1. Cardiomyocyte Isolation Materialien (1) Microdissecting Zange Tissue Zange Zarte Arterienklemmen Arterienklemmen Microdissecting, gezackt, gebogene Pinzette Betriebsschere, gerade Betriebsschere, gebogen 15 ml Falcon-Röhrchen (5) 60 mm Petrischale Phosphat-gepufferte Saline (PBS) Nylon Mesh - 400 um Porengröße Kleiner Trichter Wachs beschichtet, geflochten Seide 4-0, 19 mm, 7-10 cm lang Nicht-Injektionsnadel, stumpfes Ende, 24 G oder kommerzielle Tierernährung Nadel (24 x 1 in, W/1-1/4) Heparin-Natrium Ketamin / Xylazin-Mischung Pasteur Pipetten Optivision Dissecting Goggles IonOptix MMSYS System Hinweis: Wenn die Kultivierung von Zellen, siehe Abschnitt 2 auf Zellkultur vor Beginn dieses Protokoll. Hinweis: Alle Mäuse wurden in gepflegteine Barriere Anlage und nach anerkannten IACUC Vorschriften, Verfahren und Verfahren geopfert. Hinweis: Vor dem Beginn des Verfahrens sollte das gesamte System vorgeheizt, um sicherzustellen, dass alle Elemente der Langendorff-System (2A, Fig. 3) auf 37 ° C erwärmt, um für die richtige und vollständige Kollagenase-Aktivität zu ermöglichen. <ol><li> Spritzen erwachsenen Mäusen (~ 12 Wochen) mit 150 USP-Einheiten Heparin-Natrium in den Bauchraum. </li><li> Betäuben mit einer Injektion einer Ketamin / Xylazin-Mischung bei einer gewichtsabhängige Dosis (Tabelle 1). <ol><li> 80:12 mg / kg Ketamin: Xylazin Rezept: 2,6 ml Ketamin (100 mg / ml) + 0,4 ml Xylazin (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Finale: Ketamin = 6,5 mg / ml; Xylazin = 1 mg / ml </li></ol></li><li> Sichern Sie die Maus, um sediert Betriebs Pad, das Herz herauszuschneiden, und in einen Teller der Raumtemperatur PBS oder 0,9% Kochsalzlösung (Abbildung 1J). PhySIOLOGISCHE Salzlösung ermöglicht die intakte Herz für bessere Extrusion von Blut in der Kammer und eine einfache Identifizierung der Aorta vor dem Schritt 1.6 schrumpfen. Mäuse wurden überprüft, um sicherzustellen, dass sie tief über Verlust hinteren Gliedmaßen Zehenklemmreflex und Verlangsamung der Atemfrequenz vor Beginn der Thorakotomie anästhesiert. </li><li> Verwenden Sie Optivision Sezieren Brille (1A) zu identifizieren und zu setzen die Aorta. Entfernen des Gewebes um die Aorta, obwohl es ermöglichen die Visualisierung des Schiffes ist für die Optimierung der Zellisolierung erforderlich, wenn der Aortenwurzel ist deutlich sichtbar. </li><li> Prime die Pumpe mit Perfusionspuffer (Tabelle 2). Die Temperatur sollte bei 37 ° C für die Dauer des Verfahrens statt mit einer kontrollierten, zirkulierenden Wasserbad (2D). </li><li> Montieren Sie das Herz auf die Langendorff-Apparat (Abbildung 2A). Mit zwei Mikro Präparierzange (1D-E), prime die Aorta auf der nicht-Subkutan stumpfe Nadel (24 G) mit Silikonschlauch an der distalen Spitze. Alternativ kann ein kommerziell Tierfütterungsnadel (24 x 1, W/1-1/4) verwendet werden. Der Silikonschlauch auf der 24 G Nadel oder der Fütterung Nadel für die Sicherung der Naht über der Nut zu ermöglichen. Legen Sie die Aorta auf der Nadel als Socke. (Fig. 2C). <ol><li> Hinweis: Es ist wichtig, sicherzustellen, dass das Ende der Nadel liegt in der aufsteigenden Aorta, im Idealfall in der Aortenwurzel distalen rechts innominate, aber dass es nicht durch die Aortenklappe in den linken Ventrikel zu verlängern, da dies stark begrenzen die Fähigkeit der Puffer wirksam durch das Herz über die Koronararterien zu perfundieren. </li></ol></li><li> Sichern Sie die Herzen an der Nadel durch das Binden einer kleinen Nahtlänge von Seide (7-10 cm lang) (Abbildung 1 K) um den oberen Teil der