Die Autoren bedanken sich bei Dr. Carl Juni (University of Pennsylvania) um Hilfe Erzeugung und Bereitstellung AAPC Klon # 4 und Dr. Perry Hackett (University of Minnesota) für die Hilfe bei der SB-System danken. Zuschüsse: Cancer Center-Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward-Stiftung; Burroughs Wellcome Fund; Gillson Longenbaugh Foundation; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Department of Defense, Estate of Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr., Fonds für Leukämie Immuntherapie; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC die Schwester Institution Netzwerk Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales, Herr Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; Produktion Assistance for Cellular Therapies (PACT); William Lawrence und Blanche Hughes Stiftung Kinderdorf.

<html> Tag 0 oder vor Ein. Isolierung von mononukleären Zellen (MNC) aus PB und UCB <ol><li> Verdünnte PB mit gleichem Volumen und UCB mit vier Volumina PBS-EDTA. </li><li> Langsam Schicht verdünntem Blut (25 ml) auf Ficoll (12 ml) in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen (s) und Zentrifuge bei 400 xg für 30 - 40 min (keine Bremse). </li><li> Sammeln und übertragen die mononukleären Zellfraktion (Interface) mit einem Transferpipette einem frischen 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Bringen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit PBS-EDTA und zentrifugieren bei 450 xg für 10 min. </li><li> Überstand vorsichtig resuspendieren das Zellpellet (s) in 50 ml von Complete Culture Media (CCM) und Zentrifuge bei 400 xg für 10 min. </li><li> Gently resuspendieren und Pool der Zellpellets in CCM und führen Sie eine Zellzahl mit Trypanblau-Ausschluss-Verfahren (Cellometer, PBMC-Programm). </li><li> MNC kann nun zur Elektroporation (Nucleofection) verwendet oder kryokonserviert für zukünftige Verwendung. </li></ol>Titel &quot;&gt; 2. Herstellung von T-Zellen für die Elektroporation an Tag 0 <ol><li> Bei Verwendung kryokonservierten MNC, schnell auftauen ausreichend Zellen für eine Vollaussteuerung Elektroporation (2 x 10 8 ~ 20% Zugabe zu berücksichtigen Zellverlust während Zentrifugation und 2 h Inkubation) in 37 ° C warmes Wasserbad. Wenn frisch isolierten Verwendung MNC fahren 2,3 fort. </li><li> Sanft resuspendieren und übertragen Zellen einem entsprechend dimensionierten Zentrifugenröhrchen (en) enthaltenen vorgewärmten vollständiger phenolfreien RPMI Kulturmedium (PF-RPMI) und Zentrifugieren bei 200 xg für 10 min (kein Bremsen), Aspirat Überstand. </li><li> Resuspendieren der MNC in PF-RPMI Führen einer Zellzählung (Cellometer) und übertragen Zellen einem entsprechend dimensionierten Zellkulturgefäß (en) in einer Konzentration von 10 6 Zellen / ml. </li><li> Inkubieren in einer befeuchteten 37 ° C / 5% CO 2 Inkubator für 2 h ± 30 min. </li><li> Übertragen Sie die MNC um sterile Zentrifugenröhrchen (s), Spin bei 200 xg für 5 min (keine Bremsen), den Überstand aspirieren und sanft rE-suspendieren und kombinieren die Zellpellet (s) im PF-RPMI. </li><li> Durchführen einer Zellzahl (Cellometer) und berechnet den Volumen der Zellsuspension erforderlich (2 x 10 8 MNC). </li><li> Übertragen Sie das berechnete Volumen in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen und Spin bei 200 xg für 10 min (keine Bremse). </li><li> Überstand, so dass keine Restmedien und bleibt vorsichtig durch Antippen Rohrseite wieder auszusetzen. </li></ol> 3. Elektroporation (Nucleofection) von MNC (Full Scale-Prozess Mit 10 Küvetten) am Tag 0 <ol><li> Pre-Inkubation einer sterilen 12-Well-Platte mit 10 Vertiefungen mit 4 ml warmem PF-RPMI in einer befeuchteten 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Vorbereitung