PLP ist Associate Investigator von Sanford Gesundheit von Kindern Research Center. R01AR056712, R01AR052779 und P30 AR061303 aus dem National Institute of Health / National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett-und Hautkrankheiten (NIAMS), MDA und Kinder Sanford Health Research award: Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien an PLP unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von der Forschungsförderung des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft in diesem Projekt profitiert FP7-Health - 2009 EndoStem 241440 (Aktivierung des Gefäßsystems verbunden Stammzellen und Muskel-Stammzellen für die Reparatur und Wartung von Muskelgewebe) SA wurde unterstützt. CIRM Gemeinschaft.

1. Infektion von HES Dieses Protokoll erfordert hohe Titer Lentiviren Codierung BAF60C und MyoD 13. Diese Konstrukte sind auf Anfrage erhältlich. <ol><li> Empfehlungen vor dem Start <ol><li> Um eine hohe Effizienz der Infektion, Platte hESCs für die Infektion auf Feeder-freien Bedingungen (2A), um zelluläre Konkurrenten während der Virusaufnahme beseitigen zu gewährleisten. Tatsächlich sind notorisch MEFs leichter zu infizieren im Vergleich zu HES und sind für die MyoD-vermittelte Umwandlung zuständig. So beseitigen MEFs von hESC-Kulturen erhöht die Infektionsrate. </li><li> Es wird empfohlen, einen hohen Titer Lentiviren müssen hohe Infektionseffizienz zu gewährleisten. Optionen, um die Effizienz der Infektion zu verbessern, werden im Abschnitt &quot;Kontrolle der Infektion&quot; diskutiert. </li><li> Bereiten Matrigel-beschichteten Platten durch Zugabe von 1 ml 1 mg / ml Matrigel in jede Vertiefung und lassen Sie mindestens 1 h bei RT (oder O / N bei 4 ° C versiegeltvorbereitet, wenn am Tag vor). </li></ol></li><li> Infektion Verfahren <ol><li> Tag vor der Infektion <ol><li> In hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement in dem Medium bei 1.000 X Verdünnung (2 mM Endkonzentration). </li></ol></li><li> Tag 0 - Infektion mit BAF60C Hinweis: Führen Sie die Infektion von HES mit BAF60C ersten durch eine Infektion mit MyoD gefolgt. <ol><li> Distanzieren eine Vertiefung einer 6-Well-Platte von HES als Kolonien 14 in einer Einzelzellsuspension durch Inkubation mit 1 ml TrypLE für 5 min bei 37 ° C gezüchtet </li><li> Über Suspension auf eine 15-ml-Tube, fügen 9 ml hESC mittel-und Zentrifuge für 5 min bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Während der Zentrifugation, bereiten die Infektion Mischung in ein sauberes Röhrchen durch Zugabe von 1 ml mTeSR1 Polybren (6 mg / ml) und hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement (2 mM). </li><li> Resuspendiere das Zellpellet (etwa 5 × 10 5 -1 × 10 6 Zellen aus einer confluent auch von HES) mit 1 ml der Infektion Mix und Platte auf einer 6-Well niedrigen Befestigungsplatte, die die Zellen aus, um den Kunststoff anhaftenden verhindert. </li><li> In BAF60C-IRES-GFP-Virus bei 10 8 MOI und Inkubation von 3 Stunden im Brutschrank </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension, die Viren enthalten, und teilen Sie ebenso in zwei Matrigel-beschichteten Vertiefungen. Dann fügen Sie 2 ml mTeSR1 + hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement in jede Vertiefung und lassen O / N im Brutschrank. </li></ol></li><li> Tag 1 <ol><li> Das Medium mit dem Virus vorsichtig entfernen und ersetzen mit 2 ml mTeSR1and hES-Zell-Klonen &amp; Recovery-Ergänzung. Cells Verklumpung starten, wie in 2B gezeigt. </li></ol></li><li> Tag 2 - Infektion mit MyoD <ol><li> Bevor Sie fortfahren überprüfen Sie die Fluoreszenz Status der Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, um eine hohe Effizienz der Infektion haben. Wenn nicht, siehe Abschnitt &quot;Kontrolle infizierenion &quot;. </li><li> Wenn die Zellen mindestens 80% Konfluenz erreicht, gehen Sie wie folgt; sonst warten