Die Autoren bedanken sich bei Priyanka Subrahmanyam für hilfreiche Diskussionen danken. Die Autoren haben keine konkurrierenden finanzielles Interesse. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 und P30 Tumorimmunologie und Immuntherapie Programm zum TJ Webb unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health.

Ein. Generation von AAPC <ol><li> Bevor die Zugabe von Proteinen Perlen, bereiten alle Reagenzien und Puffer: 0,1 M Boratpuffer, 1x D-PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +); Bead Waschpuffer (1X PBS +5% humanem AB-Serum + 0,02% Natriumazid) ; Komplettes Medium (RPMI Medium, 100 mM Natriumpyruvat, 10 mM nicht-essentielle Vitaminlösung, 100 mM MEM Vitamin-Lösung, 1% 2-Mercaptoethanol, 10 uM Ciprofloxacin, 5% humanem AB-Serum); MACS-Puffer (1 l PBS freien der Ca 2 + und Mg 2 +, 5 g BSA und 2 mmol EDTA). </li><li> Spülen 1 ml Dynabeads M-450 Epoxy Perlen mit 3 ml sterilem 0,1 M Boratpuffer (Borsäure und Wasser, pH 7,0 bis 7,4) in einem 5 ml Borosilikatglas Gewinde Fläschchen. </li><li> In einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 100 ug hCD1d-Ig Dimer und 20 ug kostimulatorische Moleküle (Beispiel: Anti-CD28mAb) auf 1 ml PBS w / o Ca 2 + oder Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Place bead mit Glasfläschchen auf Magnet und saugen Boratpuffer aus Perlen. Fügen Protein Mischung aus Schritt 1,2 bis Glasfläschchen und wieder aufsetzen. Sofort durch Umdrehen des Fläschchens, decken Sie die Kappe mit Parafilm, und auf einem Rotator und über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, Ort Glasfläschchen auf Magnet und entfernen Proteinmischung, während sorgfältig vermieden Perlen. Waschen der Kügelchen durch Zugabe von 3 ml Wulst Waschpuffer (PBS mit 5% AB-Serum 0,02% Natriumazid), und Inkubieren bei 4 ° C auf einem Rotator für 5 min. Zweimal wiederholen. </li><li> Kügelchen können in diesem Wulst wash Gemisch gelagert werden. Um funktionale AAPC machen, entfernen Sie ein kleines Aliquot und zählen Sie die Perlen mit einem Hämazytometer. Überprüfen, dass die Proteine ​​stabil sind auf die Kügelchen durch Färbung mit Antikörpern (zB PE-konjugierten Anti-Maus-IgG1) und Durchführen durchflusszytometrische Analyse geladen. </li><li> Um Perlen mit Antigen zu laden, entfernen Sie 5 x 10 7 Perlen, und fügen Sie zu einem kleinen 1,5 ml Glasflasche, spülen Perlen mit 1 ml steriler PBS. Resuspend gewaschen Perlen mit 1 ml steriler PBS und fügen Antigen; Beispiel: Belastung mit α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Hinweis: Während wir keine Probleme mit Lipidlöslichkeit oder Micellenbildung haben erkannt, Lipide sollten nach den Empfehlungen des Herstellers behandelt werden. Insbesondere wurde KRN7000 in DMSO (1mg/ml) für diese Studien rekonstituiert. KRN7000 und anderen Glycolipid Antigene können auch in 0,2 mg / ml PBS, enthaltend 0,5% gelöst werden Tween-20 (2 Std. beschallen. Bei 37 ° C). Die WICHTIGER-AAPC müssen für mindestens 48-72 h vor der Verwendung geladen werden. </li></ol> 2. Isolierung von CD161 + CD3 +-Zellen <ol><li> Collect peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC). Für Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation Trennung von Lymphozyten aus einer Leukozytenmanschette oder Leukopherese Packung zunächst verdünnte heparinisiertem Blut mit einem gleichen Volumen von 1X PBS bei Raumtemperatur. </li><li> 15 ml Ficoll (auf Raumtemperatur erwärmt) auf 50 ml konischen Röhrchen. Langsam Overlay25 ml des verdünnten Blut-Gemisch auf der Oberseite des Ficoll. Zentrifugieren