und Vorwärmung der Lonza Nucleofector Lösung humanen T-Zell-Kit (rekonstituiert den Anweisungen des Herstellers, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) auf Umgebungstemperatur in einem Biosicherheitswerkbank (BSC). </li><li> Bereiten Nucleofector Lösung / DNA-Master-Mix von adding 100 ul ergänzt Nucleofector Lösung, 15 ug Transposon (supercoiled DNA Plasmid CD19RCD28/pSBSO bezeichnet) und 5 ug Transposase (supercoiled DNA Plasmid pCMV-SB11 bezeichnet) pro Reaktion / Küvette. </li><li> Disperse das Zellpellet (aus Stufe 2.8) durch leichtes Antippen der Seite der Zentrifugenröhre und in Nucleofection Lösung / DNA-Master-Mix (End Zellkonzentration: 2 x 10 7 Zellen/100 ul) erneut zu suspendieren. </li><li> Transferieren es vorsichtig in 100 ul der Zellsuspension (aus Schritt 3,4) zu jedem der zehn (10) Lonza Nucleofection Küvetten, wobei darauf zu Blasen zu vermeiden. </li><li> Tippen Sie auf die Küvette einmal, und elektroporieren mit dem Programm U-014 (für unstimulierten T-Zellen). </li><li> Übertragen der Küvetten und die 12-Well-Platte (Stufe 3.1) an die BSC. </li><li> Ernte der elektroporierten Zellen aus jeder Küvette unter Verwendung eines feinen Spitze Amaxa Transferpipette durch Zugabe ~ 500 ul des vorgewärmten Kulturmedium aus der entsprechenden Vertiefung (12-Well-Platte in Ste hergestelltp 3,1) und gibt die Platte an einer befeuchteten 37 ° C / 5% CO 2 Inkubator für 2 h ± 30 min. </li><li> Nach der 2-stündigen Inkubation, Ernte und übertragen die Zellen aus allen Vertiefungen in ein steriles Zentrifugenröhrchen. </li><li> Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 140 × g für 8 min, Raumtemperatur, ohne Bremse und abzusaugen und den Überstand verwerfen, so dass kein restliches Medium des Zellpellets umfasst. </li><li> Disperse das Zellpellet durch leichtes Klopfen an die Seite des Zentrifugenrohres und sanft in CCM resuspendieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erreichen. </li><li> Führen Zellzahl und justieren Zellkonzentration bis 10 6 Zellen / ml in CCM. </li><li> Übertragen Zellsuspension Zellkulturflasche (s) und Platz im Inkubator über Nacht. </li><li> EGFP-transfizierten Zellen (5 × 10 6 Zellen / Küvette mit 5 pg Amaxa Steuerung EGFP superspiralisierte Plasmid, pmaxGFP): Verfahrensschritte 2,1 bis 3,8 wurden zur Kontrolle wiederholt. </li></ol> Tag 1 der 1. und anschließendeStimulationszyklen 4. Analyse der CAR Expression mittels Durchflusszytometrie am Tag 1 <ol><li> Ernte der elektroporierten Zellen und führen eine Zellzahl mittels Trypanblau-Ausschluss-Verfahren (Hämozytometer). </li><li> Fleck-Zellen (1 bis 2 x 10 6) mit dem Antikörper spezifisch für CD3, CD4, CD8 und humanen IgG Fcy (als Maß für CAR Expression). </li><li> Erwerben Zellen auf FACS Calibur und analysieren die Daten mit FCS Express-Software um die Expression von CAR berechnen. <ol><li> Berechnen CAR +-Zellen in Kultur durch die Formel: (Anzahl der insgesamt lebensfähigen Zellen) x (% CAR + Zellen) = Anzahl der CAR +-Zellen </li></ol></li></ol> 5. Herstellung AAPC (Klon # 4) an Tag 1. AAPC (Klon Nr. 4) wurden aus K562-Zellen (Parental Linie von der American Type Culture Collection erhalten) zu Co-express Gewünschter T Cell co-stimulatorisches Molekül Derived <ol><li> Auftauen eines Aliquots von gefrorenen 100 Gy bestrahlten AAPC in einem 37 °, C Wasserbad. </li><li> Zellen werden zweimal durch Zentrifugieren bei 400 × g, 10 min in CCM gewaschen und gezählt unter Verwendung Cellometer (Trypanblau-Ausschluss). </li><li> Berechnen Anzahl der lebensfähigen AAPC zur Stimulation erforderlich: (Anzahl der CAR + Zellen) x 2 = Anzahl der bestrahlten AAPC erforderlich </li></ol> 6. AAPC-vermittelte Stimulation