der Bestrahlung wurden Immunität beeinträchtigt. Halten Mäuse in pathogenfreien Einrichtung. </li><li> Betrieb der Strahler erfordert besondere Sicherheit clearance und Ausbildung. Um Zeit im Training und Genehmigungsprozesse zu sparen, ist es am besten mit einem Labor mit qualifizierten Techniker in der Lage, um die Strahler bedienen ist zusammenzuarbeiten. </li><li> Viele Institutionen haben Durchflusszytometrie Labors mit erfahrenen Technikern. Um Probleme mit der Durchflusszytometrie zu minimieren, ist es besser, Ihre Durchflusszytometrie Experiment Plan mit dem erfahrenen Techniker besprechen, bevor Sie beginnen. </li><li> Mäuse wurden auf diese Weise (10 Mäuse pro Gruppe) zugeordnet: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Gruppe </td><td></td><td> Knochenmark Spender zum Empfänger </td><td> Behandlung </td></tr><tr><td> A </td><td> BM Austausch </td><td> CD45.1 WT CD45.2 KO </td><td> DSS Kolitis </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> Wasser normalen Kontrolle </td></tr><tr><td> C </td><td> BM Austausch </td><td> CD45.2 KO CD45.1 WT </td><td> DSS ulcerosa </td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td> Wasser normalen Kontrolle </td></tr><tr><td> E </td><td> Schein </td><td> CD45.1 WT CD45.1 WT </td><td> DSS Kolitis </td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td> Wasser normalen Kontrolle </td></tr><tr><td> G </td><td> Schein </td><td> CD45.2 KO CD45.2 KO </td><td> DSS Kolitis </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> Wasser normalen Kontrolle </td></tr></tbody></table> * Eine kurze Darstellung Versuchsprotokoll ist in Abbildung 1 gezeigt. 2. Empfängermäuse Bestrahlung <ol><li> Mäuse gezüchtet und gehalten Erreger-einrichtung. Ort Mäuse in autoklavierten Bestrahlung pie mit Filter. Legen Sie eine Maus in jedem Steckplatz der Bestrahlung pie. Setzen Sie den Kuchen in den Strahler und vergewissern Sie sich die Drehscheibe und Kuchen drehen. </li><li> Schalten Sie die Luftpumpefür die Belüftung. Schließen Sie den Strahler Tür und verriegeln Sie ihn. </li><li> Bestrahlen der Mäuse mit 1000 rad (was äquivalent zu 10 Gy) etwa 10 min (je nach Strahlungsquelle und Halbwertszeit). Von diesem Zeitpunkt sind die bestrahlten Mäusen immunschwache und schwach Immunität gegen Infektion. Nach der Bestrahlung, nehmen Sie den Kuchen aus und legen Sie in einem sterilen Behälter für den Transport zum Biosicherheitswerkbank in Tierhaltung. Vermeiden Sie es, die Mäuse zu externen Umfeld Wahrscheinlichkeit einer Infektion zu minimieren. </li><li> In Biosicherheitswerkbank, übertragen Sie die Mäuse in autoklavierten Mäusekäfige mit autoklaviertem Betten (4 Mäuse pro Käfig Neuen steriles Wasser mit sulfatrim Federung -. 3,12 ml pro 100 ml Wasser). </li><li> Wickeln Sie die Wasserflasche mit Aluminiumfolie als die Antibiotika lichtempfindlich sind. Schütteln Sie die sulfatrim Flasche mit gut mischen, bevor Sie ihn in den Käfig. </li></ol> 3. Spender-Knochenmark Extraction <ol><li> Opfern Mäusen mit Kohlendioxid oder isoflurANCE und dann eintauchen in 1:200 Lysol Lösung. Sprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol, um die Haut befeuchten und zu sezieren offenen Knochen. </li><li> Weichen Sie die Dissektion Instrumente in 70% Ethanol für die Sterilisation. </li><li> Führen Sie die Dissektion in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Verwenden Sie die sterile Präparation Instrumente, um die Humerus, Femur, Tibia und Fibula Knochen, frei von Befestigung Muskeln und Bänder aussetzen. </li><li> Schneiden Sie beide Enden der Knochen, die rote Knochenmark zeigen. Halten die Knochen mit einer Pinzette. Spülen Sie das rote Knochenmark mit kaltem PBS mit 3 ml Spritze und 25G Nadeln in eine Petrischale. Spülen von beiden Enden der Knochen mehr Knochenmarkszellen ergeben. </li><li> Verwenden Sie 6 ml Spritzen und 18G1 / 2 Nadeln rotes Knochenmark Stecker durch wiederholtes Aufsaugen und brechen. Übertragen Knochenmark mit 50 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Drehen Sie das Knochenmark in 1.800 rpm für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, Pellet resuspendieren durch Vortexen für 5-10 sec. </li><li> Verdünnte 10X RBC Lysepuffer mit sterilem Wasser. Anzeiged 1X RBC-Lyse-Puffer (5 ml pro Donor-Maus), Wirbel wieder für 5 sec und halten genau 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 3 min, füllen Sie die Röhrchen mit 20 ml kaltem PBS, um die Lyse und mischen zu stoppen. Gießen Sie den Inhalt durch ein 40 um Zellsieb direkt in ein neues 50 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Spülen Sie die Original-Röhren mit 5 ml PBS und Transfer zum Zellsieb als gut. Anfang bis zu 50 ml mit PBS und mischen. </li></ol> 4. Zählen Bone Marrow Donor Cells <ol><li> Fügen Sie 100 ul Trypanblau in ein Eppendorf-Röhrchen und 100 ul des Knochenmarks Suspension auf einem Eppendorf-Röhrchen und mischen. Pipettieren Sie die gefärbte Zelle Mischung auf eine