bei 2000 rpm für 30 min bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Lymphozyten-Schnittstelle (weißer Ring zwischen den Medien und Ficoll) mit einer Pasteurpipette und übertragen auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Waschen der Zellen durch Auffüllen des Rohres auf 50 ml mit PBS und Zentrifugieren bei 1500 UpM für 5 min. Verwerfen des Überstandes und verbinden die Rohre aus einem einzigen Individuum zu einem einzigen Rohr und waschen die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) erneut mit 20 ml PBS. Dann zählen die PBMC und resuspendieren in einer Konzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml in MACS-Puffer (1 l PBS frei von Ca 2 + und Mg 2 +, 5 g BSA und 2 mmol EDTA). </li><li> Um die T-Zell-Fraktion zu isolieren, mit 2 ml PBMC (10 8 Zellen) beginnen und mit 100 ul der Pan-T-Zell Bereicherung Lösung aus dem EasySep humanen T-Zell Enrichment Kit. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li&gt; <li> Je 100 ul magnetischen Partikel zu der Lösung hinzugefügt und bei Raumtemperatur für weitere 10 min. Bringt das Endvolumen von 2,5 ml Lösungsmittel zu und das Reagenzglas in der purpurroten Magnet für 5 min. Schnell abgießen CD3 + Fraktion in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 5 ml kaltem MACS-Puffer, zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen und Entfernen eines Aliquots für FACS-Färbung. </li><li> Um die CD161 + Zellen, erste resuspendieren angereicherte T-Zellen in 980 ul eiskaltem MACS-Puffer auswählen, hinzufügen 10 ug anti CD161 mAb und inkubieren im Kühlschrank für 10 min. </li><li> Zentrifugation der Zellen bei 1500 rpm bei 4 ° C für 5 min. Dann rekonstruieren das Zellpellet in 800 ul MACS-Puffer. Fügen Sie 200 ul Anti-Maus-IgG1 Mikroperlen und inkubieren die Lösung für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Während dieser Inkubationsschritt äquilibrieren eine LS Säule durch Zugabe von 3 ml MACS-Puffer. </li><li> Weiter, wäscht die Zellen durch Zentrifugieren 1500 rpm bei 4 ° C für 5 min. Resuverbringen die Zellen in 3 ml MACS-Puffer. Dann pipettieren der Zellen in den LS MACS Trennkolonne. Achten Sie darauf, zu vermeiden Erzeugung von Blasen durch Pipettieren langsam. Spülen der Säule durch Zugabe von 3 ml von MACS-Puffer. Zweimal wiederholen. </li><li> 3 ml frisches MACS-Puffer und entfernen Spalte von Magneten. Ort Spalte in eine 15 ml konischen Röhrchen. Legen Kolben und schieben Sie Inhalte gereinigte CD161 + CD3 + Zellen zu erhalten. Graf NKT-Zelle angereicherten Fraktion. Sie sollten haben 2-4 Millionen Zellen. </li></ol> 3. AAPC-vermittelte NKT Zellexpansion <ol><li> Einrichten Kokultur durch Zugabe von 10 6 angereicherten CD161 + CD3 + T-Zellen und 10 6 AAPC in 16 ml Vollmedium (Vollmedium + IL-2, 100 U / ml). Platte dieses Gemisch durch Zugabe von 160 ul / Vertiefung Endvolumen auf einer 96-Well-Gewebekultur-behandelten Polystyrol, U-Bodenplatte mit niedrigem Verdampfen Deckel. Führen Austausch des Mediums jeden 7. Tag durch Zugabe von 80 ml ​​frisches Medium. </li><li> ErnteZellen zu zählen, und führen FACS-Färbung am Tag 12-14. </li><li> Die expandierten NKT-Zellen können wie oben beschrieben ausplattiert in Schritt 3.1 werden, und zwar zu resuspendieren 10 6 expandierten T-Zellen und 10 6 AAPC in 16 ml Vollmedium. Platte dieses Gemisch durch Zugabe von 160 ul / Vertiefung einer 96-Well-U-Bodenplatte. Weiter zu Kokultur Medium aktualisieren jeden 7. Tag durch Zugabe von 80 ml ​​frisches Medium. </li><li> Am besten ist es, zusätzliche NKT-Zellen nach der zweiten Runde der Expansion einzufrieren (1 x10 6 / Kryoröhrchen in 1 ml-5% DMSO / 95% FBS.) </li></ol> 4. Functional Test: AAPC-vermittelte Stimulation der NKT-Zellen <ol><li> Einrichten 5x10 4 NKT Zellen / Well mit 5x10 5 AAPC in 200 ul Endvolumen (komplettes Medium) in 96-Well-U-Bodenplatte. </li><li> Ernte Zellkulturüberstand für ELISA nach 24-48 Stunden. </li></ol>

