Wir danken John Darga der MGH DNA-Core für die Erstellung des DNA-Screening-Bibliothek. Christopher Chigas von Perkin Elmer unschätzbare Unterstützung für unsere Wallac 1420 Luminometer. Steven Ciacco und Martin Thomae von Agilent unterstützte die Bravo-Roboter. Wir danken Ron Johnson und Steve Titus am NIH für die großzügige Bereitstellung ihrer Dual-Luciferase-Assay-Protokoll glühen.

Für eine experimentelle Übersicht siehe Abbildung 1. 1. Bereiten Reporter Plasmide, die die Alpha-Synuclein Promoter Regulatorischen Elemente des alpha-Synuclein-Gen (Fig. 2) erstrecken etwa 10 kb, von der stromaufwärts NACP (Nicht-A-beta-Peptid Amyloid-Komponente) 1,2-Dinukleotid-Repeat-Sequenz durch Introns 2 3. Wir schließen einen Teil dieser Region unsere Reporter-Konstrukt. Wir fanden, daß Plasmide, die Intron 2 erforderliche spezielle Verfahren für das Wachstum, wie unten beschrieben. Die Luciferase-Plasmiden pGL4.10 und pGL4.75 (Fig. 3), sind im Handel von Promega und kann unter Verwendung von herkömmlichen molekularbiologischen Protokollen vermehrt werden. <ol><li> Verstärken die zwei Komponenten des Alpha-Synuclein-Promotor in getrennten PCRs mit dem Rezept in Tabelle 1 und der Primer in Tabelle 2. </li><li> Verify PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel und sauber unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) unter Elution in 50 &amp;mgr; l TE (Tris-EDTA). Bewahren Sie die eluierten 0,9 kb-Fragment bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung. </li><li> Verdauen das gesamte Volumen des 3,4 kb PCR-Fragment sowie 5 ug pGL4.10, mit SacI und XhoI. Behandeln Sie den Vektor mit Kalbsdarm-Alkalische Phosphatase (Roche) und Gel reinigen mit dem Purelink Schnell Gel Extraction Kit (Invitrogen). </li><li> Ligation des Fragments und Vektor Verwendung von T4-DNA-Ligase (NEB). Reinigen Sie das ausgefüllte Reaktion unter Verwendung des Purelink Micro PCR-Kit (Invitrogen) unter Elution in 10 ul TE-Puffer. </li><li> Transformations 2 ul des gereinigten, Ligation in 20 ul ElectroMAX Stbl4 kompetente Zellen (Invitrogen) und Elektroporation gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schütteln in einem 30 ° C Inkubator bei 225 Upm für 90 min. Verbreiten 2 Volumina auf LB-Platten, die 100 mg / ml Ampicillin und Inkubieren bei 30 ° C für 2 Tage. </li><li> Mit einem Zahnstocher, wählen Sie 4-6 kleine Kolonien für die Impfung in 2 ml TB (Terrific Broth). Wachsen diese Miniprep Kulturen in ein 30 º C-Schüttler O / N. </li><li> Reinige Plasmid-DNA aus 1,5 ml jeder Kultur Miniprep mit dem Purelink HiPure Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen). </li><li> Verdauen die Minipräparationen mit BamHI und Elektrophorese auf einem Agarose-Gel. Die richtige Klon sollte Fragmente von 2,8 kb und 4,9 kb zu produzieren. </li><li> Restreak die verbleibende Miniprep-Kultur von der richtigen Klons auf eine frische LB (Luria Broth)-Platte und wachsen bei 30 ° C für 2 Tage. </li><li> Wählen Sie einen kleinen Kolonie und impfen 1,5 ml TB Starterkultur. Schütteln Sie O / N bei 30 ° C Lassen Sie sich nicht die Starterkultur zur Sättigung wachsen. </li><li> Verdünnt das gesamte Starterkultur in 150 ml vorgewärmtem TB und schüttelt bei 30 ° C für 2 Tage. Bevor Sie mit dem nächsten Schritt, verwenden Sie 1,5 ml dieser Kultur für eine zusätzliche Miniprep und Verdauung zu bestätigen, dass der Klon nicht während replicati mutieren<html> auf. </li><li> Reinige Plasmid-DNA aus den verbleibenden Kultur mit dem Purelink HiPure Maxiprep Plasmid-Kit (Invitrogen). Erwartete Erträge dieses Zwischen Plasmid sind 50-150 g pro 150 ml der Kultur. </li><li> Auftauen 0,9 kb-Fragment in Schritt 1.2 eingefroren. