Dieses neuartige Knochenmarktransplantationsprotokoll kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Gast dendritische Zellen Transplantat-versus-Host- und Transplantat-versus-Leukämie-Antworten nach der Transplantation regulieren. Ex-vivo-Zellregenerationen ermöglichen es, dieses Protokoll anzupassen, um die Rolle anderer Immunzellpopulationen wie Makrophagen und Neutrophilen einfach durch Modifizieren des Kulturzustands zu testen. Demonstrieren das Verfahren mit mir wird Laborleiter Krystal Hossack und Bachelor Sanjeev Gurshaney.
Für spendertes T-Zell-erschöpftes C57BL/6 Knochenmarkpräparat, Ernten Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia nach Standardprotokollen von eingeschläferten Spendermäusen und übertragen Sie die Knochen in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 92 Millimetern, die 1%RPMI-Medium enthält. Entfernen Sie mit einer Schere die Enden von jedem Knochen und füllen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Spur-Nadel mit frischem 1%RPMI-Medium ausgestattet ist. Setzen Sie die Nadel in ein Ende eines Knochens ein und drücken Sie den Kolben, um das Knochenmark aus der Höhle und in ein Sammelzellsieb zu spülen.
Wenn das gesamte Knochenmark gesammelt ist, belasten Sie die Knochenmarkstücke durch einen 75-Mikrometer-Netzfilter und übertragen Sie die einzellige Suspension in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet 20 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter-Konzentration in PBS, ergänzt mit 0,5%BSA, wieder auf. Als nächstes fügen Sie 0,05 Mikrogramm THI1-Antikörper pro mal 10 zu den sechs Zellen für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu.
Am Ende der Inkubation die Zellen zweimal mit 10 Millilitereis iskaltes PBS waschen und das Pellet bei einer 2-fachen 10 bis sieben Milliliter-Konzentration in 0,5% BSA, ergänzt mit 10%jungkaninchenkomplementiert und 2%DNAse in sterilem Wasser, für eine 45-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius wieder aufsetzen. Am Ende der Inkubation die Zellen zweimal mit 15 Millilitern frischer PBS pro Waschgang waschen und das Pellet in 20 Milliliter PBS mit 0,5%BSA wieder aufhängen. Bündeln Sie die Lymphknoten und die Milz in einem 40 Mikrometer Porensieb und verwenden Sie einen Spritzenkolben, um das Gewebe durch die Filter zu mazerieren, um die Zellen freizusetzen.
Waschen Sie das Sieb und den Kolben mit RPMI Medium, ergänzt mit 1%FBS, um alle Zellen zu sammeln und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren. Fügen Sie dem Zellpellet fünf Milliliter ACK-Lysepuffer hinzu. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur, stoppen Sie die Reaktion mit fünf Milliliter Medium ergänzt mit 1%FBS und Pellet die weißen Blutkörperchen durch Zentrifugation.
Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter MACS-Puffer zum Zählen aus und verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von zwei mal 10 bis zu den acht Zellen pro Milliliter in frischem MACS-Puffer. Fügen Sie die entsprechende Konzentration von Anti-Erythroid-, Anti-Granulozyten-, Anti-B-Zell- und Anti-NK-Zell-Depletionsantikörpern pro mal 10 zu den sechs Zellen für eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu. Am Ende der Inkubation die Zellen mit 10 Milliliterem eiskaltem MACS-Puffer waschen und das Pellet einmal 10 bis zu den acht Zellen pro Milliliter Konzentration in frischem MACS-Puffer wieder aufsetzen.
Als nächstes fügen Sie 0,22 Mikroliter Anti-Biotin MicroBeads pro mal 10 zu den sechs Zellen hinzu, wobei Sie eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius mischen. Am Ende der Inkubation die Zellen mit 10 Milliliterem eiskaltem MACS-Puffer waschen und die ungebundenen angereicherten T-Zellen durch magnetische Perlentrennung mittels MACSxpress-Separator nach Standard-Perlenisolationsprotokollen sammeln. Am Ende der Trennung die T-Zellen durch Zentrifugation sedimentieren und das Pellet in fünf Millilitern frischen MACS-Puffers zum Zählen wieder aufsetzen.
Um knochenmarkabgeleitete dendritische Zellen zu erzeugen, isolieren Sie das Knochenmark von den Oberschenkelknochen von Wildtyp- oder Faktor-B-Knockout-Mäusen, wie gezeigt, und lysieren die roten Blutkörperchen in fünf MilliliterACK-Lysepuffer, wodurch die Reaktion mit 10 Millilitern RPMI nach fünf Minuten mit 1%FBS ergänzt wird. Nach dem Sammeln der Vollblutzellen durch Zentrifugation, setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter Kulturmedium auf ein zwei mal 10 bis sechs milliliter Konzentration und fügen Sie 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF zu den Zellen, bevor Sie 10 Milliliter Zellen auf einzelne 100 mal 15 Millimeter Petrischalen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Tage säen. Aktivieren Sie am sechsten Tag die aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellkulturen mit 25 Mikrogramm pro Milliliter LPS pro Platte.
Mindestens 85% der kultivierten Knochenmarkzellen unterscheiden sich in dendritischen Zellen. Die T-Zell-Reinheit nach magnetischer Perlenanreicherung beträgt 90%Das große MHC-Modell C57BL/6 BALB/c entspricht eng der GVHD-Entwicklung nach der Transplantation. Der Höhepunkt der Schwere tritt etwa 11 Tage nach der Zellübertragung auf, gefolgt von einer Verringerung der klinischen Werte und der Körpergewichtsregeneration bis zum 16. Tag.
Die Empfänger erlagen der GVHD nach der Transplantation 30 bis 40 Tage lang. Interessanterweise verbessert die Transplantation mit Faktor B Knockout dendritischen Zellen das Überleben der Empfänger und die klinischen GVHD-Werte. Luziferase-transduced A20 B-Zell-Lymphom ermöglicht die Überwachung des Tumorwachstums bei lebenden Tieren.
In diesem repräsentativen Experiment starben alle Wild-Typ-BALB/c-Empfänger, die allein Knochenmark plus A20 erhielten, an einem Tumorrückfall. Wildtyp BALB/c-Empfänger, die mit knochenmark-abgeleiteten ACC1-depleted Spender-T-Zellen transplantiert wurden, starben an GVHD. Darüber hinaus starben Tiere, die Spenderknochenmark und ACC1-erschöpfte T-Zellen erhielten, an GVHD und Tumorrückfall.
Um genügend Knochenmarkzellen zu erzeugen, müssen die gesammelten Tibia- und Oberschenkelknochen vor der Knochenmarkkorrektur vollständig frei von Muskelgewebe sein. Negative Reinigung der Knochenmarkzellen mit Biotinylase Anti-CD3 und Anti-Biotin MicroBeads kann auch pro durchgeführt, um die Lymphozyten aus dem Knochenmark zu erschöpfen.
