Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des natürlichen Killerzellstoffwechsels. Ein wichtiger Parameter bei der Aktivierung durch Messung von Sauerstoffverbrauch und pH-Änderungen im extrazellulären Medium. Der Vorteil des extrazellulären Flussanalysators ist, dass er vollautomatisch ist und in der Lage ist, bis zu 92 Proben in Echtzeit mit geringen Zellmengen zu testen.
Somit können Bildschirme mit hohem Durchsatz angezeigt werden. Eine gültige Methode zur Bestimmung der Glykolyse und Atmung in Inky-Zellen ist in der Klinik sehr wichtig. Da gibt es viele Krankheiten einschließlich Fettleibigkeit und Krebs, wo Inky Zellstoffwechsel beeinträchtigt ist.
Beginnen Sie mit der Pipettierung von 20 Milliliterlymphozytentrennmedium in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Während Halten Sie das Rohr im 30-Grad-Winkel, sanft Pipette 20 Milliliter Blut über das Medium. Erstellen einer sichtbaren und klar definierten Schnittstelle zwischen den beiden Flüssigkeiten.
Zentrifugieren Sie die Rohre für 25 Minuten bei 1000 mal G.Dann nehmen Sie die Rohre vorsichtig aus der Zentrifuge und legen Sie sie in ein Rack. Prüfen Sie, ob eine auffällige Zellschicht an der Schnittstelle zwischen LSM und Plasma auftritt. Die mononukleäre Zellschicht vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Kunststoffpipette ansaugen und in ein neues 50-Milliliter-Konusrohr legen.
Waschen Sie die mononukleären Zellen zweimal mit 45 Milliliter PBS. Und zentrifugieren Sie sie bei 800 mal G für fünf Minuten. Um die natürlichen Killerzellen oder Engaven zu isolieren, zählen Sie die PVM-Meere und setzen Sie sie im NK-Trennpuffer um einmal 10 bis acht Zellen pro Milliliter aus.
Dann 10 Milliliter der Zellsuspension in ein neues 50-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie 500 Mikroliter NK Zellisolation Antikörper-Mix. Und 10 Mikroliter Anti-CD drei positive IsolationS-Antikörper-Mix zu den PBMCs.
Und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Vortex magnetische Perlen und fügen Sie einen Milliliter zu den PBMCs und Antikörpern. Dann die MIGS für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren inkubieren.
Fügen Sie 35 Milliliter NK Isolationspuffer hinzu und legen Sie das Rohr 15 Minuten lang auf den Magneten. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig mit einer 50 Milliliter Kunststoffpipette, ohne die Seiten oder den Boden des Rohres zu berühren. Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie bei 800 mal G für fünf Minuten.
Um die NK-Zellen mit löslichem Gang 15 zu stimulieren, setzen Sie 750 000 Zellen in 100 Mikroliter IMDM, die 10%HS enthalten, in einem Brunnen einer 96-Well-Platte wieder aus. Verdünnen Sie den menschlichen Gang 15 bis ein Mikrogramm pro Milliliter im IMDM und 10%HS. Und fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten menschlichen Gangs 15 in die Zellen.
Reparieren Sie eine Kontrollprobe mit nicht stimulierten Zellen und legen Sie beide Proben bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Stimulieren Sie die Zellen für 48 Stunden und führen Sie dann den extrazellulären Flusstest durch. Schalten Sie den Analysator am Tag vor dem Experiment ein und lassen Sie ihn bis zu 37 Grad Celsius erwärmen.
Öffnen Sie das Zensurpatronenpaket, und trennen Sie die Patrone von der Gebrauchsschild. Dann fügen Sie 200 Mikroliter der Kalibrant-Lösung zu jedem Brunnen der Nutzplatte hinzu. Und stellen Sie die Zentralpatrone wieder ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig unterGetaucht sind.
Für optimale Ergebnisse inkubieren Sie die Kartusche über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem kohlendioxidfreien Inkubator. Was richtig befeuchtet. Zur Herstellung einer klebstoffbeschichteten Klinge, Pipette 25 Mikroliter der Zellklebstofflösung für jeden Brunnen der Platte.
Und bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Dann entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Platte zweimal mit 200 Mikroliter sterilem Wasser pro Brunnen. Halten Sie die Platte 15 Minuten lang in der Zellkulturhaube offen, damit die Brunnen trocknen können.