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.12, die 0,9 kb-Fragment in die Zwischen Plasmid klonen, zu verdauen, statt mit KpnI und SacI. Ligats, umzuwandeln, wählen Sie, und wachsen für Maxipreps wie oben. Digestion mit BamHI sollten Fragmente von 5,8 kb und 2,8 kb ergeben. Dies ist das Plasmid, das für den Bildschirm verwendet werden. </li></ol> 2. Bereiten 293T-Zellen, Reporter Plasmide und DNA-Bibliothek für Screening 293T-Zellen werden zunächst in 96-Well-Platten transfiziert und am folgenden Tag. Reporter-Plasmide und DNA-Bibliothek werden in 96-Well-Platten verdünnt. Wir erhaltenen Platten der Transfektion-Grade-Bibliothek-DNA aus der DNA-Core am Massachusetts General Hospital (bekommen = &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). Dieses Protokoll transfiziert eine einzelne Bibliothek Platte in zwei identische Platten von 293T-Zellen (Abbildung 1), sollten also 2 Platten von Zellen für jede Bibliothek Platte abgeschirmt werden ausgesät werden. Hinweis: Wachsen Zellen in Medium ohne Phenolrot oder Antibiotika, da diese nicht mit den Luciferase-Assays und erhöhen Toxizität während der Transfektion sind. <ol><li> Für jede Bibliothek Platte, resuspendieren trypsiniert 293T Zellen auf eine Konzentration von 1,5 x 10 5 Zellen / ml in DMEM, das 14% FBS gescreent werden. Gießen Sie in einen sterilen Behälter (Axygen). </li><li> Setzen Sie den Behälter, 2 klarem Boden, 96-Well-Platten (Corning) und eine Schachtel Filterpipettenspitzen (Agilent) auf der Roboter-Deck. Verteilen von 100 &amp;mgr; l Zellen in jede Vertiefung der beiden Platten bei einer Dichte von 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellplatten bei 50 g für 2 min, mit niedrigen Drehzahlen, gleiche Rampe zu gewährleistenZelldichte während jeder gut. Bei 37 ° C und 10% CO 2 O / N. </li><li> Verdünnen Sie die Firefly-und Renilla Reporterplasmide bis 5 ng / ul in Serum-freien Medien. Kombinieren der Verdünnungen im Verhältnis 5:3 Glühwürmchen Renilla-Plasmid (das Volumen) in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Pipettieren die kombinierten Plasmide in jedes Well einer 96-Well-Platte, Abgabe 17 ul pro Bibliotheksplatte plus 2-10 ul Überschuss, in jede Vertiefung. </li><li> Erhalten Transfektion-Grade-DNA-Bibliothek Platten wie oben und mit Wasser auf 13,3 ng / ul mit Endotoxin-freiem Wasser. Das Mindestvolumen pro Well 28 ul sein sollte. </li></ol> 3. Führen Transfektionen Am Tag 2 des Bildschirms werden Reporterplasmide und Bibliotheks DNAs in 293T-Zellen transfiziert. <ol><li> Für jede Bibliothek Platte, mischen 107,5 ul RT Optifect (Invitrogen) mit 4,3 ml Serum-freien Medien (1:40-Verdünnung) in einem Polystyrolröhrchen. Inkubation für 5 min bei RT undn verzichten 44 ul (pro Bibliothek Platte) in jedes Well einer 96-Well-, Polystyrol V-Bodenplatte (Greiner). </li><li> Die Platte des verwässerten Optifect, Reporter-Plasmide (Schritt 2.5), Bibliothek DNAs (Schritt 2.6), und eine Schachtel-Pipettenspitzen auf der Roboterplattform. </li><li> Saugen Sie 17 ul Reporterplasmide, 43 ul verdünnte Optifect und 26 ul DNA-Bibliothek, Einfügen eines 5 ul Luftspalt zwischen den einzelnen Streben. Die Bibliothek DNA sollte zuletzt angesaugt werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. Dispense den Inhalt der Tipps in eine neue Polystyrol V-förmigen Platte, mischen, Deckel, und beiseite stellen für 20 Minuten, damit Lipid / DNA-Komplexe zu bilden. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, ersetzen Sie die Pipettenspitzen und Bibliotheksplatte, und wiederholen. </li><li> Entdecken Sie die Optifect / DNA-Gemisch Platte und legen Sie es auf die Roboterplattform mit 2 Platten von 293T-Zellen. Mit einer einzigen Box von Pipettenspitzen, aspirieren 80 ul der Optifect: DNA-Gemisch und langsam 40 ul verzichten auf jede Platte von Zellen. Wenn transkleinerung, Desinfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Optifect: DNA-Platten. Decken-Zellen. </li><li> Zentrifugieren der Zellplatten bei 1200 × g für 30 min. Decken und zurück in den Inkubator. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 4-6 Stunden. Während dieser Inkubation bereiten frische Medien durch Mischen von 12 ml DMEM mit 10% FBS und 10 pg / ml Ciprofloxacin (CellGro) für jede Bibliothek transfiziert Platte. Gießen Sie frisches Medium in einem sterilen Behälter. </li><li> Platz 2 Boxen der Roboter-Tipps, eine einzige Platte von Zellen, das Reservoir mit frischem Medium und einen Abfallbehälter auf der Roboterplattform. Aspirat 100 ul Medium aus den Zellen und Abgabe in den Abfallbehälter teilweise mit 70% Ethanol gefüllt. Mit frischen Tipps, absaugen 100 ml frisches Medien und langsam auf die Zellen zu verzichten. Wiederholung für alle Platten der Zellen. </li><li> Rückgabe Platten in den Inkubator für 48 Stunden. </li></ol> 4. Führen Dual-Luciferase-Assays Am Tag 4 des Bildschirms, dieGlühwürmchen-und Renilla-Luciferase-Assays durchgeführt werden. Hinweis: Die Dual-Luciferase-Assay erfordert die sequentielle Zugabe von 2-Assay-Puffer, 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und 3X Renilla Assaypuffer, wie in Tabelle 3 beschrieben Firefly Luciferase und Renilla nicht sezerniert wird, so müssen die Zellen vor der Messung der Luciferase-Aktivität, lysiert werden. . Firefly-Assay-Puffer lysiert Zellen und bietet Substrat für die Firefly Luziferase; Renilla-Assay-Puffer löscht den Glühwürmchen-Signal und liefert Substrat für die Renilla-Luciferase. <ol><li> Für jede Bibliothek Platte, bereiten 8 ml 3X Glühwürmchen Testpuffer aus Stammlösungen, wie in Tabelle 3 beschrieben, und verzichten 82 ul in jedes Well einer 96-Well-V-Bodenplatte. </li><li> Für jede Bibliothek Platte, bereiten auch 12 ml 3X Renilla-Assay-Puffer und 122 ul verzichten in jedes Well einer 96-Well-V-Bodenplatte. Beiseite sowohl dieGlühwürmchen und Renilla-Assay-Puffer. </li><li> Legen Sie ein Feld von Pipettenspitzen, ein Abfallbehälter und 2 Platten von Zellen (aus derselben Bibliothek Platte transfiziert) auf der Roboterplattform. </li><li> Saugen Sie 60 ul Medien von jeder Platte und entsorgen in der Abfallbehälter teilweise mit 70% Ethanol gefüllt. Deckplatten und beiseite stellen. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Sätze Teller. </li><li> Platz 2 Boxen von Pipettenspitzen, die Platte von 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer, und eine Reihe von Zellplatten auf der Roboterplattform. </li><li> Saugen Sie 40 ul 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und es an die erste Platte von Zellen hinzuzufügen, gründlich mischen. Die Umstellung auf neue Pipettenspitzen, wiederholen Sie für die zweite Zelle Platte. Zeigen Zellen bei RT für 10 min, um die Lyse zu vervollständigen. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, ersetzen Sie die Boxen von Tipps und Zellplatten, und wiederholen. </li><li> Rekord Lumineszenz aus jeder Vertiefung jeder Zelle Platte auf einem Luminometer, Aufzeichnung für 1 Sekunde pro Vertiefung. Rückgabe Platten auf den RoboterDeck. </li><li> Platz 2 Boxen von Pipettenspitzen, die Platte von 3X Renilla-Assay-Puffer, und eine Reihe von Zellplatten auf der Roboterplattform. </li><li> Saugen Sie 60 ul 3X Renilla-Assay-Puffer, und es an die erste Platte von Zellen hinzuzufügen, gründlich mischen. Die Umstellung auf eine neue Box von Pipettenspitzen, wiederholen Sie für die zweite Zelle Platte. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Gruppen von Zellplatten. </li><li> Rekord Lumineszenz von allen Platten auf einem Luminometer, Aufzeichnen jeder gut 1 Sekunde wie oben. Entsorgen Platten. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Berechnen Sie die Glühwürmchen: Renilla-Lumineszenz-Verhältnis (&quot;F: R-Verhältnis&quot;) für jede gut durch Teilung des Grafen von Glühwürmchen-Signal von den Grafen von Renilla-Signal. </li><li> Berechnung der Induktion durch Teilen der F R-Verhältnis jedes vom durchschnittlichen F: R-Verhältnis der Platte, mit Ausnahme der höchsten und der niedrigsten 25% der Vertiefungen. </li><li> Mittelwert der Induktionswerte über Wiederholungenfür eine einzelne Bibliothek transfiziert Platte. Gene induzieren oder Unterdrückung alpha-Synuclein mehr als drei Falten werden in diesem Bildschirm als &quot;Treffer&quot; und unterliegen weiteren Validierung und sekundären Bildschirmen. </li></ol>