Aorta, sicherzustellen, dass die Krawatte ist auf der Ebene der aufsteigenden Aorta, unter dem rechten innominate artery, ist aber über dem Ende der Nadel. </li><li> Senken die Herz in das Innere des konischen Glas (2B), um eine geeignete Umgebungstemperatur zu halten. </li><li> Perfundieren das Herz mit Perfusionspuffer für 5 min bei einer Geschwindigkeit von 1 ml / min und klemmen die Glaskammer Abfluss, damit das Perfusat in den konischen Glas sammeln und umhüllen das Herz. Das Schema für den Verdau des Herzens ist in Fig. 3 gezeigt. <ol><li> An diesem Punkt sollten Sie das Volumen des Herzens Anstieg zu sehen. Zusätzlich wird Blut im Herzgewebe von Perfusat ersetzt werden, wodurch Gewebe Blässe. </li></ol></li><li> Lassen Sie den Haken, um den Abfluss Perfusat abtropfen lassen. Stoppen Sie die Pumpe, um den Schlauch von der Perfusion Pufferbehälter an das Enzym Pufferbehälter (2E) zu bewegen. Neustart der Pumpe zu beginnen, um das Herz mit Enzympuffer (Tabelle 2) bei 1 ml / min durchströmen. Klemmen Sie den Abfluss erneut, um die Enzympuffer zu umhüllen dieHerz. <ol><li> Hier, wie das Enzym Perfusion des Herzens und Verdauen des Bindegewebes, das Herz wird blasser und die strukturelle Integrität wird abnehmen. </li><li> Um festzustellen, wann die Herzkammern aus dem verdaut Herz, heben Sie das Herz aus der konischen Glas, drücken Sie leicht die Herzen mit einer Pinzette und sammeln ein paar Tropfen Perfusat in einer kleinen Petrischale, und überprüfen Sie, ob einzelne Zellen sinken . </li><li> Für den Anfänger ist es hilfreich, die Durchblutung Linie mit einem Manometer zu verbinden. Wenn das Herz immer verdaut wird der Druck rapide ab, da das Bindegewebe nicht den Widerstand zu halten. Das Manometer ist auch für den Laien, um sicherzustellen, daß die Position der Nadel oberhalb der Aortenklappe und nicht im Ventrikel. Niederdruck an, dass die Nadel in der Herzkammer und die Hochdruck angegeben, dass die Nadel des Ventils berührt. </li></ol></li><li> Schneiden Sie die Herzkammern aus dem Herzen in eine Schalevoll von Transferpuffer (A) (Tabelle 2), wenn der Kammerdruck beginnt zu drastisch sinken oder wenn Sie in der Lage, einzelne Zellen im Perfusat zu sehen. Dies dauert in der Regel ~ 7-10 min. </li><li> Auch unter Verwendung von Mikro Präparierzange (1C), Hackfleisch die Ventrikel in kleine Stücke zu distanzieren. Eine erfolgreiche Verdauung wird fast keine festen Klumpen von Gewebe nach dem Hacken zu verlassen, mit den meisten der Gewebe amorph bei der Dissoziation. <ol><li> Weiter dissoziiert das Gewebe zu pipettieren, die Lösung in / mit Hilfe einer Pasteurpipette aus Kunststoff (Fig. 4), von dem die Spitze zu einem Durch ~ 45 ° Winkel geschnitten. Diese Änderung dient dazu, die Innendurchmesserfläche von der Pipettenspitze so Verringern der Menge an Scherspannung auf die Zellen, während das Gewebe verrieben erhöhen. </li><li> Vor der Zerlegung des Gewebes mit der Pinzette ist es möglich, die einzelnen Kammern zu trennen und separat zu dissoziieren Vorhof, linksventrikulärer oder Rechtt ventrikuläre Zellen. </li></ol></li><li> Sichern Sie die quadratischen Maschen (Abbildung 1 M) zu einem kleinen Trichter (Abb. 1 l) mit Schellen und legen diese Filtervorrichtung in eine 15 ml-Falcon-Röhrchen (1I). </li><li> Verwenden Sie die modifizierte Pasteur-Pipette, um die Zell-Lösung aus der Schale entfernen und filtern Sie die Lösung in den Falcon-Röhrchen. </li><li> Lassen Sie die lebenden Zellen auf den Boden des Röhrchens absetzen (live Zellzentrifugation sollte 2-4 Minuten dauern). </li><li> 