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	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules.">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li><li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+&#945;&#946;+T+cells+expressing+invariant+TCR+&#945;-chains.">Close phenotypic and functional similarities between human and murine &#945;&#946; T cells expressing invariant TCR &#945;-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li><li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. 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Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li><li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells.">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li><li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li><li>Tham, E. 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Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li><li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer.">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

AAPC können verwendet werden, um die grundlegenden Anforderungen für NKT-Zell-Aktivierung zu untersuchen, und es hat auch potenzielle klinische Wert für ex vivo Expansion von NK-T-Zellen für den adoptiven Immuntherapie. Mescher et al. Beschrieben eine der ersten Sicke basierten Systemen, wo murine biotinylierten MHC-Klasse-I-Peptid-einkettige Konstrukte wurden mit biotinyliertem kostimulatorische Moleküle B7.1 und B7.2 über Streptavidin an der Oberfläche der Latex-Mikrokugeln 14, 15 kombiniert. Dieser Ansatz wurde erfolgreich verwendet, um Antigen-spezifische T-Zellen von transgenen Mäusen stimulieren. Da außerdem dieser Ansatz verwendet ein einzelnes MHC-Peptid-Komplex, um eine homogene Beladung der MHC-Moleküle zu gewährleisten, soll jedes Ziel Peptidantigen erfordern einen neuen Transfektion zur Expression des gewünschten Einzelketten-MHC-Peptid-Komplex, wodurch die Allgemeingültigkeit der Ansatz. Wichtig ist, Pionier Dr. Schneck die Gruppe den Wulst based-AAPC, durch die Entwicklung von weiteren nicht-zellulären bead based AAPC, Hergestellt durch Kuppeln HLA-Ig, das Signal 1 und Anti-CD28-, Signal 2, an magnetische Kügelchen. HLA-Ig, einem einzigartigen multimerer Form von HLA fusioniert mit einem Immunglobulin molekulare Gerüst 16, 17 wurde durch seine Gruppe entwickelt. Anschließend entwickelten sie MHC-Ig basierte AAPC, die gezeigt haben, um effektiv zu erweitern CMV und MART-1-spezifischen CTL 18. Hier haben wir gezeigt, dass CD1d-Ig basierten AAPC verwendet werden, um funktionelle NKT-Zellen zu expandieren. Eine Studie hat ein ähnliches System verwendet, um die physikalische Wechselwirkung von NK-Zellen mit 19 CD1d untersuchen. Bemerkenswert ist, haben wir einen künstlichen Antigen-präsentierenden Zelle, die anpassungsfähig an jede Anforderung finden wir für optimalen NKT Zellproliferation konzipiert. Die AAPC Ausbau-Methode bietet eine einfache und zuverlässige Methode für die Erweiterung und Bereicherung menschlichen NKT-Zellen. Unsere AAPC können modifiziert werden, um systematisch die Rolle von einem Panel von potenziellen kostimulatorische Moleküle und beurteilen