der CAR + T-Zellen an Tag 1 Beginn der 1. und nachfolgende Stimulation Cycles <ol><li> Mischen elektroporierten Zellen (exprimierenden CAR) und γ-bestrahlten AAPC (Klon # 4) in einem sterilen Behälter in einem Verhältnis von 1:2 (CAR + Zelle: lebensfähige AAPC) in CCM. <ol><li> Man beachte die AAPC Verhältnis für die Expression von CAR auf Durchflusszytometrie am Tag nach der Elektroporation basierend eingestellt wird. </li></ol></li><li> Hinzufügen IL-21 (30 ng / ml) zu der Zellsuspension. </li><li> Aliquot in T-75 cm 2-Kolben (s) und / oder Vue Leben Kultur Beutel in einer Konzentration von 10 6 Zellen / ml und zum INCUBAToder. </li></ol> Tagen 3, 5 7. Fortsetzung Kultur der CAR + T-Zellen <ol><li> Eine Halbe-Medienwechsel, aufzufüllen IL-21, und aufrechtzuerhalten T-Zellen bei einer Konzentration von 10 6 Zellen / ml. </li></ol> Tag 7 8. Ende des ersten AAPC-vermittelte Stimulation Zyklus <ol><li> Ernten Sie die Zellen, zu zählen und für CD3, CD4, CD8 und Fcy (CAR) färben und fahren auf 10,1 fort. </li></ol> 9. Depletion von CD56 +-Zellen (in der Regel zwischen 7 und 14 Tage nach der Elektroporation) <ol><li> Durchführen einer CD56 Depletion mit paramagnetischen Kügelchen wenn CD56 + CD3 neg. Lymphozyten ≥ 10%. </li></ol> Stimulation Cycles # 2, # 3, und # 4 Entsprechend Tage 8 → 14, Tage 15 → 21, &amp; Days 22 → 28 10. Rekursive Addition von AAPC T Cells Klinisch ausreichender Zahl Propagieren <ol><li> Wiederholen Sie den stimulation Prozesses (4 mal), wie in Schritten von 4,3 bis 8,1 beschrieben. </li><li> Fügen IL-2 (50U/ml) zu den Kulturen, die am Tage 7, 14 und 21, und dann bei jedem Medienwechsel (drei Mal pro Woche, an einem Montag-Mittwoch-Freitag Zeitplan). </li><li> Kryokonservierung (Archiv) Überschuss T-Zellen, wie gebraucht. <ol><li> T-Zellen eingefroren mit kontrollierter Geschwindigkeit Gefrierschrank. </li></ol></li></ol> Tag 28 11. Ende des letzten AAPC-vermittelte Stimulation Zyklus: Harvest T-Zellen <ol><li> Kryokonservierung T-Zellen für Release-Tests und Infusion. </li></ol>

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	<li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor.">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li><li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells:+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held.">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li><li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs+on+track+in+the+clinic.">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li><li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+system:+a+non-viral+vector+for+gene+therapy.">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li><li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon+and+transposase+system+for+human+application.">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li><li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies:+victories+and+challenges.">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies.">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li><li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States.">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li><li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes.">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li><li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposition:+biology+and+applications+for+molecular+therapy.">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li><li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposon/transposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies.">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li><li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies.">