2,5 ml Aliquot jeder der vier Calciumlösungen (Tabelle 3) in 4 separate 15ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Wiederum unter Verwendung eines Standard-Pasteurpipette vorsichtig die Zellpellets aus dem Boden des Röhrchens und die Übertragung der Zellen an die erste der Calciumlösungen. </li><li> Lassen Sie die Zellen auf den Boden des Röhrchens absetzen und wiederholen Sie Schritt 1.17 in den nachfolgenden Calciumlösungen, bis sich die Zellen in der letzten Lösung. </li><li> Lassen Sie sich nicht die Zellen in der fourt niederh Calciumlösung. Das Röhrchen und drehen Sie ihn auf die Seite. </li></ol> 2. Zellkultur <ol><li> Bevor die Isolation, Platte 1 ug / ml Natur Maus Laminin auf Deckgläser und Inkubation für mindestens 1 h bei 37 ° C und 2% CO 2. Damit auch Ihre Plattieren und Kulturmedien (Tabelle 4) im Brutschrank bei 37 ° C erwärmen und 2% CO 2. Dies ermöglicht das gelöste CO 2 in den Medien, um zu äquilibrieren. <ol><li> Darf die von den Medien nicht entfernen. Einfach die oben lösen, um eine Kontamination zu vermeiden. </li></ol></li><li> Ermöglichen die isolierten Zellen auf dem Boden des Falcon-Röhrchen pelletieren. </li><li> Entfernen Sie das Pellet mit einem Standard-Kunststoff-Pasteur-Pipette resuspendieren und in der entsprechenden Menge an Beschichtung Medien. </li><li> Platte der Zellen auf Laminin-beschichtete Deckgläser in die entsprechende Größe Schale und Inkubation in 37 ° C und 2% CO 2 für mindestens 30-60 Minuten, damit sich die Zellen an den Deckgläsern haften. </li><li> ** Wenn die Transfektion mit Adenovirus, verdünnen das Virus in einer geeigneten Menge Plattierungsmedien und ersetzen Sie den Plattenmedien in die Schüssel mit den virushaltigen Medien. Inkubieren ließ das Virus an die Zellen für 2 h bei 37 ° C und 2% CO 2. ** </li><li> Entfernen Sie den Plattenmedien aus der Schüssel und ersetzen mit Kulturmedien. </li><li> Das Kulturmedium jeden Tag sorgfältig zu ändern, um nicht die Zellen auf dem Deckgläschen stören. </li></ol> Mit diesem Verfahren Zellen wurden erfolgreich bis zu 72 h kultiviert. Bilder von kultivierten und GFP-transfizierten Zellen in 5 zu finden. 3. MMSYS-System <ol><li> Schalten Sie das System MMSYS sicherzustellen, dass die Bogenlampe der ersten Aufnahme. </li><li> Verbinden der Rohre von der Pumpe zu dem entsprechenden Einlaß und Auslässen der MMSYS Kammer (6). </li><li> Prime das System mit Calciumpuffer (B) (Tabelle 2). </li><li> Legen Sie eine ca.opriately große Deckglas in die Kammer und fasten (6E). Die meisten MMSYS Kammern entweder 22 mm oder 25 mm im Quadrat Deckgläser. Fragen Sie Ihren MMSYS Bedienungsanleitung, um die entsprechende Deckglas für Ihre Kammer zu bestimmen. </li><li> Transfer 500 ul der Zelllösung zu einem kleinen Eppendorf-Röhrchen. </li><li> In 0,5 ul Fura2-AM (Stammlösung von 1 ug / ul) an die Röhrchen von Zellen und es ihnen ermöglichen, im Dunkeln bei RT für 5-7 min inkubiert. Dies ermöglicht die Fura2-AM auf &quot;Last&quot; in die Zellen durch schnelle passive Diffusion durch die Zellmembran. <ol><li> Lassen die Fura-2 beladenen Zellen zu pelletieren, um den Boden des Röhrchens, und Waschen des überschüssigen Fura mit 500 &amp;mgr; l Puffer B. Calcium </li></ol></li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung. </li><li> Mit einem Standard-Pasteur-Pipette, lassen Sie 1-2 Tropfen (abhängig von der Zellkonzentration) der &quot;geladen&quot; Zell-Lösung in die Mitte der Kammer (6C) und damit die Zellen to auf dem Deckglas für ca. 5 min. <ol><li> Die Dichte der Zellen in der