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Diese Arbeit wurde durch Lizenzgebühren von der Lizenzierung BacMamreagents (US Patent 5.731.182) erhalten unterstützt.

Alpha-Synuclein in der Parkinson-Krankheit (PD) als Bestandteil der Lewy-Körper 4, intrazellulären Einschlüssen als pathognomonisch für die Krankheit in Verbindung gebracht. Zahlreiche genomweiten Assoziationsstudien haben Einzel-Nukleotid-Polymorphismen im Alpha-Synuclein mit einem erhöhten Risiko für sporadische PD 5,6,7 verbunden. Obwohl weniger verbreitet als sporadische PD, familiäre PD kann auch durch Mutationen im Alpha-Synuclein 8 verursacht werden, sowie Vervielfältigung...

Die Fähigkeit, wichtige genetische Regulationselemente und die Faktoren, die auf sie einwirken zu identifizieren, ist für die Exploration von zahlreichen biologischen Prozessen fundamental. Jedoch Faktoren zu identifizieren, die die Expression von Genen in seltenen Zelltypen regulieren, wie spezifische neuronale Populationen, kann schwierig sein. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von neuartigen Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein (SNCA) präsentieren wir ein Gen, das mit der Parkinson-Krankheit und der dopaminergen Neuronen in der substantianigra ausgedrückt pars compacta Bereich des Mittelhirns. Wir erreichen dies mit einem Hochdurchsatz-, Dual-Luciferase, in-vitro-Reporter Bildschirm, um Alpha-Synuclein-Expression in 293T-Zellen zu dekonstruieren. Die alpha-Synuclein-Promotor wird zunächst in einem Reporterplasmid, das den Glühwürmchen-Luciferase-Gen kloniert. Ein handelsübliches Plasmid, das das Renilla-Luciferase unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors dient als interne Kontrolle. These-Reporter-Konstrukte in 293T-Zellen cotransfiziert in Mikrotiterplatten mit Plasmiden aus einer DNA-Expressionsbibliothek, so dass jede Vertiefung mit einer einzigen Bibliothek transfiziert. Nach 48 Stunden Luciferase-Aktivität für jeden Reporter sequentiell unter Verwendung eines Dual-Schein-Assay gemessen. Renilla-Luciferase-Aktivität in jeder Vertiefung (F: R-Verhältnis) nach der Plattenbasis Normalisierung der relativen Expression von alpha-Synuclein in Reaktion auf jede Bibliothek Gen wird durch das Verhältnis von Glühwürmchen abgeleitet. Dieses Protokoll stellt die Fähigkeit, eine große Anzahl von Genen (~ 2.500 pro Woche) auf ihre Fähigkeit, ein Reportergen zu trans Verwendung minimaler Arbeitskraft (1-2 Personen) und minimalen Kosten (etwa 3 $ Reagenzienkosten pro Mikroassay) zu screenen. Transkriptionsregulatoren der neuronalen Gene (z. B. alpha-Synuclein), die schwierig in kultivierten Neuronen refraktär genetische Manipulation zu studieren, können Seite an Seite in dieser direkten funktionellen Assay verglichen werden. Wir sind in unsererProtokoll eine ausführliche Verfahren für das Klonen und das Wachstum der Plasmide, die das Alpha-Synuclein-Promotor, da wir festgestellt, dass Plasmide, die diese Region instabil sind, wenn sie mit herkömmlichen Verfahren (siehe Diskussion) gewachsen. Wir berücksichtigen auch eine kostengünstige Alternative zu handelsüblichen Dual-Luciferase-Reagenzien für die Hochdurchsatz-Assays. Dieses Protokoll kann leicht an andere regulatorische Elemente von Interesse, oder zu jedem Prozess eine hohe Durchsatz transienten Transfektionen Ziel werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-12</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR Micro Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310250</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-03</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>Bravo Robot</td><td>Agilent</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Robot Pipet Tips with Filter</td><td>Agilent</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Robot Pipet Tips without Filter</td><td>Agilent</td><td>19477-002</td><td></td></tr><tr><td>Clear-bottomed 96-well Plates</td><td>Corning</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td>Reservoirs</td><td>Axygen</td><td>RES-SW96-HP-SI</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td><td>Greiner</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td><td>Greiner</td><td>651201</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Plate Covers</td><td>CryoStuff</td><td>#FS100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>BAC 2002-D6</td><td>Invitrogen</td><td>2002-D6</td><td></td></tr><tr><td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td><td>Roche</td><td>10713023001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E6931</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>11635-018</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM without Phenol Red</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Optifect</td><td>Invitrogen</td><td>12579017</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>CellGro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydrochloride Powder</td><td>Sigma</td><td>93287</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base Powder </td><td>Sigma</td><td>93286</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Pure Liquid</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>C&amp;#8211;nzyme A</td><td>Nanolight</td><td>309</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td></td></tr><tr><td>h-CTZ</td><td>Nanolight</td><td>301</td><td></td></tr><tr><td>PTC124</td><td>SelleckBiochemicals</td><td>S6003</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

