Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Science and Engineering Research Council of Canada, um XAC und AFP unterstützt

Ein. Herstellung von Materialien für die Extraktion <ol><li> Herstellung von Zellen <ol><li> Saatgut Gewebekulturzellen am säurebehandelten Deckgläser für mindestens einen Tag vor dem Experiment. Wir verwenden COS-7 oder U2OS, da diese beiden Zelllinien robuste Produktion von sekretierten Proteins aufweisen und haben einen gut definierten ER. Beachten Sie, daß eine hohe Extraktionseffizienz zu erreichen, Zellen sollten nicht mehr als 80% Konfluenz auf dem Deckglas auf dem Tag des Experiments. </li><li> Wenn ein bestimmter exogenen mRNA untersucht wird, werden die Zellen transfiziert einen Tag nach Impfen mit Plasmide, die das Gen von Interesse unter Verwendung von Standardverfahren Transfektionsprotokolle. Die Zellen werden dann ließ man die mRNA für mindestens 18 Stunden vor der Extraktion auszudrücken. </li></ol></li><li> Behandlung der Zellen mit Translation Inhibitoren <ol><li> Um die Wirkung der intakten Ribosomen zur Aufrechterhaltung von mRNAs Assoziation mit dem ER testen, können Zellen mit Übersetzung Inhibitoren, die die Assoziation stören behandelndenRibosomen von 11, mit der mRNA. </li><li> Inhibitoren der Translationsinitiation wie homoharringtonin (HHT), Pactamycin, oder 2 - (4-Methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamid (MDMP), verhindern, dass neue Ribosomen aus Assoziieren mit dem Transkript, während gleichzeitig in Eingriff zu Ribosomen Vollständige Übersetzung 12-14. Da der Translationsrate für die meisten Proteine ​​in Säugerzellen ist das 5 Aminosäuren pro Sekunde, unabhängig von Codonverwendung oder mRNA Länge 15 soll eine Behandlung von 30 min klar Ribosomen off von Nachrichten mit offenen Leserastern, solange 27.000 Nukleotiden (für Proteine ​​kodieren, Solange 9000 Aminosäuren). </li><li> Inhibitoren wie Puromycin fördern die vorzeitige Ausstoßen der entstehenden Kette unterbrechen und somit Polysomen 12. Jedoch vollständig stören die Assoziation von Puromycin behandelten Ribosomen mit der mRNA, muss Magnesium Chelatoren wie EDTA zum Digitonin Extraktionspuffer 11 hinzugefügt werden. </li> &lt;li&gt; In diesem Experiment werden die Zellen mit 200 pM Puromycin, 5 uM HHT, oder Kontrollmedium für 30 min vor der Extraktion behandelt. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Digitonin Extraction Buffer. ER-lokalisierte mRNAs ohne Behinderung der freien (dh cytoplasmatischen, nicht-ER-assoziiert) Transkripte visualisieren, wir selektiv permeabilisieren der Zelle mit Digitonin, ein Steroid Glykosid, das bevorzugt in Wechselwirkung mit 3β-hydroxysterols. Bei niedrigen Konzentrationen, Digitonin selektiv permeabilisiert Abschnitte der Plasmamembran, was &#39;Undichtigkeit&#39; 16. Im Gegensatz dazu werden die ER-Membran und Kernhülle, die arm an Cholesterin sind, intakt gelassen 16,17. <ol><li> Digitonin (Sigma Aldrich) Pulver wird in destilliertem Wasser bei 5% Gewicht / Volumen gelöst und diese Stammlösung wird in kleine Volumina aliquotiert und bei -20 ° C. Nach unserer Erfahrung nimmt mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen, die Effizienz des gelösten Digitonin. </li><li> Eine Stammlösung von10x CHO-Puffer (1x Arbeitslösung Konzentration: 115 mM KAc, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2, 2 mM EGTA und 150 mM Saccharose) mit RNase-freie Reagenzien hergestellt und bei -20 ° C. Eine Arbeitslösung (1x Puffer CHO) wird durch Verdünnen der Stammlösung mit RNase-freiem Wasser hergestellt und kann bei 4 ° C gelagert werden </li></ol></li></ol> 2. Digitonin Extraction <ol><li> Vorbereiten Extraction Lösungen <ol><li> Ein Heizblock mit einer flachen Oberfläche vorgewärmt wird auf 40 ° C und bei dieser Temperatur während der Extraktion. </li><li> Um eine flache Arbeitsfläche, die frei ist RNase bilden, wird der Heizblock mit etwas Wasser und überlagert mit einem frischen Stück Parafilm M (Bemis Company, Inc) befeuchtet. Luftblasen zwischen der Folie und Parafilm Heizblock werden unter Verwendung von RNase-freier Handschuhe und Kimwipes (VWR) geglättet. </li><li> 1x CHO Puffer wird auf 37 ° C durch Inkubation in einem Wasserbad erwärmt. </li><li> 6-Well-Platten verwendet werden, um zu waschenund fixieren die Zellen. Jede Zeile 3 Brunnen ist für ein Deckglas verwendet. Auf die ersten beiden Wells in der Reihe, wurde mit 2 ml erwärmten CHO-Puffer zugegeben. Zur letzten gut, 2 ml der Fixierungslösung (PBS + 4% Paraformaldehyd (Electron Microscope Sciences)) zugegeben. Dieses Fach kann in der 37 ° C-Inkubator aufbewahrt werden, bis die Zellen bereit für die Extraktion sind. </li><li> Digitonin Extraktionslösung wird durch Verdünnen der Lösung auf Lager Digitonin 0,025% mit warmem CHO Puffer unmittelbar vor der Verwendung hergestellt. Wiederum