noch einen Tag, bevor Sie fortfahren. </li><li> Entfernen Sie das Medium und 1 ml TrypLE Reagenz, um die Zellen zu distanzieren. Inkubiere 5 min bei 37 ° C. </li><li> Wiederholen Sie wie beschrieben from1.2.2.2 - 1.2.2.6 Hinzufügen MyoD Virus bei 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Tag 3 <ol><li> Das Medium mit dem Virus vorsichtig entfernen und ersetzen mit 2 ml mTeSR1and hES-Zell-Klonen &amp; Recovery-Ergänzung. </li><li> Platte MEFs auf Matrigel-beschichteten Platten bei 2,5 x 10 5 / cm 2 für den nächsten Tag zu Fortpflanzung der infizierten Zellen zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Tag 4 <ol><li> Entfernen Sie das Medium und 1 ml TrypLE Reagenz, um die Zellen zu distanzieren. Inkubiere 5 min bei 37 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in einer 15-ml-Falcon-Röhrchen, fügen 9 ml hESC mittel-und Zentrifuge für 5 min bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Remove der Überstand und resuspendieren in 6 ml HES-Medium. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus dem MEF-mit 6-Well-Platte und Teller hESCs 1:2 Split-Verhältnis, Abgabe 3 ml für jeweils MEFs haltigen gut. Tipp: Wenn die Kolonien Zusammenfluss erreichen, können einige der Vertiefungen MyoD/BAF60C-infected Zellen in flüssigem Stickstoff als Reservevorrat eingefroren werden. Gefriermedium enthält 90% KOSR und 10% DMSO plus 2 mM hES-Zell-Klonen &amp; Recovery-Ergänzung. Die übrigen Brunnen kann dann auf die Differenzierung Protokoll ausgesetzt werden - Beschreibung siehe unten. Wenn mehr Zellen benötigt werden, um mehr myospheres erzeugen, kann infiziert hESCs wie folgt weiter propagiert werden: </li><li> Entfernen des Mediums und Inkubation mit 1 ml von 1 mg / ml Collagenase IV für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Kollagenase IV und 1 ml hESC Medium. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop kratzen die Kolonien mit einer 10 ml-Spitze. </li><li> Sammeln Sie die Stücke von colonies in einem 15-ml-Tube und lassen Sie sie für 3 min sedimentieren. Dann entfernen Sie den Überstand, resuspendieren in hES-Medium und Platte auf MEFs Platten unter Verwendung eines im Verhältnis 1:4. </li></ol></li></ol></li><li> Überprüfen Infektion <ol><li> Während Vermehrung der Zellen, wird empfohlen, um die infizierten Zellen Platte in einem kleineren Maßstab, für RNA-Analyse durchführen zu ernten und Proteinexpressionsanalyse mittels Immunfluoreszenz, um nach Biomarkern, die die korrekte biologischen Status auf jeder Stufe reflektieren überprüfen (siehe Repräsentative Ergebnisse). Für hohe Titer Lentiviren der Prozentsatz der infizierten Zellen zu erwarten sollte mindestens 80% betragen. </li><li> Um eine hohe Effizienz zu gewährleisten, können die lentiviralen Vektoren modifiziert werden, die Einführung einer fluoreszierenden Selektionsmarker und / oder eine Antibiotikaresistenz. Unsere lentiviralen Plasmid BAF60C ausdrücken trägt auch GFP-Fluoreszenz. </li><li> Sortierung hESCs für eine Fluoreszenzmarkierung. Im Fall der geringen Effizienz der Infektion wird empfohlen, ein Fluoreszenz verwendenctivated Zellen Sortierung (FACS-Sortierung), um auf Zellen BAF60C Virus, bereichern und dann infizieren die Zellen mit hohem Titer MyoD-Virus. <ol><li> In hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement im Medium der Tag vor der Sortierung. </li><li> Der Tag der Sortierung, distanzieren die Zellen durch TrypLE (wie am Tag 0 beschrieben) und Resuspendieren der Zellen in KO Ersatz Serum Plus hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement in FACS-Röhrchen. </li><li> Am Ende des Sortier, sammeln die Zellen in KO Ersatz Serum und Platte auf MEFs Platten Zugabe von hES-Zell-Klonen &amp; Recovery-Ergänzung. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-wie Induktion und Differenzierung <ol><li> Induktions-und Differenzierungsverfahren <ol><li> Tag 0 - EB-Induktions <ol><li> Stellen Sie sicher, bevor Differenzierung von hES BAF60C/Myod-infected, zu hohe Anzahl der Kolonien in der gut (2C) haben. </li><li> Für jeden gut remove das Medium, waschen mit PBS und 1 ml 1 mg / ml Kollagenase IV. Inkubation für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Collagenase und 1 ml EB Medium. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop schnell mechanisch distanzieren, die Kolonien in 400-800 Zellaggregate durch Abschaben mit einem 10-ml-Spitze. </li><li> Sammeln Sie die Stücke von Kolonien in einen 15-ml-Tube und lassen Sie sie für 3 min sedimentieren. Entfernen Sie den Überstand erneut zu suspendieren in 3 ml EB Medium und übertragen die Zellsuspension auf eine Vertiefung einer 6-well niedrigen Befestigungsplatte. </li></ol></li><li> Tag 1 <ol><li> Überprüfen Sie die Größe der Kolonien und der Zelltod, bevor Sie fortfahren. Wenn große Stücke vorhanden sind, brechen sie durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit einer 5-ml-Pipette 3-4 mal. Wenn der Zelltod ist sehr hoch (viele schwimmende Zellen und Debris) ersetzen das Medium durch das Sammeln der Aggregate in einem 15-ml-Tube durch die Schwerkraft und die Platte sie mit 3 ml frischem Medium EB, sonst gehen Sie wie folgt. </li><li> In 1,5ml frischem EB Medium in den Wells </li></ol></li><li> Tag 2 <ol><li> Ändern Sie das Medium durch das Sammeln der Aggregate aus den Brunnen in einem 15-ml-Tube. Lassen Sie sie richten sich für 2 min. </li><li> Überstand entfernen, ersetzen Sie mit 3 ml frischem Medium EB und verteilen sich auf dem gleichen Brunnen. </li></ol></li><li> Tag 3 <ol><li> In 1,5 ml frischem Medium EB in den Vertiefungen. </li></ol></li><li> Tag 4 <ol><li> Gehen Sie wie in &quot;Tag 2&quot; beschrieben. </li></ol></li><li> Tag 5 - Myogenic Differenzierung der EB-wie Cluster (Abb. 2D). <ol><li> Sammeln Sie die Aggregate wie in 2.1.3.1 beschrieben und einmal mit 2 ml PBS waschen; damit die aggregierten zu sedimentieren. </li><li> Entfernen PBS und 3 ml der DM Medium; Platte auf den gleichen Brunnen. </li></ol></li><li> Tag 6 - Tag 20 <ol><li> Von d6 d20 zu ersetzen, das Medium mit frischem Medium alle 3 Tage. Repräsentative myospheres in F gezeigtild 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Überprüfen myosphere Differenzierung <ol><li> Bevor Sie fortfahren, wird empfohlen, die Effizienz der Muskeldifferenzierung innerhalb der myospheres, indem sie Teile der myospheres in OCT-Verbindung, wie in einem früheren JoVE Protokoll 12 beschrieben überprüfen. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung für myogenen Marker wie myognenin (Klon F5D, DSHB) und Myosin schwere Kette (Klon MF20, DSHB) (siehe Repräsentative Ergebnisse). Tipp: Um erfolgreich mit der Färbung für Myogenin auf EB Abschnitte ist es wichtig, Antigen-Retrieval durch Behandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS) von 0,5% für 5 Minuten durchzuführen. Zusätzlich ist es möglich, dieses Protokoll für die Doppelfärbung mit F5D und MF20-Antikörper verwenden. </li></ol></li></ol> 3. Medien Rezepte <ol><li> ESC-Medium DMEM-F12 1 mM L-Glutamin 20% Knockout Serähm Ersatzmedium (KOSR) 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) 50 U / ml Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) 0,1 mM beta-Mercaptoethanol 8 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) </li><li> EB Medium DMEM F12 1 mM L-Glutamin 15% FBS 5% Pferdeserum </li><li> DM Medium DMEF F12 1X seiner flüssigen Medien Supplement 1X N-2-Beilage </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgeschlagene Protokoll beschreibt, wie man dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres) direkt aus hES-Zellen zu generieren. Die vorgeschlagene Strategie hat die beispiellose und außergewöhnliche Potenzial, Mini-Muskeln in