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li><li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li><li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor.">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li><li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies.">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li><li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARs:+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity.">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li><li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li><li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor.">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li><li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases.">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li><li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19++lymphoid+malignancies.">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li><li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes.">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li><li>Hackett, P. B., Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies.">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li><li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules.">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li><li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells.">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Transposon und Transposase Systeme, wie aus piggyBac 12,19 und SB 18,20-22, sind nicht-viralen Ansätze zur Gentherapie, die eine Alternative zu viralen-vermittelte Transduktion von klinischer Qualität CAR + T-Zellen sind. Der SB wurde als Gentransfer-System auf sein Potential für die humane Gentherapie 1,6,23, zu wählen. Wir entwickelten die duale Technologien von SB Umsetzung (eine CAR einzuführen) und rekursive Addition von γ-bestrahlten AAPC (mit genetisch veränderten T-Zellen abzurufen stabil exprimieren eine CAR) als Plattform Technologien bei der Herstellung von TAA-spezifischen T-Zellen in Übereinstimmung dienen cGMP für Phase I / II-Studien (Abbildung 4). Nach 28 Tagen (vier 7-tägigen Stimulationszyklen) der Co-Kultur auf γ-bestrahlten AAPC sind wir typischerweise in der Lage, um mindestens ~ 10 10 genetisch modifizierte T-Zellen geeignet zur Verwendung beim Menschen. Bei Bedarf können zusätzliche Stimulationszyklen t durchgeführt werdeno erzeugen eine größere Anzahl von gentechnisch veränderten T-Zellen. Außerdem, wenn weniger CAR + T-Zellen benötigt werden, kann der Ansatz zur Elektroporation und Vermehrung zurückgefahren mit weniger Küvetten und Vortrag nur ein Sub-Satz der numerisch expandierten T-Zellen für nachfolgende Runden der Proliferation auf AAPC am Anfang jedes werden Stimulation Zyklus. Die Mehrheit der Elektroporation und vermehrt T-Zellen zur Herstellung einer Infusionslösung stabil exprimieren, die CAR geerntet. Der Auswuchs von CD4 + und CD8 + T-Zellen, die unsere 2 nd Generation CAR umfassen Zellen mit einem Speicher / naiven Phänotyp und weisen drei Markenzeichen der re-directed Spezifität. Erstens werden die genetisch veränderten T-Zellen spezifisch zu lysieren CD19 + Targets zweitens IFN-γ zu produzieren als Reaktion auf CD19 +-Zellen-Stimulator und drittens, proliferieren als Antwort auf CD19 + Feeder-Zellen, alle in einer CAR-abhängigen Weise 13,18. Unser Ansatz zur integraß ein CAR Transgens durch Elektrotransfer von nicht-viralen DNA-Plasmiden vom SB-System kann in ruhenden T-Zellen aus primären PB und UCB abgeleitet erfolgen. Wir und andere haben K562-Zellen genetisch modifiziert werden, um zu dienen als AAPC effizient fortpflanzen zu klinisch-ausreichende Zahl von T-Zellen zur Infusion 24,25. Die AAPC und