beachten, dass für Puromycin-behandelten Zellen, der Extraktionspuffer müssen zusätzlich 20 mM EDTA, um effizient zu stören Ribosomen 11. Drops von 100 ul der Extraktionslösung auf dem Parafilm bedeckten Heizblock unmittelbar vor Extraktion platziert. </li></ol></li><li> Digitonin Extraction and Cell Fixation <ol><li> Entfernen der Zellen aus dem 37 ° C Inkubator. </li><li> Während des Extraktionsvorgangs werden Deckgläser mit Hilfe der Pinzette jewler manipuliert. Mitdie Zange abholen Deckglas und tauchen sie in die erste und dann die zweite auch mit CHO Puffer des Wachstumsmediums waschen. </li><li> Schnell abtupfen überschüssige Puffer von der Rückseite des Deckglases mit einem Kimwipe und sofort setzen das Deckglas, Zell-Seite nach unten auf der Extraktionslösung. </li><li> Nach 10 sec, abholen Deckglas mit der Zange und sofort übertragen, Zell-Seite nach oben, der gut mit der 4% Paraformaldehyd Fixierung Puffer. </li><li> Lassen Sie die Probe inkubieren in Fixativ für mindestens 15 min bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Vorbereitung der extrahierten Control Cells. Um die gesamte Menge an mRNA im Zytoplasma ist es eine gute Idee, einen extrahierten Kontrollprobe vorzubereiten bestimmen. <ol><li> Zellen auf Deckgläsern gewachsen sind wie oben hergestellt (siehe Abschnitt 2.2), außer dass der Digitonin Extraktionsschritt (2.2.3) übersprungen wird. </li><li> Nach der Fixierung müssen die un-extrahierten Zellen in PBS permeabilisiert werden + 0,1% TritonX-100 15 min bei Raumtemperatur. </li></ol></li></ol> 3. FISH Färbung <ol><li> Entwerfen Sonden zur Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung <ol><li> Der primäre Sequenz der mRNA von interessierten gefaltet wird mittels RNA Sekundärstruktur Vorhersage-Software, wie RNAstructure 5,0 18. Die mRNA-Falten sind visuell beurteilt, um einen Bereich von etwa 50 Nukleotiden, die frei von größeren Sekundärstrukturen ist identifizieren. </li><li> Der umgekehrte Komplement dieser Region mit einer Alexa546 Fluorophor gebunden an das 5&#39;-Ende der Sonde (erworben von Integrated DNA Technologies) synthetisiert. </li><li> Die Sonde wird mit RNase-freiem Wasser auf ein Lager Konzentration von 100 uM, die bei -20 ° C gelagert werden kann verdünnt </li></ol></li><li> Färbung mit FISH-Sonden <ol><li> Beachten Sie, dass, obwohl die Digitonin-extrahierten Zellen nicht bedürfen weiterer Permeabilisierung Behandlung dieser festen Proben mit 2 ml 0,1% Triton X-100 in verdünntPBS für 15 min bei Raumtemperatur vor dem FISH-Färbung, hilft, das Hintergrundsignal zu reduzieren. </li><li> Die Objektträger werden dann zweimal mit PBS gewaschen, um restliche Paraformaldehyd oder Triton X-100 zu entfernen. </li><li> Die Zellen werden dann zweimal mit 25% bis 60% Formamid in 1X Natriumzitrat-Puffer (150 mM NaCl und 15 mM Natriumcitrat) gewaschen. Im Allgemeinen sind für spezifische FISH-Sonden, die 50-60 Nukleotide lang sind, 60% Formamid verwendet, sondern auch für Poly (A) mRNA Färbung mit Oligo (dT) FISH-Sonde, die Höhe der Formamid wird auf 25% reduziert. </li><li> Um die Färbung Kammer herzustellen, wird der Boden einer 150 mm Petrischale mit Wasser bedeckt und ein Stück Parafilm auf dem Wasser schwamm. Das Wasser wird durch Drehen der Teller über entfernt, wodurch es dem Parafilm um zum Boden der Schale haftet. Luftblasen werden manuell mit Kimwipes entfernt. </li><li> Für jedes Deckglas auf angefärbt werden, pipettieren 100 ul Tropfen der Hybridisierungslösung, die FISH-Sonde von Interesse auf die parAFILM in der Färbung Kammer. Das Lager FISH-Sonde wird mit 25% bis 60% Formamid in einem Hybridisierungspuffer (1x SSC, 100 mg / ml Dextransulfat, 1 mg / ml Hefe-tRNA, 5mM Vanadyl Ribosid Komplex, 25-60% Formamid) auf eine Arbeitskonzentration von verdünnt 0,2 uM. Man beachte, dass die Menge des für das jeweilige Formamid Sonde verwendet sollte optimiert werden und ist in der gleichen Konzentration wie in dem SSC-Waschpuffer (siehe Schritt 3.3.3) vorliegt. </li><li> Das Deckglas ist Zellenseite verdeckt auf die Lösung in der FISH-Färbung Kammer und inkubiert für 5-24 Stunden bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer wie die Gewebekultur-Inkubator. </li></ol></li><li> Wasch-und Montage der gefärbten Proben <ol><li> Um eine RNase-frei Waschplatz vorzubereiten, legte sich ein Streifen Parafilm auf einer Ebene ebenen Fläche, wie einem Labortisch. Um sicherzustellen, dass die Parafilm flach, nass die ebene Fläche ist, legen die Parafilm oben und entfernen Sie manuell alle Luftblasen mit Kimwipes. </li><li> Die Färbung Kammerentfernt aus dem Inkubator und auf einer ebenen Fläche. Die Deckgläser werden dann durch Pipettieren etwa 500 ul FISH Waschpuffer nahe der Kante jedes Deckglas flotiert. Die Lösung wird in-zwischen dem Deckglas und dem Parafilm durch Kapillarwirkung