Zentrifugieren Sie die zuvor isolierten NK-Zellen für fünf Minuten 200-mal G. Dann überstand und waschen Sie die Zellen in erwärmten mitochondrialen Stresstest Medium oder Glykolyse Stresstest Medium. Pellet die Zellen wieder und resuspendieren sie auf die bevorzugte Zellkonzentration im gleichen Medium.
Legen Sie 180 Mikroliter Zellsuspension pro Brunnen in die Assayplatte. Verwenden Sie die Bohrungen A eins, A 12 H eins und H 12 als Steuerbrunnen für die Hintergrundkorrektur. Wenn Sie 180 Mikroliter des Assaymediums zu diesen Wells Inkubieren, brüten Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem kohlendioxidfreien Inkubator.
Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 mal G für fünf Minuten. Beobachten Sie dann die Zellen unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie eine Manoschicht an der Unterseite des Brunnens bilden. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 25 Minuten.
Warme Arbeitslösungen bis 37 Grad Celsius. Und stellen Sie ihren pH-Wert bei Bedarf auf 7,4 um. Laden Sie die zuvor vorbereiteten Verbindungen für einen mitochondrialen Stresstest oder für einen Glykolyse-Stresstest in die Boards A, B und C der hydratisierten Zensorpatrone Legen Sie die geladene Zensorpatrone während der Einrichtung des Programms wieder in den Inkubator.
Um das extrazelluläre Fluss-Assay-Protokoll einzurichten, öffnen Sie die Software und verwenden Sie Gruppendefinitionen, um die Vorbehandlungsbedingungen zu definieren. Verwenden Sie die Registerkarte Platte Karte, um die Gruppen von Brunnen, die ähnliche Bedingungen haben auch die Hintergrundkorrektur und leere Brunnen anzuzeigen. Legen Sie dann das Programm auf der Registerkarte Protokolle fest.
Starten Sie das Programm und legen Sie die Sensorpatrone und die Gebrauchsschildaufteilauf dem Fach auf. Ersetzen Sie nach dem Kalibrierungsschritt die Kalibrierplatte für die Assayplatte durch die angeschlossenen Zellen. Sobald die Ausführung abgeschlossen ist, rufen Sie die Daten ab, und analysieren Sie sie.
Um die Reinheit und Lebensfähigkeit der NK-Zellen zu beurteilen. Kleine Alec Watt aus PVM-Meeren und die isolierte NK-Zellpopulation wurden durch Durchflusszytometrie befleckt und analysiert. Die Reinheit der NK-Zellpopulation wurde durch doppelten Verbleib gegen CD 3 und CD 56 oder NKP 46 festgestellt.
Viele mitochondriale Sauerstoffverbrauchsraten für die menschlichen NK-Zellen werden hier gezeigt. Wie erwartet zeigten I-Zellennummern höhere OCR-Werte an. Zellzahlen korrelierten auch linear mit der Menge an DNA oder Protein im Brunnen.
Auf der anderen Seite waren höhere Zellzahlen nicht optimal. Denn durch Zugabe von DNP war die Sauerstoffkonzentration im Brunnen in jedem Zyklus völlig erschöpft. Was die genaue Berechnung des OCR verhinderte.
In menschlichen NK-Zellen, 100 Mikromolar DNP wurde festgestellt, dass die optimale Dosis. Hier wird ein typisches mitochondriales Stresstestexperiment mit 750.000 NK-Zellen pro Brunnen gezeigt. In diesem Test oligomycin führt zu einem dramatischen Rückgang des Sauerstoffverbrauchs.
Und eine Zunahme von ECAR. Dies stellt einen Wechsel zur Glykolyse und eine Anstrengung zur Aufrechterhaltung der zellulären ATP-Spiegel dar. Die Aktivierung der NK-Zellen durch Gang 15 führte zu einem Anstieg sowohl des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs als auch der extrazellulären Versauerung.
Basal Maximum und ATP verknüpfte Atmung erhöht, aber nicht Protonenleck oder nicht mitochondriale Atmung. Darüber hinaus verringerte sich die OCR/ECA-Rate, was auf eine Verschiebung zu einem glykolytischen Stoffwechsel nach DER IL 15-Stimulation hindeutet. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es sehr wichtig, eine reine und gesunde Zellpopulation zu erhalten, um die optimale Zellzahl zu bestimmen und die Konzentration von Uncablers zu tittrieren.