Kammer sollte so sein, dass einzelne nicht-überlappenden Zellen leicht in die MMSYS Datenerfassungsplattform betrachtet werden. </li></ol></li><li> Sorgfältig zu fließen beginnen Calciumpuffer (B) durch die Kammer. </li><li> Erhöhung der Kammertemperatur auf 37 ° C <ol><li> WICHTIG: auf dem Heizgerät nicht einschalten, bis der Fluss eingeleitet wurde. Dies kann zu schweren Schäden das Feedback Thermoelement (6A). </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, dass die Kammer zu der MyoPacer verbunden über die Anschlussdrähte (6B) und beginnen, die Zellen bei 1,5 x die Reizschwelle für die Zellen Tempo 5 Hz. </li><li> Wählen Sie eine Zelle, die mit der richtigen Frequenz zu schlagen ist, und verschieben Sie sie in die Rahmenöffnung. </li><li> Einstellen der Kamera-und Framing-Öffnungsabmessungen, so dass die gesamte Zelle ist in der Mitte des Fensters, in Horizontalrichtung mit dem AP sarcomeresElternteil. <ol><li> Für Zellenlänge einstellen roten und grünen (rechts und links) Photodiode Indikatoren an den Rand der Zelle. Stellen Sie den Kontrast, um die Schwarz / Weiß-Kontrast an den Rändern der Zelle zu optimieren. Finden Sie in der Bedienungsanleitung Ionoptix für weitere Details. </li></ol></li><li> Legen Sie die Box in einem Bereich der Zelle mit gut definierten Sarkomere und stellen Sie den Fokus auf den Gipfel des Leistungsspektrums (rot) zu optimieren. Auch die Helligkeit des Mikroskops, um die blaue Glättung Fenster und schwarze Kontrastinformationen optimieren. </li><li> Stellen Sie die grünen Balken Schwelle, so viel von dem roten Leistungsspektrum (peak) und so wenig wie möglich zu erfassen Hintergrund. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. </li><li> Nachdem genügend Daten aufgezeichnet worden sind, klicken Sie auf &quot;Pause&quot;, um die Aufnahme vorübergehend zu stoppen und sicherzustellen, dass weder der Fokus noch Dimensionen des Sichtfensters verändert, bewegen des Mikroskops Bühne zu einem Bereich des Deckglases, in dem keine Zellen oder Zellmaterial sein kann gesehen. Length der Aufnahme variiert je nach Versuchsprotokoll für den Prüfer. <ol><li> Hinweis: Klicken Sie auf &quot;Stop&quot; wird die Aufnahme zu beenden und keinen Hintergrund in der Lage, für diese Zelle aufgenommen werden. </li></ol></li><li> Klicken Sie auf &quot;Fortsetzen&quot;, um eine Hintergrundmessung aufzuzeichnen. </li><li> Nachdem genügend Hintergrund wurde gespeichert klicken Sie auf &quot;Stop&quot;, um die Aufnahme zu beenden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Datei &gt;&gt; Speichern&quot;, um alle Spuren für diese Zelle in einem einzigen. Zpt Datei zu speichern. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 3,12 bis 3,20, bis genügend Zellen aufgenommen wurden. </li><li> Wenden IonOptix-MMSYS Benutzerhandbuch 12 Anweisungen zur Analyse der aufgezeichneten Daten. Charakteristisch aufgezeichneten Daten von Wildtyp-Kardiomyozyten sind in Abbildung 7 dargestellt. </li></ol> 4. Patch-Clamp- Patch-Clamp von verschiedenen Zelltypen wurden zuvor auch in dieser Zeitschrift 25-28 beschrieben. Wir haben daher auf einige Kritiker konzentrierenal-Parameter für eine erfolgreiche Patch-Clamp von adulten Kardiomyozyten isoliert über unser Protokoll beschrieben. <ol><li> Mit einer Pipette Abzieher und Borosilikatglas (mit Faden: OD 1,5 mm, ID 0,86 mm - 10 cm Länge) ziehen eine Pipette, die ~ 2,0-3,0 MOhm, wenn sie mit Pipettenlösung (Tabelle 5) gefüllt aufweist. </li><li> Brandlack die Pipettenspitze vorsichtig mit einem Narishige oder anderen vertikalen Brandpolierer. Der Widerstand der Patch-Pipette sollte 2-4 MO nach Feuerpolitur sein. </li><li> Schalten Sie den Computer, Verstärker (Axopatch 200B), AD-Wandler (Digidata 1440A, Axon Instruments) und Mikromanipulator (MP-285). Für ganze Zelle Patch-Clamping, beginnen wir mit Standard-Parameter wie zuvor beschrieben. </li><li> Für kultivierten adulten CMs, entfernen Sie sie aus dem Inkubator und vorsichtig waschen das Deckglas auf dem die CMs werden mit PBS bei Raumtemperatur beschichtet. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und legen Sie sie in der Perfusions-Kammer auf der inversen Mikroskop (Nikon TE 2000). <ol><li> Sicherzustellen, dass der Einlass für das Perfusionssystem und Auslass (Saug) sind gerade über die Oberfläche des Deckglases. </li></ol></li><li> Starten Perfusion mit der entsprechenden extrazellulären Lösung (Tabelle 5). </li><li> Für frisch gewonnenen Erwachsenen CMs, legen Sie ein Collagen-beschichteten Deckglas in der Perfusions-System wie oben. <ol><li> Da die Zellen in Lösung, leicht ersetzen die Lösung mit extrazellulären Puffer. </li></ol></li><li> Mit dem modifizierten Pasteur-Pipette (Abbildung 4) vorsichtig resuspendieren in der extrazellulären Puffer, einen aliquoten und legen Sie es auf dem Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Zellen legen 10-15 min vor Beginn der Durchblutung, wie in 4.4. </li><li> Back-füllen die ganze Zelle Patch-Pipette mit intrazellulären Puffer unter Verwendung eines Microfil (World Precision Instruments, 28 G) Nadel. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spitze der Pipette, vorsichtig auf, damit die Luftblasen an die Oberflä schwebence der Lösung. </li><li> Bringen Sie die gefüllte Patch-Pipette in die Pipettenhalter, so dass ein Kontakt zwischen der Mikroelektrode und der internen Lösung. <ol><li> Wir verwenden Silberchlorid-Elektroden, aber kümmern &#39;chloriding&#39; die Silberdrähte mindestens einmal in der Woche über Nacht in Haushaltsbleichmittel eingetaucht. </li></ol></li><li> Senken Sie die Pipette in das Bad, so dass das Bad Elektrode wird zu allen Zeiten in dem Bad / extrazellulären Lösung eingetaucht. Offset keine Flüssigkeitsgrenzpotentiale zu diesem Zeitpunkt. Große Kreuzung Potentiale kann ein Zeichen von schlechter Silberchlorid auf den Elektroden sein. </li><li> Gesunden erwachsenen zylindrischen CMs im Mikroskop identifiziert und in das Sichtfeld zentriert. Wie zuvor beschrieben, eine Kombination der Bewegung des Mikromanipulators und Einstellen des Fokus ermöglicht Nähe der Patch-Pipette und die Oberfläche des CM. <ol><li> Sobald sie in der gleichen Brennebene sind, verwenden wir eine Kombination von visuellensierung der Zelle und Testimpuls (verfügbar in der Axopatch 200B). </li><li> Sobald der Widerstand der Pipette in die Hälfte abnimmt (was darauf hindeutet, dass die Pipette in Kontakt mit der Oberfläche der Zelle), und die Zelle weiterhin zylindrischen sehen, schaffen wir Gigaohm Dichtung mit leichtem Saugen. </li><li> Für CMs, bevorzugen wir den Mund Saug-Unterdruck aufzubauen. Wenn ein Gigaseal erfolgreich erhalten wird, verwenden wir wieder sanften rhythmischen Sog Mund zu &quot;Einbruch&quot; in die Zelle zu Zelle ganze Patch-Modus zu etablieren. </li></ol></li><li> Typische Ruhepotentiale von gesunden CMs sind in der Größenordnung von -85 bis -90 mV. Sobald ein Gigaseal erhalten wird, messen die Ruhemembranpotential mit Stromzange mit I = 0 pA. <ol><li> Wenn das Ruhemembranpotential depolarisiert dies zeigen eine beschädigte Zelle oder eine schlechte