Wir stellen eine schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-Screening-Protokoll zur Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein-Gen mit einer Parkinson-Krankheit zu identifizieren. 293T-Zellen transient mit Plasmiden aus einem Array ORF Expressionsbibliothek transfiziert zusammen mit Luciferase-Reporter-Plasmide, in einem Ein-Gen-per-Well-Mikroformat. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wird nach 48 Stunden, um die Wirkungen von jeder Bibliothek Gen auf alpha-Synuclein-Transkription, normiert auf die Expression von einer internen Kontrollkonstrukt (hCMV-Promotor, eine Renilla-Luciferase) zu bestimmen, untersucht. Dieses Protokoll wird von einer Bank-Top-Roboter in einer Biosicherheitsschrank eingeschlossen, die aseptische Handhabung von Flüssigkeiten in 96-Well-Format führt erleichtert. Unsere automatisierten Transfektionsprotokolls ist leicht an Hochdurchsatz-Bibliothek lentivirale Produktion oder andere funktionelle Screening-Protokolle Triple-Transfektionen von einer großen Anzahl von einzigartigen Bibliothek Plasmide in konjugierte erfordernnktion mit einem gemeinsamen Satz von Helfer-Plasmide. Wir stellen auch eine kostengünstige und validiert Alternative zu handelsüblichen, Dual-Luciferase-Reagenzien, PTC124, EDTA und Pyrophosphat Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität vor der Messung der Renilla-Luciferase verwendet drücken. Mit Hilfe dieser Methoden, abgeschirmt wir 7670 menschliche Gene identifiziert und 68 Regulatoren der alpha-Synuclein. Dieses Protokoll ist leicht modifizierbar, um andere Gene von Interesse abzielen.

Typische Luciferase-Werte, F: R-Verhältnisse und Induktion Werte für ein einzelnes Halbplatte sind in Abbildung 4 dargestellt Beachten Sie die Hit in gut H2, einem 32-fach-Induktor.. Gene verursacht übermäßige Toxizität (z. B. auch E3), oder Brunnen, die schlecht transfiziert wurden, werden niedrige Werte sowohl für Glühwürmchen und Renilla Luciferase produzieren, aber eine durchschnittliche Induktionswert. Genen, die nicht-spezifische Induktion der Luciferase-Aktivität, möglicherwei...

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

23.4K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital.  Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen. 

Serie: High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Forschung

Biologie

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Krebsforschung

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medizin

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Immunologie und Infektion

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Cellular Bioluminescence Based Assay: A High Throughput Method for Combinatorial Drug Screening

Source: Hu, Z. et al. <a href="https://www.jove.com/v/62312/a-rapid-screening-workflow-to-identify-potential-combination-therapy">A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2021)
In this video, we describe a method highlighting the utility of bioluminescence assay for sensitive and rapid screening of drugs. These drugs can be tested alone or in combination to assess the synergism in their mode of action.

Zellulärer Biolumineszenz-basierter Assay: Eine Hochdurchsatzmethode für das kombinatorische Wirkstoffscreening

Source: Hu, Z. et al. A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells.&#160;J. Vis. ...