ihre Rolle auf NKT Zellproliferation werdention und Funktion. Somit stellen AAPC eine robuste vielseitige Technologie nützlich für die Induktion und den Ausbau NKT-Zellen. Die Erzeugung von aAPCs dauert weniger als eine Woche und ist geeignet für die Herstellung von großen Mengen von Perlen. Jedoch ist ein kritischer Schritt bei der Erzeugung des AAPC zu bestätigen, dass CD1d-Ig stabil auf der Oberfläche der Kügelchen immobilisiert und ihre Funktionalität zu beurteilen, um die Konsistenz von Charge zu Charge zu gewährleisten. Eine mögliche Einschränkung des Systems ist, dass es keinen Mechanismus, um auszuschalten Stimulierung, andere als mechanische Entfernung der Kügelchen. Insbesondere ist der Eingriff des T-Zell-Rezeptor (TCR) mit dem Antigen: CD1d/MHC komplexen erzeugen typischerweise die immunologische Synapsen im Konzert mit Zubehör / Adhäsionsmoleküle, die an der Induktion von inhibitorischen Faktoren oder suppressive sowohl auf der T-Zelle und zur Folge haben kann Antigen-präsentierende Zelle. Im AAPC Systems können diese Faktoren durch die T-Zelle hochreguliert werden, aber der Wulst nicht drücken die zugehörigen Ligandenfür diese Rezeptoren. Zusätzlich CD4 + NKT-Zellen nachgewiesen wurde Antitumor Antworten in Mäusen und Menschen zu unterdrücken, daher ist es möglich, dass nicht selektive Aktivierung aller NKT-Zellen (dh globalen Stimulation mit α-GalCer) oder der Aktivierung des falschen Teilmenge könnte zu unerwünschten immunologischen führen Ergebnisse. Folglich muss ein phänotypisch und funktionell zu charakterisieren den AAPC-expanded NKT-Zellpopulation. Wie in 4 gezeigt, haben wir gefunden, dass Stimulation mit α-GalCer beladenen AAPC anti-CD28 exprimieren kann NKT-Zellen produziert Th1, Th2 und Th17 Typs Zytokinen kommen. Murine Studien wurde berichtet, dass Herausforderung mit IL-33, ein kürzlich identifizierten Cytokin, in erhöhten Konzentrationen von zirkulierenden inflammatorischen Zytokinen wie IL-5 und IL-13 führte. Behandlung von NKT-Zellen mit IL-33 verstärkt ihrer Zytokinproduktion 20. IL-33 ist ein spezifischer Ligand für ST2 und es hat sich gezeigt, dass lösliches ST2 ca.n Block IL-33-Signalisierung. Somit, als ein Beispiel für eine zukünftige Anwendung könnte AAPC exprimieren ST2 erzeugt und verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine selektiv könnte hemmen die Produktion von Th2 Zytokine unter Induzierung Th1 Zytokinsekretion von NKT-Zellen. Es wurde auch berichtet, dass iv Injektion von Kb-exprimierenden AAPC in C57BL / 6 Mäusen führte zu einer verringerten Lungenmetastasen von Tumor 21. Wichtig ist, zeigen diese Daten, dass AAPC Datenverkehr an die Lunge und sind in der Lage, Effektor-T-Zell-Untergruppen aktivieren. Daher könnte ein zu generieren mehrere Arten von AAPC und untersuchen das Zusammenspiel von Antigen-spezifischen T-Zell-Untergruppen. Zusammenfassend zeigen diese Studien, dass CD1d-Ig basierte AAPC verwendet werden, um normale zelluläre APC zu ersetzen, und haben das Potenzial, um aktuelle klinische Ansätze für NKT zellbasierten-Immuntherapie verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep humanen T-Zell Enrichment Kit </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 menschlichen mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-IgG1 Microbeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimer XI rekombinante, lösliche Dimere Maus CD1d: IG Fusion Protein </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> BioLegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 Epoxy Perlen </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-Galactosylceramid (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitaminlösung </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacin </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> BioLegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Klon C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Klon C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> BioLegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-Maus-IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-anti-Maus IgG2a </td><td> BioLegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Amerikanischen Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> Humanem AB Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton Glass Probenflaschen mit Cap </td><td> Fisher Scientific </td><td> Klein (03 bis 343-6A) Groß (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

Natürliche Killer-T (NKT-Zellen) sind eine eindeutige Untergruppe von T-Zellen, die Marker Merkmal sowohl natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und T-Zellen 1 anzuzeigen. Im Gegensatz zu klassischen T-Zellen, NKT-Zellen zu erkennen Lipid-Antigen in Zusammenhang mit CD1-Moleküle 2. NKT-Zellen exprimieren einen invarianten Kette TCRα Umlagerung: Vα14Jα18 bei Mäusen und Vα24Jα18 bei Menschen, die mit Ketten von Vß begrenzten Vielfalt 3-6 verbunden ist, und werden als kanonische oder invariante NKT (i NKT-Zellen) bezeichnet. Ähnlich wie bei konventionellen T-Zellen entwickeln NKT-Zellen von CD4-CD8-Thymus-Vorläufer-T-Zellen nach der entsprechenden Signalisierung durch CD1d 7. Das Potential, NKT-Zellen zu therapeutischen Zwecken zu nutzen hat wesentlich mit der Fähigkeit zur Stimulierung und erweitern menschlichen NKT-Zellen mit α-Galactosylceramid (α-GalCer) und einer Reihe von Cytokinen 8 erhöht. Wichtig ist, erhalten diese Zellen ihre ursprüngliche Phänotype, sekretierten Zytokine und erscheint zytotoxische Funktion gegen Tumorzelllinien. Somit bleiben ex vivo expandierten NKT-Zellen funktionsfähig und kann für die adoptive Immuntherapie verwendet werden. Allerdings hat NKT-Zell-basierte Immuntherapie durch die Verwendung von Antigen präsentierenden Zellen autolog sind gering, und die Menge und die Qualität dieser Stimulatorzellen kann erheblich variieren. Monozyten abgeleiteten DC von Krebspatienten wurde berichtet, reduzierte Mengen an costimulatorischen Moleküle exprimieren und herzustellen weniger inflammatorischen Zytokinen 9,10. In der Tat haben murinen DC anstatt autologen APC verwendet worden, um die Funktion von NKT-Zellen aus CML-Patienten 11 zu testen. Allerdings kann dieses System nur für in-vitro-Tests eingesetzt werden, da NKT-Zellen nicht durch murine DC erweitert werden und dann für die adoptive Immuntherapie verwendet. So könnte ein standardisiertes System, das auf künstlichen Antigen-präsentierende Zellen (AAPC) setzt die stimulierende Wirkung von DC ohne die Fallstricke der allo-oder xenogenen ce produzierenlls 12, 13. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung CD1d basierenden AAPC. Da der Eingriff der T-Zell-Rezeptor (TCR) von CD1d-Antigen-Komplexe ist eine grundlegende Anforderung von NKT-Zellen-Aktivierung, Antigen: CD1d-Ig-Komplexe eine zuverlässige Methode zu isolieren, zu aktivieren und zu erweitern Effektor NKT Zellpopulationen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung CD1d-Ig basierten AAPC, durch kovalente Kupplung von CD1d-Ig und anti-CD28-mAb an magnetische Beads zu NKT-Zellen als standardisiertes Verfahren zur Vermehrung von NKT-Zellen (Abb. 1) anzuregen hergestellt. Zuerst muß man zeigen, dass die CD1d-Ig-Fusionsproteine ​​stabil auf die Oberfläche der magnetischen Kügelchen immobilisiert. Wie in 2A, CD1d-Ig und anti-CD28-Antikörper dargestellt wurden sowohl auf der Oberfläche der magnetischen Kügelchen ausgedrückt. Um die stimulierende Eigenschaft des AAPC untersuchen wir kokultivierten NKT-Zell-Hybridomen mit AAPC über Nacht, die Kulturüberstände geerntet und gemessenen IL-2-Produktion durch ELISA. Wir fanden, dass CD1d-Ig basierten AAPC Lage, die NKT-Zell-Hybridomen in Mengen gleich oder höher als ihre zellulären Gegenstücken stimulieren (Abbildung 3, Daten nicht gezeigt) waren. Interessanterweise fanden wir, dass unsere Maus NKT-Zell-Hybridome durch menschliche CD1d-basierte AAPC (Fi stimuliert werdengure 2B), die einfaches Verfahren zum Testen der einzelnen Charge von AAPC bereitstellt. Als nächstes wir die Ausbreitung Potential AAPC demonstrieren gesucht wurden somit humanen T-Zellen aus dem peripheren Blut isoliert. Zuerst wird die CD161 + CD3 + T-Zell-Fraktion wurde durch Magnetkügelchen Trennung angereichert. Dann wurden die T-Zellen mit α-biweekly GalCer beladenen AAPC stimuliert. Wichtig ist, fanden wir, dass selbst bei einem relativ niedrigen anfänglichen NKT-Zell-Population (0,03%), konnten wir die Zellen zu ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (Abbildung 3) ausbauen konnten. Wir haben NKT-Zellen aus der PBMC von vielen gesunden Probanden und Krebspatienten erweitert und haben festgestellt, dass α-GalCer beladenen AAPC Lage, die NKT-Zellen Population in beiden Gruppen ausdehnen. Bemerkenswerterweise war der Ausbau hoch im Kurs Spenders abhängig. Wie erwartet, je höher die ursprüngliche Population von Vα24 +-Zellen, je größer der Anteil der Expansion. Zusätzlichbei Verwendung einer Ausgangspopulation von 2 Millionen Zellen CD161 + CD3 + T-Zellen, kann man&gt; 10 7 Zellen nach zwei Runden der Expansion (Tabelle 1) zu erhalten. Ungefähr 80-90% der expandierten NKT-Zellen sind CD4 +, ~ 5% CD8 +, und der verbleibende sind vermutlich CD4-CD8-doppelt negativ NKT-Zellen. Diese erweiterten NKT-Zellen kann für funktionelle Untersuchungen verwendet werden, wie in 4A-C dargestellt. Wir haben festgestellt, dass unsere ex vivo expandierten NKT Zellen bleiben, die auf α-GalCer Stimulation und sind potente Produzenten von IL-17A, TNF-α und IFN-γ. Es sollte beachtet werden, dass, wenn die erste T-Zell-Anreicherung Bevölkerung ist gering und man ist nicht in der Lage, um den zweiten CD161 Anreicherung Schritt ausführen, der AAPC-vermittelte Expansion möglicherweise nicht die erwarteten Ergebnisse (siehe Abbildung 4D Donor 1). Wenn jedoch der Anteil der zirkulierenden NKT-Zellen ist höher als 0,1% liegt, sollte man noch in der Lage, eine signifikante Erweiterung zu erhalteni von NKT-Zellen. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass CD1d based AAPC verwendet werden, um effektiv zu erweitern und zu stimulieren primären humanen NKT-Zellen sind. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Abbildung 1. Prinzipskizze CD1d: Ig-basierten aAPCs Extrazelluläre Abschnitte des CD1d Molekül an die konstante Region einer Immunglobulin-schwere Kette-Protein von einer kurzen Aminosäurelinker abgetrennt fusioniert. Diese Moleküle können mit Lipid-Antigene, wie α-GalCer geladen werden kann, einfach durch Inkubation mit einem Überschuss des Lipids von Interesse. AAPC wurden durch Kopplung CD1d-Ig und Anti-CD-Abs an magnetische Perlen. In diesem System wird CD1d-Ig verwendet, um den verwandten Antigen-spezifischen Signal durch die TCR-und Anti-CD28-mAb liefert die kostimulatorische Signal bereitzustellen. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. . IgG Dimer (über Anfärbung mit PE-konjugiertem anti-Maus-IgG1) sowie Anti-CD28-Antikörper (mit FITC-konjugiertem Anti-Maus-IgG2a): FACS-Färbung von Oberflächenproteine ​​auf aAPCs A) aAPCs wurden auf das Vorhandensein von getesteten CD1d . Offene Histogramme zeigen Isotypenkontrolle; gefüllte Histogramme stellen die angegebenen Antikörper. CD1d-Ig Ausdruck AAPC kann IL-2-Produktion durch NKT-Zellen zu stimulieren. B) Die Vα14 + Maus NKT-Zell-Hybridom, DN32.D3, wurde entweder mit Medium, lösliches Antigen (α-GalCer), entladen AAPC oder α-GalCer-loaded AAPC cokultiviert. Kulturüberstände wurden geerntet und Standard-Sandwich-ELISA wurde verwendet, um IL-2-Produktion zu messen. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ausbau der NKT-Zellen durch CD1d-Ig beschichtet künstliche Antigen-präsentierenden Zellen. (A) Primäre CD3 + CD161 + doppelt positiven Zellen wurden aus PBMCs mittels magnetischer Separation isoliert. Die sortierten Zellen wurden mit α-GalCer geladen, CD1d-Ig beschichtet AAPC für 14 Tage stimuliert. Die Zellen wurden für Vα24 und Vβ11 folgenden AAPC Stimulation angefärbt. (B) Primäre humane NKT-Zell-vermittelte Lyse von einem B-Zell-Lymphom Linie. C1R-Zellen mit CD1d NKT-Zellen zu den angegebenen Verhältnissen in der Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen, a-GalCer (100 ng / ml) in 96-Well-Platten mit U-Boden für 20-24 Stunden inkubiert. NKT-Zell-vermittelten Zell-Lyse wurde durch durch Standard 51Cr-Release-Assay beurteilt. <img alt="Abbildung 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Abbildung 4. Zytokin-Profile von AAPC expandierten NKT-Zellen. </strong&gt; Nach Stimulation mit α GalCer geladenen AAPC für zwei Wochen, die erweiterten NKT-Zellen (1 × 10 5 / Vertiefung) wurden mit löslichem α-GalCer, PMA / Ionomycin, anti-CD3/28 Mikrokügelchen oder α-GalCer geladenen AAPC kokultiviert (2 × 10 5 / Well) für 48 Stunden. (A) IL-17A, (B) TNF-α und (C) IFN-γ-Produktion wurde durch Standard-Zytokins ELISA gemessen. Die angegebenen Daten sind Nettopreise Zytokin-Produktion nach Abzug der negativen Kontrollen (Medien und leere Kügelchen). (D) primären T-Zellen wurden aus PBMC mit Magnetkügelchen Trennung isoliert. Die sortierten Zellen wurden für zwei Wochen mit der Indikation a-loaded-GalCer AAPC stimuliert. Die Zellen wurden unter Verwendung Abs spezifisch für Vα24 + und Vβ11 + und mittels Durchflusszytometrie analysiert.

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Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Aktivierung und Ausbau menschlichen NKT-Zellen aus losem T-Zellpopulationen mit künstlichen Antigen-präsentierende Zellen (AAPC). Die Verwendung von CD1d basierenden AAPC bietet eine standardisierte Verfahren zur Erzeugung hoher Anzahl funktioneller NKT-Zellen.

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

17.9K Aufrufe.  University of Maryland. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Aktivierung und Ausbau menschlichen NKT-Zellen aus losem T-Zellpopulationen mit künstlichen Antigen-präsentierende Zellen (AAPC). Die Verwendung von CD1d basierenden AAPC bietet eine standardisierte Verfahren zur Erzeugung hoher Anzahl funktioneller NKT-Zellen.

Serie: Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Forschung

Immunologie und Infektion

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.