Suspension, die als geeignet &quot;Krankheit in einer Schale&quot;-Modell für beide Screening-Tests und Entwicklungsstudien sein kann, zu produzieren. Darüber hinaus ist das Verfahren zur myospheres von hES erzeugen einfach und erfordert keine FACS-Sortierungsschritt während der Differenzierung, der typischerweise eine negative Auswirkung auf die Ausbeute an Zellen gewonnen erforderlich. Außerdem würde ein Sortierverfahren während der Differenzierung mit der Aggregation stören da sie eine Dissoziation der EB in einzelne Zellen. Das vorgeschlagene Verfahren basiert auf der epigenetischen reprograming von HES mit bestimmten Faktoren, MyoD und BaAF60C, die nicht in pluripotenten embryonalen Stammzellen exprimiert basieren. MyoD und BAF60C bieten dem &quot;Kern&quot;-Protein-Komplex thMarkierungen an der genomischen Loci, von dem Transkriptions geht um die Skelett myogene Programm zu aktivieren. Die beiden Faktoren zu den Zellen durch lentivirale Infektionen geliefert und es ist daher wichtig, um eine hohe Effizienz der Infektion beider Faktoren in allen Zellen zu erhalten. Dies kann durch einen hohen Titer Viren oder Viren mit Selektionsmarkern ausgestattet erreicht werden. Kulturbedingungen spielen auch eine wichtige Rolle bei der Optimierung des Ausmaßes der Muskeldifferenzierung. Wir schlagen vor, ein Serum-basierte Differenzierung Protokoll für die Differenzierung von hES-Zellen exprimieren MyoD/BAF60C in Cluster myogener Vorstufen, gefolgt von einer Inkubation in Serum-freien definierten Medium (das Insulin-Transferrin - ITS), um die Umwandlung von myogenen Vorläufersubstanzen in Skelett Myotuben zu erreichen. Es ist jedoch möglich, dass andere definierte Medien können eine gleiche oder bessere Muskeldifferenzierung zu erreichen. Eine Strombegrenzung des Protokolls ist, dass es für die Verwendung von fötalem Rinderserum, das neben enthalten stütztten viele tierische Proteine ​​und Substanzen, zeigt viel-zu-viele Variationen. Dies kann zu geringeren Wirkungsgrad oder Heterogenität der myogenen Umwandlung innerhalb myospheres führen. Der Hinweis, nicht alle EB-Strukturen aus BAF60/MyoD-expressing hESCs abgeleitet sind myospheres; nämlich sind einige EB-Aggregate wie voll der Muskelfasern zusammen. Die Anzahl der myospheres normalerweise von hES BAF60C und MyoD exprimieren, abgeleitet aus 30 bis 60% variieren, wie durch Immunfärbung auf EB Abschnitte am Ende des Protokolls durchgeführt (siehe Ergebnisse) geschätzt. Ein möglicher Ansatz, um eine Kulturschale nur myospheres bereichern wäre, eine myogene Reporter zu verwenden. Dies würde die teilweise oder Verwerfen der nicht unterschieden EB-wie Cluster und Auswahl nur die myospheres. Schließlich würde ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die zeitlichen Anforderungen der Faktoren eingeführt nützlich, um die Art der Lieferung zu verbessern. Zum Beispiel werden, wenn BAF60C und MyoD nur für sh erforderlichort Zeit zu &quot;Kick&quot; der Zellen in die richtige Richtung, Methoden auf Basis modifizierter mRNA Lieferung könnte angewendet werden. Im Gegensatz dazu, wenn die Faktoren für eine längere Zeit, bevor die Zellen nutzen ihre endogenen Proteinen benötigt wird, wäre ein episomaler Ansatz empfohlen werden, um die Variabilität und unkontrollierte Effekte durch die Integration in das Genom zu beseitigen. Schließlich ist zu beachten wir, dass es zwingend erforderlich, um BAF60C vor oder zur gleichen Zeit wie MyoD (nie nach), um hESC Umwandlung in Skelettmuskeln erreichen auszudrücken. Das Erfordernis der vorherigen Ausdruck BAF60C vermutlich verlässt sich auf seine Rolle bei der Voreinstellung der epigenetischen Landschaft für die richtige MyoD Chromatin Vertrieb über das Genom 6,15. Als solche könnten zukünftige Protokolle von Verbindungen oder andere Manipulationen, die BAF60C Ausdruck in hESCs Förderung verbessert werden.

Aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit zur Selbsterneuerung unter Beibehaltung Pluripotenz werden menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) als eine wertvolle Ressource in der regenerativen Medizin. Stammzell-vermittelten Wiederbesiedlung der erkrankten Muskeln und hES-oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS)-abgeleiteten Generation der Skelettmuskulatur für die in vitro-Krankheit Modellierung sind wichtige Ziele der Studien zu identifizieren Behandlungen und die Aufklärung der Pathogenese vieler neuromuskuläre Erkrankungen ausgerichtet. Allerdings haben diese Studien durch den Widerstand von HES in Skelettmuskelzellen umwandeln und durch den Mangel an Informationen über die molekulare Regulation von hES-Engagement in Richtung Skelett myogenesis fochten. Tatsächlich bisherigen Versuche, Skelettmuskelvorläuferzellen aus hES-Zellen zu erzeugen, ergab, dass nur Embryoidkörper (EB)-abgeleiteten Nachkommen oder mesenchymalen Zellen zuständig Skelett myogenesis aktivieren folgende ektopische Expression von Transkriptionsaktivatoren sind (zBPax3 oder Myf5) 1-3 oder durch Bestrahlen mit spezifischen Kulturbedingungen 5.4. Wir haben zuvor gezeigt, dass die SWI / SNF-Komponente BAF60C (durch SMARCD3 kodiert) ist eine wesentliche Komponente der Transkriptionsmaschinerie, die MyoD-vermittelte Aktivierung von Muskel-spezifische Loci 6 ermöglicht. Wir haben vor kurzem entdeckt, dass die selektive Fehlen BAF60C verleiht hESCs auf den Widerstand gegen die MyoD vermittelte Aktivierung der Skelett myogenesis 7, die sonst in BAF60C beobachtet ausdrückt somatischen Zellen 8-10, ein Prozess allgemein als myogenen Umwandlung bezeichnet. Zwangs Ausdruck BAF60C ermöglicht MyoD Skelett myogenesis direkt in hESCs aktivieren, auf bestimmte Kulturbedingungen mit BAF60C und MyoD Einführung eines epigenetischen Signatur, die in Richtung der hESCs myogenen Linie 7 verpflichtet. Zu beachten ist, offenbart vorherigen Proteomanalyse die selektive Fehlen BAF60 ° C unter den SWI / SNF-Komponenten, WSR 11. Wir haben dieses Wissen, um eine epigenetische Engagement von HES auf den myogenen Linie zu verhängen, die zur Erzeugung eines homogenen Population von Skelettmyoblasten, die aggregiert werden könnten, um dreidimensionale Kontraktions bilden Strukturen (myospheres), die funktionell nachahmen miniaturisierten Skelettmuskulatur 7. Tat unsere Verfahren zur Erzeugung von Skelettmuskelvorläuferzellen aus hES-Zellen beruht auf der epigenetischen Engagement von HES auf die myogenen Linie, die phänotypisch latent ist, bis die Zellen an Differenzierungssignale ausgesetzt ist, wie z. B. Zell Aggregation und Kultur in Differenzierungsmedium (siehe spezifische Protokoll). Diese Strategie erlaubt die Expansion einer homogenen Population von HES, die epigenetically Skelettmuskelabstammungslinie gebunden sind und geeignet, um die Bildung von dreidimensionalen kontraktilen myospheres die histologischen und funktionellen Eigenschaften der Skelett rekapitulierenMuskeln. Die myospheres liefern den ersten Beweis von miniaturisierten Muskeln nutzbare für eine &quot;Krankheit in einer Schale&quot;-Modell der Muskelkrankheiten. Wenn von Patienten gewonnen iPS erzeugt haben diese myospheres das Potenzial, langjährige Entwicklungsfragen aufzuklären und die Pathogenese der seltenen Krankheiten, zusätzlich zum Angebot das enorme Potenzial als Instrument für die Hochdurchsatz-Screening von therapeutischen Verbindungen. Wir merken auch, dass eine sofortige Auslesen myosphere Analyse könnte durch Immunhistochemie auf Abschnitte vorgesehen werden, wie in einem Protokoll, das von JoVE Gomes et al. Beschrieben 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

Erzeugung eines homogenen und reichlich Population von Skelettmuskel-Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES) ist eine Voraussetzung für zellbasierte Therapien und für eine &quot;Krankheit in einer Schale&quot;-Modell der menschlichen neuromuskulären Erkrankungen. Haupthürden, wie geringe Fülle und Heterogenität der Population von Interesse, als auch einen Mangel an Protokollen für die Bildung von dreidimensionalen Strukturen kontraktilen haben die Anwendungen von Stammzellen für die neuromuskuläre Störungen begrenzt. Wir haben ein Protokoll, das diese Grenzen überwindet in hESCs von Eileiter Einführung von definierten Faktoren entwickelt - der Muskel Bestimmung Faktor MyoD und SWI / SNF Chromatin-Remodeling-Komplex-Komponente BAF60C -, die in der Lage, hESCs in den Skelettmuskel-Zellen umzuprogrammieren sind. Hier beschreiben wir das Protokoll eingerichtet, um hESC-abgeleiteten Myoblasten zu generieren und ihre Clusterbildung fördern in miniaturisierten dreidimensionalen Strukturen (myospheres), die funktionell nachahmen miniaturisierten Skelettmuskulatur 7 </sup&gt;.