Gewebekultur Umgebung (z. B. die Zugabe von IL-21) wurden modifiziert worden zu erzeugen patienten-und CD19-spezifische T-Zellen für Infusion nach hämatopoetischen Stammzell-Transplantation (Tabelle 1) 13,18-Donor stammt. Wir können CAR + T-Zellen aus PB einfach durch Venenpunktion erhalten, vermeidet Kosten, Beschwerden und Unannehmlichkeiten zu erhalten MNC von PB durch Apherese. Die Fähigkeit, eine große Anzahl von CAR + T-Zellen aus einer kleinen Anzahl von MNC ist besonders attraktiv für die Infusion von T-Zellen nach Transplantation allogener UCB. Die geringe Größe und Anonymität des Neugeborenen Spenders ausschließt re-Zugriff auf diese einzelnen zu einem späteren Zeitpunkt, und nur eine begrenzte Anzahl von geernteten MNC sind als Ausgangsmaterial für T-Zell-Herstellung zu vermeiden stören Hämatopoese. Weitere Fortschritte des Herstellungsprozesses sind derzeit im Gange, um einen hohen Durchsatz Elektroporation Gerät mit einem vollständig geschlossenen WAVE Bioreaktor gekoppelt Handling zu minimieren sind. In Summe werden die SB und AAPC ansprechend Plattformen an CD19-spezifischen CAR + T-Zellen, die geeignet ist, eine große Anzahl von genetisch veränderten T-Zellen, die alternative Zelloberflächen-TAA unter Berücksichtigung der cGMP erkennen kann generiert werden kann erzeugen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog-Nummer </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> DNA-Plasmid GFP (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (Set) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Phenol Kostenlose RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Fetal Bovine Serum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinantes menschliches IL-21 </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinantes humanes IL-2 (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Humane T-Zell-Kit (Nucleofector Solution) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 Reagent </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-konjugiertem Maus-mAk gegen humanes CD3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-konjugiertem Maus-mAk gegen humanes CD4 </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-konjugiertenMaus-mAk gegen humanes CD8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-konjugierten F (ab &#39;) 2-Fragment Ziegen-Antikörper gegen humanes Fcy </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Disposables </td></tr><tr><td> 12-Well-Platte </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2-Kolben </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Kulturbeutel </td><td> Vue Leben </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Zentrifugenröhrchen </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Ausrüstung </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom Bioscience </td><td> Cellometer Vision- </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend RT zentrifugieren </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Kontrollierter Geschwindigkeit Gefrierschrank </td><td> Planer </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> CIS bio international </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Expression von Molekülen (Endogene und Eingeführt) </td></tr><tr><td> Cell Line </td> &lt;td&gt; Common Name </td><td> Zelltyp </td><td> Moleküle exprimiert </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP mit Membran coexprimierten gebunden IL-15 </td></tr></tbody></table> Komplette Nährmedien (CCM) (bei ​​4 ° C für bis zu 30 Tage) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% GlutaMAX Durchflusszytometrie Buffer (bei ​​4 ° C für bis zu 30 Tage) PBS 2% FBS 0,1% Natriumazid </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