gezogen werden. </li><li> Für jedes Deckglas wird 1 ml Waschpuffer (1x SCC mit 25-60% Formamid, siehe Schritt 3.3.3) auf den Waschplatz Parafilm (siehe Schritt 3.4.1) pipettiert. </li><li> Verwendung einer Pinzette werden die Deckgläser aus der Kammer entfernt und Anfärben jedes auf den Tropfen Waschpuffer gegeben und inkubiert bei Raumtemperatur für 5 min. Der Waschvorgang wird 3 mal wiederholt. </li><li> Glasträger mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet, mit Kimwipes. </li><li> Für jedes Deckglas wird 25 ul der Montage-Lösung (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) auf den Objektträger pipettiert. Beachten Sie, dass diese Lösung 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), die DNA-Flecken enthält und ermöglicht die Visualisierung von Kernen. </li><li> Using Pinzette und Kimwipes wird die Rückseite des Deckglases getrocknet und überschüssiges FISH Waschpuffer wird abgetupft, ohne Trocknen der Probe. Jedes Deckglas wird dann Zelle nach unten gelegt, auf den Rückgang der Montage Lösung. </li><li> Proben werden dann montiert gekennzeichneten und Speicher sein bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Imaging und Quantifizierung <ol><li> Imaging <ol><li> Ein Epifluoreszenzmikroskop wird verwendet, um Bild die Zellen nach FISH-Färbung. Die transfizierte Zelle kann aus transfizierten Zellen durch helle Fluoreszenz-Signal in den entsprechenden Kanal unterschieden werden. Idealerweise wird jede erworbenen Feld enthalten auch einen untransfizierten Zelle verwendet, um die Hintergrund-Fluoreszenz für die Quantifizierung zu bestimmen. </li><li> Für jedes Feld Bilder der FISH und DAPI-Kanal erworben werden. Darüber hinaus, wenn die Zellen mit Proteinmarker gemeinsam gefärbt wird ein Bild des Immunfluoreszenz Kanal auch erworben. Beachten Sie, dass Digitonin Extraktion kann auch verwendet werdenER-gebundenen Ribosomen und Proteine ​​11 visualisieren. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensitäten zwischen Halbbildern verglichen werden kann, sollte die Belichtungszeit für jeden Kanal bleibt für jeden Satz von Experiment konstant. </li><li> Erneut, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensitäten zwischen den Zellen auf verschiedenen Deckgläser verglichen werden können, sollten die Tag-zu-Tag Veränderungen in epiluminescence Intensität oder Verfall in der FISH-Signal durch bildgebende alle der Deckgläser in einer einzigen Sitzung minimiert werden. </li></ol></li><li> Quantifizierung. Um die Menge an mRNA, die an der ER lokalisiert ist quantifizieren, verwenden wir Nikon NIS Element Software. Aber auch andere Bildanalyse-Software wie ImageJ verwendet werden. <ol><li> Mit der Nikon NIS ELEMENT Bild-Analyse-Tool, sind die Zelle Peripherie und der Kern als separate Region of Interest (ROI) skizziert. </li><li> Für jeden ROI, der Fluoreszenzintensität (I T für die gesamte Zelle Intensität und I N für dienuklearen Intensität) und die Fläche (A T und A N) werden aufgezeichnet und exportiert in eine Excel-Tabelle. </li><li> Für jedes Bild wird der Hintergrund fluoreszierende Intensität (I B) durch die Erfassung der Intensität einer nicht-transfizierten Zelle bestimmt. Wenn Poly (A) mRNA analysiert wird, wird ein zellfreier angewählt. </li><li> Die Gesamtmenge des ER (in extrahierten Zellen) oder cytoplasmatische (in nicht extrahierten Zellen) Fluoreszenz wird durch die Formel berechnet wird: [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B] </li><li> Die Kernfärbung Intensität kann ebenfalls berechnet werden und als interne Kontrolle zwischen verschiedenen Behandlungen. Da Kerne nicht durch Digitonin Behandlung 17 oder Ribosomen Unterbrechungen 11 betroffen sind, sollte die Menge des nuklearen mRNA konstant zwischen diesen Behandlungen. Um Kernfluoreszenz die folgende Formel verwendet wird berechnet: [A N] [I N - IB] </li><li> Der prozentuale Anteil der zytoplasmatischen mRNA, die den ER-bezogenen ist, kann durch Ermitteln des Durchschnitts ER Fluoreszenz von 30-40 extrahierten Zellen (siehe 4.2.4) von der durchschnittlichen zytoplasmatischen Fluoreszenz 30-40 extrahierten Zellen (siehe wieder 4.2.4) dividiert werden . Es ist wichtig, dass die extrahierten und nicht extrahierten Zellen hergestellt werden, gefärbt und abgebildet sind. </li></ol></li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Lokalisierung von mRNAs zu verschiedenen subzellulären Seiten, durch das Zusammenspiel von Transkripte mit mRNA Lokalisation Proteinen ist ein weit verbreitetes Phänomen wichtig für die richtige Sortierung von Proteinen an ihren endgültigen Bestimmungsort und für die Feinabstimmung der Genexpression zu den lokalen Anforderungen an eine subzelluläre Region 19,20. Verwendung der hier beschriebenen Assays können wir die Frage, ob mRNAs, die sekretorische Proteine ​​kod...