Fig. 1a zeigt eine schematische Darstellung des Protokoll vorgeschlagen, myospheres von hES erzeugen. Die kritischen Schritte zu steuern (durch die Pfeile angedeutet) die Effizienz der Infektion in hESCs und die myogenen Umwandlung innerhalb der myospheres. In unseren Experimenten nutzen wir einen lentiviralen Vektor-Codierung BAF60C, die GFP-Fluoreszenz führt. Wir in der Regel infizieren die Zellen mit BAF60C und FACS-Sortierung 72 Stunden nach der Infektion für die Bevölkerung BAF60C ausdrücken zu bereichern. Wenn die Zellen zu erreichen etwa 70-80% der Zusammenfluss, infizieren wir mit MyoD Lentiviren. Nach der ersten Infektion dauert normalerweise zwei bis drei Tage, dass die Zellen Konfluenz erreichen. 1B zeigt Expression von exogenen Genen als-fache Induktion relativ zu HES nicht infiziert. 1C zeigt die Expression und Verteilung auf der Proteinebene der Faktoren eingeführt. BAF60C<html> Ausdruck als GFP-Fluoreszenz gezeigt, während MyoD Expression durch Immunfluoreszenz mit einem MyoD Antikörper nachgewiesen. Wir betrachten Tag 0 der Tag beginnen wir die Differenzierung von hES-Zellen in infizierten EB-ähnliche Aggregate. Nach 15 Tagen in DM Medium wird ein Teil der myospheres (in der Regel eine ganze auch) in OCT-Verbindung 12 eingebettet und geschnitten, um Immunfluoreszenz für myogenen Marker durchführen, um myogene Umwandlungseffizienz zu überprüfen. 1D zeigt repräsentative Färbung für Myogenin und Myosin schwere Kette in eine optimale Muskeldifferenzierung. Myospheres können verschiedene oder ungewöhnliche Formen haben, vielleicht als Folge der Fusion mit kleineren myospheres. Ab Tag 10 ist es möglich, sporadische Kontraktion in den myospheres beobachten (siehe Film 1 und 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. A) Schematische Darstellung der für die Erzeugung von myospheres hESCs. B) mRNA-Spiegel der exogenen Gene in hESCs mit BAF60C und MyoD (H9-BM) durch qRT-PCR überwacht und als fache Induktion infiziert verwendete Protokoll, wie im Vergleich zu infizierten hESCs verspotten (H9-ctr). C) Immunfluoreszenz-Bilder, die MyoD-Färbung (rot) und BAF60C Fluoreszenz (grün) aufgrund der IRES-GFP-Element im Vektor. D) Immunfluoreszenz auf myosphere Abschnitte für Myogenin angefärbt (MYOG ), Myosin Heavy Chain (MyHC) und DAPI gegengefärbt (siehe Immunfluoreszenz Details). Maßstab ist 100 um. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Bilder von Zell Aussehen in den verschiedenen Phasen desProtokoll von der Infektion (Teil I) mit der Differenzierung (Teil II). Maßstabsbalken ist 100 um. Während EB-Strukturen von D1 bis D5 sind meist kreisförmig (D), myospheres über 15 Tage nach der Regelung in 1A präsentieren eine unvorhersehbare Form und sind heterogen in Kultur gezüchtet; sehen zwei Beispiele in E und F.

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Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Aufrufe.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln. 

Serie: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

Forschung

Biologie

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.