Abdichtung. </li></ol></li><li> Da die CMs sind große Zellen mit viel Fläche braucht Aufmerksamkeit zu zahlen, um Kompensationskapazität, vor allem wHenne schnell aktivierenden Ströme wie das Natriumkanal muss untersucht werden. Wenn ausreichende Kapazität Entschädigung kann nicht erhalten werden unter Verwendung der Entschädigung Einstellungen auf dem Pulsgenerator gebaut, Vorimpulsen bei Unterschwellenspannung und entgegengesetzter Polarität können angewendet werden und der resultierende Strom aus dem aufgezeichneten Signal subtrahiert. Ein solches Protokoll ist leicht in Axopatch programmiert. </li><li> Sobald ganze Zelle Patch-Modus eingerichtet wurde, warten Sie 15 min bis zum Gleichgewichtseinstellung zu ermöglichen und um die Stabilität der Dichtung vor Beginn Spannungs-oder Stromzange Protokolle gewährleisten. Wir verwenden Standard-Protokolle, die zuvor in dieser beschrieben wurden, und andere Fachzeitschriften und wird nicht weiter ausgeführt werden. </li></ol>

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Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).</li><li>Bostr&#246;m, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PGC1-?-dependent+myokine+that+drives+brown-fat-like+development+of+white+fat+and+thermogenesis.">A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis.</a> Nature. 481, 463-468 (2012).</li><li>Liao, R., Jain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+adult+mouse+cardiomyocytes.">Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).</li><li>Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+of+adult+ventricular+rat+heart+muscle+cells+in+serum-free+primary+culture.">Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).</li><li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 689, 205-214 (2010).</li><li>Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+and+Perfusion+Techniques+for+Studying+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recording+of+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+Oocytes.">Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes.</a> J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).</li><li>Arman, A. C., Sampath, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+from+Mouse+Retinal+Neurons+in+a+Dark-adapted+Slice+Preparation.">Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).</li><li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+patch+clamp+recordings+from+motor-neuron+and+target+skeletal+muscle+in+zebrafish.">Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).</li><li>Maier, S., Westenbroek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpected+role+for+brain-type+sodium+channels+in+coupling+of+cell+surface+depolarization+to+contraction+in+the+heart.">An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).</li><li>Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+micromechanical+properties+of+cultured+rat+atrial+myocytes+measured+by+atomic+force+microscopy.">Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy.</a> Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).</li><li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope.">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li><li>Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Gr&#252;tter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Viscoelastic+Behavior+of+Cultured+Airway+Smooth+Muscle+Cells+with+Atomic+Force+Microscopy:+Stiffening+Induced+by+Contractile+Agonist.">Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist.</a> Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