Die Potenz von klinischem T-Zellen kann durch die Kombination mit gentherapeutischen Immuntherapie, um eine biologische Produkt mit dem Potential für superior (i) Erkennung von Tumor-assoziierten Antigenen (TAA), (ii) nach der Infusion Persistenz, (iii) konstruieren verbessert werden Potenzial für Migration auf Tumorstellen, und (iv) Fähigkeit zur Effektorfunktionen im Tumor-Mikroumgebung recyceln. Die meisten Ansätze zur genetischen Manipulation von T-Zellen für die Anwendung beim Menschen entwickelt haben Retrovirus und Lentivirus für die stabile Expression von CAR 1-3 verwendet. Dieser Ansatz, obwohl konform mit den aktuellen Good Manufacturing Practice (GMP), kann teuer werden, da es sich auf die Herstellung und Freisetzung von klinischem rekombinanten Virus aus einer begrenzten Anzahl von Produktionsstätten verlässt. Der elektro-Übertragung von nichtviralen Plasmide ist eine attraktive Alternative zu DNA-Spezies seit Transduktion kann klinischer Güte bei etwa hergestellt werden 1/10 die Kosten recombinant GMP-grade-Virus. Um die Effizienz der Integration, die wir angepasst Sleeping Beauty (SB) Transposon und Transposase zur Anwendung am Menschen 4-8 verbessern. Unsere SB System verwendet zwei DNA-Plasmide, die aus einem Transposon kodierend für ein Gen von Interesse (zB 2. Generation CD19-spezifische CAR Transgen bezeichnet CD19RCD28) und einer Transposase (zB SB11), die das Transgen in Einsätzen TA Dinukleotid wiederholt 9-11 bestehen . Um klinisch ausreichende Zahl von T-Zellen genetisch veränderte verwenden wir K562-derived künstliche Antigen präsentierende Zellen (AAPC) (Klon # 4) modifiziert, um ein TAA (zB CD19) sowie die T-Zell-kostimulatorischen Moleküle CD86, CD137L, exprimieren ein membrangebundenen Version des Interleukin (IL) -15 (Peptid an modifiziertem IgG4 Fc-Region fusioniert) und CD64 (Fc-γ-Rezeptor-1) für das Laden von monoklonalen Antikörpern (mAb) 12. In diesem Bericht zeigen wir die Verfahren, die in complia vorgenommen werden kannnce mit cGMP um CD19-spezifischen CAR + T-Zellen für die Anwendung beim Menschen zu erzeugen. Dies wurde durch die synchrone elektrooptischen Transfer von zwei DNA-Plasmide, ein SB Transposon (CD19RCD28) und ein Transposase SB (SB11) durch Abrufen von stabilen Integranten von den jeder Tag-7-Additionen (Stimulationszyklus) von γ-bestrahlten AAPC gefolgt erreicht (Klon # 4) in Gegenwart von löslichen rekombinanten humanen IL-2 und IL-21-13. Typischerweise 4 Zyklen (28 Tage kontinuierliche Kultur) durchgeführt, um klinisch ansprechenden Zahlen von T-Zellen, die stabil exprimieren, die CAR generieren. Diese Methodik zur Herstellung klinischem CD19-spezifische T-Zellen können die T-Zellen aus dem peripheren Blut (PB) oder Nabelschnurblut (UCB) abgeleitet aufgebracht werden. Weiterhin kann dieser Ansatz genutzt werden, um T-Zellen zu verschiedenen Tumorarten durch Paarung der Spezifität des eingeführten CAR mit Expression des TAA, durch den CAR erfasst, auf der AAPC erzeugen.

Wir berichten, dass elektro-Transfer von DNA-Plasmiden und Vermehrung von T-Zellen auf γ-bestrahlten AAPC verwendet werden können, um klinisch-ansprechend Zahl von T-Zellen aus PB und UCB Verwendung beim Menschen abgeleitet erzeugen. Diese gentechnisch modifizierten T-Zellen exprimieren eine eingeführte CAR, der TAA CD19, unabhängig von Haupthistokompatibilitätskomplex erkennt. Die SB-abgeleiteten DNA-Plasmide zur Expression der (i) Transposon, ein 2. Generation CAR (CD19RCD28), daß Signale, die durch CD28 und CD3-ε 14, und (ii) Transposase, SB11 15, wurden zuvor 13, 16,17 . Die Plasmide in der aktuellen Studie wurden kommerziell von Waisman Klinische Biomanufacturing Facility (Madison, WI) hergestellt. Die AAPC (Klon # 4), von K562-Zellen (elterliche Linie von American Type Culture Collection), Co-express gewünschte T-Zell-co-stimulierende Moleküle (jeweils eingeführt Molekül 3 90% auf der Zelloberfläche von AAPC) abgeleitet,wie zuvor beschrieben 12. Hier zeigen wir, dass CD19-spezifische T-Zellen aus mononukleären Zellen (MNC) aus PB oder UCB Verwendung SB Umsetzung, um die CAR durch Zugabe von AAPC gefolgt numerisch zu erweitern die T-Zellen in einer CAR-abhängigen Weise (Figuren 1 einzuführen abgeleitet erzeugt werden konnte , 4) 13,18. Zehn Küvetten (2x10 7 MNC / Küvette) werden für jeden Empfänger unter Verwendung von 15 ug DNA-Plasmid (CD19RCD28/pSBSO) codiert Transposon (CAR) und 5 ug Plasmid-DNA (pCMV-SB11) codiert Transposase (SB11) elektroporiert. Die Anzahl der Küvetten können reduziert werden, wenn MNC begrenzen oder wieder für die Laborarbeit skaliert werden. Der Tag der Elektroporation wird als &quot;Tag 0&quot; Stimulation Zyklus # 1 definiert. Als Kontrollen für Durchflusszytometrie und Kulturbedingungen sind autologe T-Zellen Mock elektroporierten (ohne DNA-Plasmid) und numerisch auf γ-bestrahlten AAPC (Klon # 4), wurde mit OKT3 vorbelastet zu vernetzen CD3 auf T Zellen halten ausgebaut Proliferation. We routinely Beurteilung der Effizienz der Elektrotransfer und Lebensfähigkeit der T-Zellen am Tag nach der Elektroporation (Abbildung 2B). Die Expression von EGFP von Kontroll-DNA-Plasmid (bezeichnet pmaxGFP) und CAR in diesem ersten Zeitpunkt spiegelt Proteinexpression von der integrierten und episomale Plasmid. Typischerweise wird die Tage nach der Elektroporation messen wir EGFP-Expression bei ~ 60% und CAR Expression bei ~ 40% (2A) mit T-Zell-Lebensfähigkeit zwischen 40-50%. Rekursives Zugaben von γ-bestrahlten AAPC in Gegenwart von löslichen rekombinanten humanen IL-2 und IL-21 T-Zellen abzurufen stabil exprimieren CAR (CD19RCD28). CD3 neg. CD56 + NK-Zellen sind aus der Kultur unter Verwendung CD56-spezifischer paramagnetischen Kügelchen, wenn der Anteil dieser NK-Zellen ist ≥ 10%, und besonders, wenn der Prozentsatz von CAR auf den T-Zellen exprimiert niedrig ist abgereichert. Dies verhindert die schnelle Abreicherung Überwucherung von NK-Zellen, die mit der Fähigkeit der AAPC stört die proliferatio Sustainn der CAR + T-Zellen. Gelegentlich wird Depletion von NK-Zellen von CAR + T-Zellen in den beiden letzten Stimulationszyklen unternommen, aber dies führt ein Verlust der gewünschten Zellen durch Co-Expression von CD56 auf einem gewissen CAR + T-Zellen. Die T-Zellen wurden in einem geschlossenen System unter Verwendung funktionell Vue Leben Kulturbeutel letzten Tag 14 gewachsen. Eine Teilmenge der gentechnisch veränderten und vermehrt T-Zellen werden in der Regel am Tag 14 oder Tag 21 (Ende Stimulationszyklen Nr. 2 oder Nr. 3) der Co-Kultur auf AAPC kryokonserviert als Quelle der archivierten Material für zukünftige Analysen zu dienen und sein aufgetaut wenn unerwartete Probleme anschließend während des Herstellungsprozesses auftreten. T-Zellen sind in der Regel am oder um den 28. Tag der Kultur (Abbildung 3) geerntet, die routinemäßig ausdrückliche&gt; 90% CAR und&gt; 80% lebensfähig (Abbildung 2C, D). Wir haben zuvor gezeigt, dass nach vier Wochen Co-Kultur auf die durchschnittliche AAPC ausklappbaren Expansion von CD3 + T-Zellen beträgt ± 19.800 11.313 mit CA<html> R + Ausdruck, der 90% ± 7,5 13. Diese T-Zellen kryokonserviert und durchlaufen in-process-und Release-Tests, die auf die Sicherheit und das therapeutische Potenzial des hergestellten Produkts informiert. Release-Tests werden in Übereinstimmung mit Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA), um ein Zertifikat der Analyse vor der Infusion in Empfänger zu klinischen Studien zu generieren vorgenommen. