Dieses Video zeigt die In-vitro-Induktion menschlicher Zahnpulpa-Stammzellen in Richtung Pankreaslinien. Stammzellen bieten eine alternative Behandlung bei vielen Krankheiten, einschließlich Diabetes Typ I, die Biolaging von Betazellen verursachen. Die Transplantation von insulinproduzierenden Zellen wird die neue vielversprechende Methode sein, um lebenslang zu verursachen.
In diesem Video werden zwei Ansätze zur Erzeugung insulinproduzierender Zellen, einschließlich des integrativen und nicht-integrativen Induktionsprotokolls, beschrieben. Und in diesem Teil wird das Integrationsprotokoll zur Induktion insulinproduzierender Zellen aus menschlichen Zellpulpa-Stammzellen erklärt. Für das Induktionsprotokoll ist das zum Mischen des natürlichen Pankreasentwicklungsprozesses.
Um die natürlichen und die funktionellen insulinproduzierenden Zellen zu erhalten. Zur Erzeugung von insulinproduzierenden Zellen aus mesenchymalen Stammzellen wie Dentalpulpa-Stammzellen wird das mehrstufige Induktionsprotokoll verwendet. Mesenchymale Stammzellen werden in den Wörtern definitives Endoderm, Pankreasendoderm, endokrine Pankreaszellen und dann Pankreas-Betazellen bzw. Insulin produzierende Zellen verwendet.
Um die Zellen zu induzieren, wird der dreistufige Induktionsansatz als Backbone-Protokoll verwendet. Das integrative Protokoll verwendete die Überüberlaufzeit des essentiellen Pankreas-Transkriptionsfaktors PDX-1 durch menschliche Zahnpulpa-Stammzellen. Dann wird das PDX-1 über exprimierte Stammzellen mit einem dreistufigen Differenzierungsprotokoll weiter induziert.
Das Pankreas-Differenzierungspotenzial durch das integrative Protokoll wird mit dem nicht-integrativen Protokoll verglichen, wie in der Animation veranschaulicht. Diese Idee wurde unter dem genehmigten Protokoll vom Human Research Ethic Committee, Fakultät für Zahnmedizin, Chulalongkorn University mit der informierten Zustimmung der Patienten durchgeführt. Dieses Protokoll begann mit dem Überablauf von PDX-1.
Für die Transduktion werden menschliche Zellpulpa-Stammzellen in Teilen von 2 bis 5 mit 70-80% Konfluenz verwendet. Zellen werden trypsinisiert und gezählt. Dann werden eine Million Zellen auf das Transfektionsgefäß gesächtet und über Nacht inkubiert.
24 Stunden später wird dem kultivierten Gefäß ein frisch zubereitetes Antivirenprogramm mit PDX-1-Gen entsprechend der gewünschten Infektionsmultiplik hinzugefügt. Die transfizierten Zellen werden dann 24 Stunden im Inkubator aufbewahrt. Dann wird frisches kulturiertes Medium gewechselt und für weitere 48 Perioden beibehalten.
Die Morphologie der transfizierten Zellen wird vor der Verwendung für den weiteren Induktionsschritt überprüft. Die menschlichen Zahnpulpa-Stammzellen mit PDX-1 über Exspiration werden dann Tryptimisiert und im ersten Pankreasinduktionsmedium, sogenanntem Medium A.In diesem Schritt wird ein niedrig anhaftendes kultiviertes Gefäß verwendet. Morphologie von PDX-1 über exprimierte menschliche Zahnpulpa-Stammzellen am Tag 3 nach der Beobachtung von Medium A-Induktion.
Zellen mit guter Morphologie werden dann für weitere Induktionsschritte verwendet. Im nächsten Schritt wird das zweite Induktionsmedium, das sogenannte Medium B, dem kultivierten Gefäß zugesetzt. Die Morphologie von PDX-1 über exprimierten menschlichen Zahnpulpa-Stammzellen am zweiten Tag nach mediumr Induktion wird beobachtet.
Zellen mit guter Morphologie werden dann für den weiteren Induktionsschritt verwendet. Im nächsten Schritt wird dem kultivierten Gefäß das dritte Induktionsmedium, das sogenannte Medium C, zugegeben. 5 Tage später wird die Zellmorphologie beobachtet.
Zellkolonien werden zur weiteren Analyse gesammelt. Einschließlich Koloniemorphologie und -größe, Pankreas-Genmarkerexpression und funktioneller Eigenschaft in Bezug auf Glukose-stimulierte C-Peptid-Sekretion oder GSCS-Assay. Für den nicht-integrativen Induktionsansatz wird das bereits erwähnte dreistufige Induktionsprotokoll verwendet.
Eine Million Zellen werden im mittleren A wieder aufgehängt und auf einem niedrigen Bindungskulturgefäß sitzen. Dann drei Tage lang kultiviert. Nach der Überprüfung der Morphologie werden am dritten bzw. fünften Tag eine Reihe von Induktionsmedien, einschließlich Medium B und C, dem kultivierten Gefäß hinzugefügt.
An Tag 10 wird die Zellmorphologie beobachtet. Zellkolonien werden für weitere Analysen gesammelt, einschließlich Koloniemorphologie und -größe, Pankreasgenmarkerexpression und funktioneller Eigenschaften in Bezug auf Glukose-stimulierte C-Peptid-Sekretion oder GSCS-Assay. Die Ergebnisse beider Induktionsprotokolle werden in beiden Protokollen verglichen.
Menschliche Zahnpulpa-Stammzellen sind in der Lage, seit dem ersten Tag der Induktion kolonieähnliche Strukturen zu bilden. Das Aussehen der Kolonien ist rund und dicht. Alle Kolonien schwimmen während der gesamten Induktionszeit in den Kulturgefäßen.
Die Gesamtkoloniezahl des integrativen Induktionsprotokolls ist etwas höher als die der nicht-integrativen Induktion. Die Evolution unter koloniegroßer Prozentsatz zeigt einen vorteilhaften Trend, von der Bildung kleiner bis mittelgroßer Kolonien bei integrativer Induktion, die wichtig ist, um den nekrotischen Kern innerhalb der Kolonie zu reduzieren. Die Pankreas-Genmarkeranalyse ergab, dass das integrative induktive Protokoll die Kolonien mit hoher Exspiration von Pankreasmarkern, einschließlich MAP-A, GLUT-2, Insulin und GLP-1R, ergibt, was auf die Differenzierung zu den gemessenen insulinproduzierenden Zellen hindeutet.
Für die Funktion Glukose ist die C-Peptid-Sekretion wichtig. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Induktionsprotokolle die Kolonien mit einer guten Reaktion auf Glukoseherausforderungen ergeben. Aus dieser Studie sind beide Pankreasinduktionsprotokolle in der Lage, die insulinproduzierenden Zellen in vitro in Bezug auf pankreasmarker-Exspiration und funktionelle Eigenschaft zu erzeugen, die Protokolle zeigen eine bessere Qualität der insulinproduzierenden Zellbildung.
Dies deutet auf die Trends menschlicher mesenchymaler Stammzellen wie die Anwendung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen in der stammzellbasierten Diabetesbehandlung in naher Zukunft hin.