In diesem Bericht haben wir die notwendigen Techniken für eine erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von adulten CMs von der Maus Herz beschrieben. Unsere Technik kann für die anschließende Untersuchung der Funktion und CM Erregbarkeit unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren. Der kritische Parameter für das Studium der Erwachsenen CMs Funktionalität ist die Gesundheit und Qualität der isolierten CMs. Wie oben beschrieben, ermöglichen eine hohe Ausbeute an funktionellen Zellen zugänglich Manipulation...

Murine Modelle von Herz-Kreislauf-Krankheit wurden als effektive Werkzeuge für die Aufklärung grundlegender Krankheitsmechanismen 1,2 als auch für potenzielle therapeutische Ziele 1,3 serviert. Insbesondere haben die Verwendung von sowohl murinen Modellen von erworbenen Herzerkrankungen (wie beispielsweise Druck-Überlast) von 4,5 und einer transgenen Mausmodellen unser Verständnis von Herzerkrankungen 6-8 vorgerückt. Die Verwendung von Zellkulturtechniken, um Signalkaskaden 3,9,10 und Änderungen in einzelne Proteine, die zelluläre Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion unterliegen Kupplung im Herzen 11-13 auf der Ebene der Einzelzelle zu studieren, die in-vivo-Maus-Modelle ergänzt. Doch der Mangel an geeigneten Zelllinien, die Erwachsenen CM Struktur und Funktion reflektieren es eine deutliche Einschränkung. Forscher haben versucht, dies durch die Untersuchung einzelner Proteine, wie Ionenkanäle zu überwinden, die in heterologen Expressionssystemen <sup&gt; 14, und während diese Studien haben uns mit nützlichen Informationen in Form von Ionenkanal-Protein Biophysik oder Menschenhandel, unzureichende Darstellung des nativen Mikroumgebung des CMs vorgesehen ist eine erhebliche Einschränkung. Zweitens, da die meisten dieser heterologen Zellen nicht über eine ausgereifte kontraktilen Apparates, es war nicht möglich, die kontraktile Funktion und das komplexe Zusammenspiel zwischen zellulären Erregbarkeit und Kontraktion zu studieren. Aus diesem Grund haben Forscher primären Herzzellkulturen für viele ihrer in vitro funktionelle Studien gemacht. Schließlich isolierte Kardiomyozyten Studien ermöglichen Beurteilung der Kontraktionsfunktion ohne die Störfaktoren von mehrzelligen Vorbereitung einschließlich der Auswirkungen von Narben oder Fibrose und der Faserorientierung. Primäre neonatalen Ratten-Kardiomyozyten (NRVMs) sind relativ leicht zu Kultur, kann mit Adenoviren und Lentiviren infiziert, die Genexpression 15 zu manipulieren, einend haben deshalb ein erfolgreich verwendet worden, aber haben Einschränkungen ihrer eigenen. Obwohl sie einen physiologischen Mikroumgebung ein und wurden das Arbeitspferd der Signalisierungsfeld, wesentliche Unterschiede zwischen der Morphologie und subzellulärer Organisation NRVMs und Erwachsenen cardiomyoctyes machen sie eine unzureichende Modell für die Untersuchung der Ionenflüsse und-Elektromechanische Kopplung im erwachsenen Herzen . Vor allem fehlt eine definitive NRVMs t-Rohrsystem 4. Da Ca 2 +-Fluss und Dynamik sind entscheidend von reifen T-und Rohr Retikulum (SR) Struktur 6, Ca 2 + Dynamik und funktionelle Untersuchungen des kardialen Kontraktilität in NRVMs sind nicht eine genaue Reflexion dieser kritischen Prozesse in der Erwachsenenherzmuskelzellen. Weitere, einige Komponenten des Signalwege unterscheiden zwischen Neugeborenen und Erwachsenen Mäusen 9, wodurch ein weiterer Einschränkung für das Studium Krankheitsprozesse und deren impact auf die zelluläre Erregbarkeit und