Zählkammer. </li><li> Die Menge der Zellen wird durch Gesamtwohnfläche Knochenmark Zellzahl im Falconröhrchen = ungefärbten Zellzahl in 16 Quadrate x 2 (aufgrund Trypanblau Verdünnung) x 10.000 x 50 ml berechnet </li><li> Abzentrifugieren der Knochenmarkzellen in 50 ml Falcon-Röhrchen bei 2.000 UpM für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Basierendauf die gesamten Zellzahlen, das Pellet mit PBS auf 1 x 10 8 Zellen pro ml </li></ol> 5. Infusion Empfängermäuse <ol><li> Wärmen Sie die Empfänger-Mäuse auf einem Heizkissen und unter einer Wärmelampe. Legen Sie die Empfänger-Mäuse in restrainer. Jeweils 1 x 10 7 Zellen pro Maus in 100-200 ul intravenös. </li><li> Die Injektion von Spender-Knochenmark muss zwischen 4-24 Stunden nach der Bestrahlung durchgeführt werden. </li><li> Halten Sie sich auf 4 injizierten Mäusen pro Käfig. Pflegen Sie die injiziert Empfängermäuse in autoklavierten Käfige mit Antibiotika behandelte Wasser für die ersten 4 Wochen in pathogenfreien Tierhaltung und ließ die Mäuse wieder Immunität. Veränderung Käfigen, Antibiotika-behandelten Wasser und Nahrung alle 4 Tage auf Hygiene zu halten. </li></ol> 6. Induktion von Colitis und Evaluierung von Colitis <ol><li> 4 Wochen nach der Bestrahlung und Knochenmarktransplantation, regelmäßig Wasser zu wechseln, ohne Antibiotika und halten die Mäuse für weitere 2 Wochen zu ihrer normalen zurückgewinnenDarmflora. </li><li> 6 Wochen nach der Knochenmark-Injektion zu messen ursprünglichen Körpergewichts. Einige Mäuse sind 5% Dextransulfat im Trinkwasser ad libitum zu Colitis induziert gegeben. Einige Mäuse werden regelmäßig Trinkwasser nur als normale Kontrollgruppe gegeben. </li><li> 5 Tage später, zurückzutreten peripheren Blut, Transfer zum Heparin-beschichteten Röhrchen (Vacutainer) und halten im Eis. Pool das Blut aus 4 Mäusen 1 Tube. Kombinieren Sie 300 ul Blut mit 300 ul Zellfärbung buffer = 600 ul. Teilen Sie das Blut bis 5 Eppendorf-Röhrchen mit jeweils 100 ul. </li><li> Opfern die Mäuse mit Kohlendioxid oder Isofluran. Bewerten makroskopischen Schäden Noten (siehe anderen JOVE Video Veröffentlichung für Details 1). Messen Veränderung des Körpergewichts. Measure Darm Länge und Dicke mit digitalen Messschieber. Beachten Hocker Textur (hart, weich oder blutig). Bestimmen Sie auf okkultes Blut im Stuhl mit Hemooccult. Dissect Doppelpunkt Gewebe und fixieren Formalin für H &amp; E-Färbung. </li><li> Dissect 1 Femur bone pro Maus, extrahieren Knochenmark und spülen das Knochenmark mit kaltem PBS über 25G Nadel und 1 ml Spritze. Pool 4 Knochenmark-Stecker an ein Rohr und halten im Eis. </li><li> Gießen Sie das Knochenmark zur Petrischale, Scher das Knochenmark Stecker mit 18G Nadel und 5 ml Spritze mehrmals, bis kein Knochenmark-Stecker vorhanden ist. </li><li> Spin down mit 1.500 rpm für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren mit 600 ul Zellfärbung Puffer. Teilen Sie die resuspendierten Knochenmark 5 Eppendorf-Röhrchen mit jeweils 100 ul. </li></ol> 7. Quality Inspection of Bone Marrow Transplantation mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Beschriften Sie jedes Probenröhrchen von Blut oder Knochenmark # 1-5: </li><li> Vorbereiten der Antikörpermischung für jede jeweilige Rohr in der Dunkelheit. </li></ol> Nr. 1 Kein Antikörper # 2 30 ul FITC Isotypenkontrolle + 30 ul PE Isotypenkontrolle + 15 ul CD16/32 Blockierung # 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung # 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung # 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung <table border="1"><tbody><tr><td> Fügen Sie nichts zu Blut oder Knochenmark Probe Nr. 1 </td></tr><tr><td> Add 5 ul Antikörper Mischung Nr. 2 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 2 </td></tr><tr><td> Add 3 ul Antikörper Mischung # 3 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 3 </td></tr><tr><td> Add 3 ul Antikörper Mischung # 4 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 4 </td></tr><tr><td> Add 5 ul Antikörper Mischung Nr. 5 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 5 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Halten Sie im Dunkeln in Eis für 30 min. </li><li> 2 ml 1X RBC Lysepuffer in jedes Röhrchen. Halten Sie im Dunkeln auf Eis für 15 min. </li><li> Abzentrifugieren der Zellen bei 1500 rpm, 5 min bei 4 ° C. (GH 3,8 Rotor, 1.500 rpm = 350 xg) Überstand entfernen. Das Pellet mit 500 ul Zell-Färbepuffer bei Dunkelheit, dann Wirbel kurzzeitig. </li&gt; <li> Überprüfen Sie die CD45.1 (entspricht WT) und CD45.2 (die KO) in der immungefärbten Blut und Knochenmark-Proben mittels Durchflusszytometrie. Wählen FITC zu WT CD45.1 und PE darstellen KO CD45.2 darstellen. </li><li> Analysieren Sie die Durchflusszytometrie Ergebnisse FlowJo Software. Berechnen Sie das Verhältnis von FITC: PE-Verhältnis oder PE: FITC-Verhältnis zu ermitteln, ob Donorgenotyp dominanten Genotypen in Blut und Knochenmark. </li></ol>