In Eukaryoten sekretiert mRNA und Membranproteine ​​können zum ER co-translational von dem Signalerkennungspartikel 1,2 ausgerichtet sein und kann auf der ER aufrechterhalten werden über die direkte Wechselwirkungen zwischen Ribosomen und translocons während der Übersetzung 3,4. Doch ob mRNAs können gezielte und gepflegt werden am ER unabhängig von entweder Ribosomen oder Übersetzung war bis vor kurzem unklar. Frühere Studien haben versucht, anzusprechen, ob es translation-unabhängige mRNA zusammen mit dem ER über zelluläre Fraktionierung Techniken. Da harten chemischen Bedingungen waren erforderlich, um Ribosomen aus ER abgeleitete Vesikel, die die potenziell heikle mRNA-ER Vereins stören könnte distanzieren, waren diese Studien nicht schlüssig, den Nachweis für 5-8 und gegen 9,10 ribosomalen-unabhängige Verankerung der mRNA in die Notaufnahme . Um diese Probleme zu umgehen, haben wir einen Prototypen entwickelt,col zu isolieren und Bild ER-gebundenen mRNAs. Dieses Verfahren beinhaltet eine milde Extraktionsbehandlung, die effektiv entfernt alle cytoplasmatischen Inhalt der Zelle (einschließlich nicht-gebundenen mRNAs ER) bei gleichzeitigem Erhalt der Morphologie und ER alle verbundenen Moleküle. Mit diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass eine Untergruppe von mRNAs werden gezielt und dann beibehalten am ER unabhängig von Ribosomen oder Translation 11.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