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schritte skizziert den Prozess elektroporieren und propagieren CAR + T-Zellen aus PB und UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Charakterisierung von genetisch veränderten T-Zellen aus PB. (A) Expression von EGFP am Tag 0 des ersten Stimulationszyklus, um die Effizienz des Gentransfers zu beurteilen. Expression von CD19-spezifischen CAR (CD19RCD28) als mittels Durchflusszytometrie auf CD3 beurteilt +, CD8 + und CD4 + T-Zellen bei (B) etwa 24 h nach der Elektroporation und (C) 28 Tage nach Co-Kultur auf AAPC. Ähnliche Expression von CAR wurde mit UCB-derived T-Zellen beobachtet. (D) Kinetik der CAR Ausdruck. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ausbreitung von PB-derived CAR+ T-Zellen. Rate von numerischen Expansion von CD3 + und CAR + T-Zellen von PB durch wiederholte Kokultur abgeleitete auf γ-bestrahlten AAPC in Gegenwart von rekombinantem humanen löslichen IL-2 und IL-21. Pfeile zeigen die oben Zugaben von γ-bestrahlten AAPC daß den Anfang jedes Zyklus Stimulation markieren. UCB-derived CAR + T-Zellen zeigen eine ähnliche Raten von numerischen Erweiterung. <img alt="Abbildung 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Abbildung 4. Schema des Herstellungsprozesses mit SB und AAPC Systemen genetisch zu verändern und zu propagieren CAR + T-Zellen von PB und UCB abgeleitet. CD19-spezifische CAR + T-Zellen wurden durch Elektro-Transfer von SB-abgeleitete Plasmide supercoiled DNA und anschließende Co-Kultur erzeugten auf K562-derived AAPC (Klon # 4) in Gegenwart of rekombinanten humanen löslichen IL-2 und IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T Zellquelle </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> T-Zell-Infusion </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologe (Patient-derived) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Nach autologen hämatopoetischen Stammzelltransplantation </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Allogene (Donor-abgeleitet) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Allogene (Donor-abgeleitet) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Nach allogener Nabelschnurblut Transplantation </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabelle 1. Klinische Studien unter der Schirmherrschaft der FDA am MDACC um CD19-spezifischen CAR einzuflößen + T-Zellen vermehrt auf AAPC. T-Zellen erbracht werden spezifische durch erzwungene Expression von SB Transposons, die für ein 2 nd Generation CAR, bezeichnet CD19RCD28, dass Signale über CD28 und CD3-ε für CD19. ** Trial in Referenz 5 beschrieben.

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Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T-Zellen, die einen CD19-spezifischen, chimären Antigen-Rezeptor (CAR) als Entwicklung für die Behandlung von B-Zell-Malignomen im First-in-human Gentherapieprüfungen infundiert. Wir beschreiben genetische Modifikation von T-Zellen mit Hilfe der<em&gt; Dornröschen</em&gt; (SB)-System an CD19-spezifischen CAR und selektive Anzucht auf Designer-CD19 + künstlichen Antigen-präsentierende Zellen einzuführen.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K Aufrufe.  U.T. MD Anderson Cancer Center. T-Zellen, die einen CD19-spezifischen, chimären Antigen-Rezeptor (CAR) als Entwicklung für die Behandlung von B-Zell-Malignomen im First-in-human Gentherapieprüfungen infundiert. Wir beschreiben genetische Modifikation von T-Zellen mit Hilfe der Dornröschen (SB)-System an CD19-spezifischen CAR und selektive Anzucht auf Designer-CD19 + künstlichen Antigen-präsentierende Zellen einzuführen.

Serie: Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...