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	<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).</li><li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis.">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li><li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Knochenmarktransplantation Ansatz ist geeignet für immunologische Forschung von Colitis, Infektionen, Krebs, Fettleibigkeit und andere Krankheiten. Dieses Experiment Knochenmarktransplantation ist erforderlich, wenn das Gen-von-Interesse in beiden Knochenmark stammen und nicht-Knochenmark stammende Zellen und das Gen-von-Interesse vermutet wird, um Krankheiten durch Zellen aus entweder Population vermitteln exprimiert wird. Zum Beispiel wird gezeigt, antimikrobiellen Peptids Cathelizidin zu modulieren akute Kolit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Zelle Färbepuffer </td><td> BioLegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X RBC Lysispuffer </td><td> BioLegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC Maus Isotyp-Kontrolle </td><td> BioLegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE Maus Isotyp-Kontrolle </td><td> BioLegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE-anti-Maus CD45.2 </td><td> BioLegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC-Anti-Maus CD45.1 </td><td> BioLegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD16/32 blockieren </td><td> BioLegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 um Zellsieb </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td&gt; MP Biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (Fischer) </td></tr><tr><td> Lysol IC </td><td> Andwin Scientific </td><td> NC9745686 (Fischer) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> Maus restrainer </td><td> Braintree Scientific </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> JL Shepherd and Associates </td><td> Mark I 68A </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer Reagenzglas </td><td> Falke </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> Digitaler Messschieber </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult ICT </td><td> Beckman Coulter </td><td> G0328QW </td></tr&gt; </tbody></table>

differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation

Um die Rolle von einem Gen in der Entwicklung einer Kolitis verstehen, verglichen wir die Antworten von Wildtyp-Mäusen und Gen-von-Interesse-defizienten Knockout-Mäuse zu ulcerosa. Wenn die Gen-von-Interesse in beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen des Wirts exprimiert wird, jedoch ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse in Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark differenzieren abgeleiteten Zellen durch Knochenmarktransplantation Technik. Um das Knochenmark stammende Zellen Genotyps von Mäusen zu verändern, wurden die ursprünglichen Knochenmark des Empfängers Mäusen durch Bestrahlung zerstört und dann durch neue Spender-Knochenmark verschiedener Genotypen ersetzt. Wenn Wildtyp-Mäusen Spender-Knochenmark, um Knockout-Mäuse transplantiert wurde, konnten wir erzeugen knockout Mäuse mit Wildtyp-Gen-Expression in Knochenmark stammende Zellen. Alternativ wurde bei Knockout-Mäusen Spender-Knochenmark zu Wildtyp-Empfängermäuse, Wildtyp-Mäusen ohne Gen-of-interest Ausdruck transplantiertaus Knochenmark stammenden Zellen produziert wurden. Allerdings kann eine Knochenmarktransplantation nicht 100% abgeschlossen. Daher verwendeten wir cluster of differentiation (CD) Moleküle (CD45.1 und CD45.2) als Marker von Spender und Empfänger-Zellen, den Anteil der Spender-Knochenmark-abgeleiteten Zellen in Empfängermäuse und der Erfolg der Knochenmarktransplantation verfolgen. Wildtyp-Mäuse mit CD45.1 Genotyp und Knockout-Mäusen mit CD45.2 Genotyps verwendet wurden. Nach der Bestrahlung des Empfängers Mäusen wurden die Donor Knochenmarkzellen von unterschiedlichen Genotypen in die Empfänger-Mäuse infundiert. Wenn der neue Knochenmark zu übernehmen ihre Immunität regeneriert wurden die Mäuse durch chemische Mittel (Dextran Natriumsulfat, 5% DSS) herausgefordert, Kolitis zu induzieren. Hier zeigten auch die Methode ulcerosa in Mäusen zu induzieren und zu bewerten, die Rolle des Gens von Interesse aus dem Knochenmark stammenden Zellen exprimiert. Wenn die Gen-von-Interesse aus den Knochen abgeleiteten Zellen spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Erkrankung (z. B. colitis) kann der Phänotyp der Empfängermäuse mit Knochenmarktransplantation signifikant verändert werden. Am Ende der Colitis Experimenten abgeleitete das Knochenmark Zellen in Blut und Knochenmark mit Antikörper wurden gegen CD45.1 und CD45.2 bezeichnet und deren Mengenverhältnis der Existenz könnte verwendet werden, um den Erfolg der Knochenmarktransplantation mittels Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Erfolgreiche Knochenmarktransplantation sollte eine überwiegende Mehrheit der Donorgenotyp (in der Bezeichnung des CD-Molekül Marker) über Empfänger Genotyp sowohl im Knochenmark und Blut des Empfängers Mäusen.

Wenn das Gen-of-Interest spielt eine bedeutende Rolle in Immunzellen bei der Entwicklung ulcerosa, Empfangen die Mäuse Knochenmark von unterschiedlichen Genotyp durch Knochenmarktransplantation (WT KO oder KO zu WT) sollte eine veränderte Reaktion auf DSS Kolitis. Einer der wichtigsten Parameter zur Bestimmung der Schwere von ulcerosa ist die H &amp; E-Färbung der Colon-Geweben. Colongewebe Struktur ändert und Entzündungszeichen kann quantitativ durch H &amp; E Histologie Scoring-System ausgewertet werden. Kriterie...

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Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Knochenmarktransplantation bietet eine Möglichkeit, um den Genotyp der Knochenmark stammende Zellen zu ändern. Wenn das Gen von Interesse an beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen exprimiert wird, kann die Knochenmarktransplantation Knochenmark stammende Zellen zu einem anderen Genotyp ändern, ohne die nicht-Knochenmark stammende Zellen Genotyp.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K Aufrufe.  The University of California Los Angeles, Los Angeles. Knochenmarktransplantation bietet eine Möglichkeit, um den Genotyp der Knochenmark stammende Zellen zu ändern. Wenn das Gen von Interesse an beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen exprimiert wird, kann die Knochenmarktransplantation Knochenmark stammende Zellen zu einem anderen Genotyp ändern, ohne die nicht-Knochenmark stammende Zellen Genotyp.

Serie: Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

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Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...