In Eukaryoten meisten der messenger RNA (mRNA), die sezernierte und Membranproteinen an die Oberfläche des endoplasmatischen Reticulums (ER) lokalisiert codieren. Jedoch kann die Visualisierung dieser mRNAs Herausforderung sein. Dies gilt insbesondere, wenn nur ein Bruchteil der mRNA ist ER-assoziierte und deren Verteilung zu dieser Organelle durch nicht anvisierten (dh &quot;frei&quot;) Transkripte behindert. Um ER-assoziierten mRNAs überwachen, haben wir ein Verfahren, bei dem Zellen mit einer kurzen Belichtungszeit eine Digitonin Extraktionslösung, die selektiv permeabilisiert die Plasmamembran behandelt werden entwickelt und entfernt somit die zytoplasmatischen Inhalt, während gleichzeitig die Integrität des ER . Wenn dieses Verfahren mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) gekoppelt ist, kann man klar zu visualisieren ER-gebundenen mRNAs durch Fluoreszenzmikroskopie. Über dieses Protokoll der Grad der ER-Verband entweder lose Poly (A)-Transkripte oder bestimmte mRNAs beurteilt werden kannund sogar quantifiziert. Bei dem Verfahren kann man mit diesem Assay, um die Natur des mRNA-ER Wechselwirkungen zu untersuchen.

Um den Prozentsatz der mRNA, die den ER-assoziierten ist, COS-7-Zellen, die mit Plasmiden, die die plazentale alkalische Phosphatase (ALPP) oder Cytochrom P450-8B1 (CYP8B1) wurden entweder mit Digitonin extrahiert und dann fixiert oder direkt befestigt enthaltenen transfiziert wurden bestimmen (siehe Abbildung 1, siehe &quot;unextrahierten Ctrl&quot; auf &quot;Extrahierte Ctrl&quot;). Die nichtnuklearen Fluoreszenz wurde in beiden Proben und die Fraktion von ER-assoziierten mRNA wurde ...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen, gefolgt<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung entweder lose Poly (A) mRNA oder spezifischen Transkripte zu erfassen.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

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Biology

14.2K Aufrufe.  University of Toronto. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen, gefolgt In situ Hybridisierung entweder lose Poly (A) mRNA oder spezifischen Transkripte zu erfassen.

Serie: Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Forschung

Biologie

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

Isolierung von mRNAs Verbunden mit Hefe-Mitochondrien Study Mechanismen der lokalisierten Übersetzung

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...