Die Qualität der vorbereiteten Einzelzellsuspension ist entscheidend, um qualitativ hochwertige und zuverlässige Ergebnisse für jede Einzelzell-Omics-Methodik zu erhalten. Und dieses Protokoll zeigt Ihnen, wie Sie Zellen schnell, sanft und robust aus selbst sehr anspruchsvollen Geweben isolieren können. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die stromlinienförmige Gewebeverarbeitung, die die Gewebedissoziation und Isolierung von Zellen aus einer großen Anzahl von Proben in kurzer Zeit mit perfekter Qualität ermöglicht.
Obwohl diese Methode für Maus- und menschliche Zähne entwickelt wurde, kann sie auch für andere extrazelluläre matrixreiche Gewebe angewendet werden, einschließlich Knorpel, Knochen oder dichtes Bindegewebe. Das Verfahren zur Isolierung von Zahnpulpa aus menschlichen und insbesondere Mauszähnen ist manuell eine Herausforderung. Wir raten jedem, dies zu testen, bevor die echten Experimente beginnen.
Halten Sie zunächst die eingeschläferte Maus hinter ihrem Kopf und schauen Sie auf den ventralen Aspekt ihres Kopfes, so dass der Schwanz weg zeigt. Entfernen Sie mit der kleinen und scharfen Schere schnell die Haut vom Unterkiefer, um den Unterkieferbogen, das Weichgewebe zwischen jeder Hälfte der Unterkiefer und die angrenzenden Gesichtsmuskeln freizulegen. Um einen tiefen Schnitt von jeder Seite des Unterkiefers zu machen, schneiden Sie zuerst durch den Masseter entlang der bukkalen Seite des Unterkiefers bis zum Kiefergelenk und schneiden Sie dann entlang des inneren Teils jeder Hälfte des Unterkiefers durch die Basis der Mundhöhle.
Schneiden Sie alle Muskeln und Bänder entlang des Unterkiefers bis zum Kiefergelenk sowohl von außen als auch von innen der Mundhöhle ab. Greifen Sie den Unterkiefer mit der gebogenen Spitzenpinzette und entfernen Sie ihn. Dann mit der Schere durch die Unterkiefersymphyse schneiden, um den sezierten Unterkiefer in zwei Hälften zu teilen.
Verwenden Sie ein industrielles Tuch mit niedrigem Fusselgehalt, um das verbleibende Weichgewebe von jeder Hälfte des Unterkiefers zu scheuern. Nachdem beide Teile des Unterkiefers gereinigt wurden, legen Sie sie in eine vorbereitete Petrischale mit eiskaltem HBSS. Für die Dissektion der Unterkieferschneidezähne entfernen Sie den Alveolarkamm mit allen drei Molaren und knacken sie den Unterkieferbogen quer an der Stelle, die der Position zwischen dem ersten und zweiten Backenzahn entspricht.
Ziehen Sie den Schneidezahn vorsichtig aus dem Rest der Zahnhöhle. Entfernen Sie bei Bedarf die verbleibenden Knochenfragmente, die am Schneidezähnen befestigt sind, mit einer Pinzette und einem Skalpell. Legen Sie die sezierten Schneidezähne in frisches eiskaltes HBSS.
Nachdem Sie das interessierende Gewebe seziert haben, legen Sie das sezierte Weichgewebe in ein Tröpfchen frischer eiskalter HBSS in der Mitte einer 10 Zentimeter langen Petrischale, die auf Eis aufbewahrt wird. Schneiden Sie das Gewebe mit einer runden Skalpellklinge Mit der Nummer 10 in die kleinstmöglichen Stücke. Nachdem Sie die Gewebestücke in der Mitte des Tröpfchens neu aggregiert haben, schneiden Sie die Gewebeaggregate wiederholt mit derselben Skalpellklinge ab und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Material ausreichend zerkleinert ist.
Übertragen Sie die zerkleinerten Gewebestücke mit einer Pipettenspitze von einem Milliliter in eine zuvor vorbereitete Verdauungsmischung. Platzieren Sie dann das Rohr in einem Winkel von 60 Grad und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 150 bis 200 U / min ein, um konstante Federbewegungen im Inneren des Rohrs zu gewährleisten und 15 bis 20 Minuten lang zu inkubieren. Alle drei bis vier Minuten während der Inkubation wird die Suspension mit einer Pipettenspitze von einem Milliliter kräftig titriert, um alle Klumpen aufzulösen.
Am Ende der Inkubation, nachdem die Zellsuspension zum letzten Mal titriert wurde, langsam eiskalte Waschlösung zu einem Endvolumen von 12 Millilitern hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand mit einer 10 Milliliter serologischen Pipette. Resuspendieren Sie das Pellet in der Waschlösung, um die Endkonzentration von 700 bis 1.200 Zellen pro Mikroliter zu erreichen.
Führen Sie die Zellsuspension durch ein 50 Mikrometer großes Zellsieb, um die verbleibenden Klumpen oder Verkalkungsteile zu entfernen und die Röhre bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis zu halten. Für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung laden Sie die Zellen dann in ein vorbereitetes Röhrchen. Laden Sie das Röhrchen in den Zellsortierer und legen Sie eine strenge Gating-Strategie fest, um Zelltrümmer, Dubletten und abgestorbene Zellen zu entfernen, wie im Textmanuskript beschrieben.
Zunächst wurden die CD45-Antikörperfärbung und die anschließende FACS-Analyse verwendet, um die Anzahl der Immunzellen in der endgültigen Einzelzellsuspension zu klären. Als komplementäre Methode wurde die Gesamtzahl der CD45-positiven Immunzellen in den Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten analysiert. Mit FACS wurden 14,44% CD45-positive Zellen identifiziert.
Die Analyse von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten zeigte 10,9% der CD45-exprimierenden Zellen und die Abnahme der Zellen in Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten könnte durch zusätzliche Schwellenwerte während der Sequenzierungsanalyse verursacht werden. Die wichtigsten Dinge sind, schnell zu sein und dieses Gewebe oder diese Zellen auf Eis zu halten, wann immer es möglich ist. Die Anzahl der isolierten Zellen kann sehr gering sein, insbesondere während der Maus-Molaren-Isolierung.
Vermeiden Sie Zellverlust. Die Verkürzung der Zeit der Einzelzellisolierung ist sehr wichtig für den Erfolg aller Einzelzellexperimente. Und diese spezifische Methode ermöglichte es wirklich, diese Zeit zu verkürzen und den Weg für einen hochwertigen Dentalzelltyp für Maus und menschliche Systeme zu ebnen.