Kontraktilität in NRVMs. Schließlich ist die Verteilung des Kontraktionsmaschinen zu multidirektionale und ungleichmäßige Zellverkürzung Begrenzung der Genauigkeit der Kontraktionsmessungen. Die Verwendung von isolierten adulten Kardiomyozyten stellt daher eine genauere in vitro Modellsystems. Das außergewöhnliche Wachstum von Wissen ermöglicht durch die genetische Manipulation von Mäusen möglich, unterstreicht die Bedeutung der Erlangung Funktions isolierten Herzmuskelzellen von Mäusen. In der Tat hat die Charakterisierung der Erwachsenen CMs von Mausmodellen isoliert Licht auf vielen biologischen und pathologischen Ereignisse zu vergießen. Isoliert CMs aus transgenen Mausmodelle für die Untersuchung der Gewinn oder Verlust der Funktion von Proteinen auf die kontraktilen Eigenschaften von Einzelzellen 2,16, und die Lebensfähigkeit in Krankheitsmodellen wie Ischämie / Reperfusion 17,18 erlaubt, damit Informationen aus in Ergänzung gewonnen vivo-Studien über diese Mäusen. Verwendung von isolierten adulten CMs von Mausmodellen von erworbenen Herzerkrankungen 3,19,20 (wie Quer Aortakonstriktion bedingten Drucklast, dass Bluthochdruck oder imitiert Aortenklappenstenose) oder Übung 5,21 (für die Modellierung von physiologischen Hypertrophie) ermöglicht die Prüfung der Wechselwirkung von Signalkaskaden bei diesen Verfahren mit zellulären Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Kupplung auf der Ebene der Einzelzelle gebracht. Darüber hinaus gibt uns die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren mit Adenovirus-driven Genexpression in erwachsenen CMs die Möglichkeit, die Komponenten der komplexen Signalwege zu sezieren. Aus einem elektro Sicht haben Ganzzellspannung und Stromklemme-Experimente an isolierten adulten CMs in der Aufklärung der Natur der Ionenflüsse zu Beginn und bei verschiedenen Krankheitszuständen kritisch. Aufgrund der komplexen Struktur der Zellmembran und dem Differential Protein Gerüststrukturen zwischen Erwachsenen und CMs NRVMs oder heterologen Zelllinien, die von adulten Zellen Fläche bietet eine viel bessere Darstellung der Wirkungen bestimmter Membranproteinen, Strukturproteine ​​und Ionenkanalinteraktionspartner auf die elektrophysiologischen Komponenten des erwachsenen Herzen. Trotz dieser prominenten Vorteile bei der Untersuchung adulten Kardiomyozyten, Isolierung und Kultivierung erwachsenen Mäusen Kardiomyozyten wurde eine Herausforderung, drängt die Notwendigkeit einer systematischen und genaue Beschreibung der Methodik, um lebensfähige Kardiomyozyten der Maus zu isolieren und in Kultur zu halten, um weitere genetische Manipulation ermöglicht mit viralen Vektoren. Frühere Studien haben entweder akut isolierten Maus Erwachsenen CMs oder Zucht erwachsenen Ratte CMs verwendet. Letztere sind leichter zu Kultur als erwachsene Maus CMs, und die meisten Experimente Manipulation der Genexpression in vitro erwachsenen Ratte CMs verwendet. Nur wenige Studien haben erfolgreich verändert und untersucht Funktional Genexpression in Maus Erwachsenen CMs, stellt eine große Einschränkung in den Rahmen von Experimenten. Daher hier im Detail präsentieren wir solche Methoden aus früheren Untersuchungen geändert, für die Isolierung 7,8,22, Kultur 3,10,15,23, Adenovirusinfektion 11-13,15 und funktionelle Analyse von erwachsenen Maus ventrikuläre cardiomyoctyes. Diese Isolation Protokoll Ergebnisse in Ca 2 +-tolerant, erregbare Herzmuskelzellen, die wir haben, bis zu 72 Stunden erfolgreich kultiviert und transient mit Adenovirus transfiziert. Die Funktionalität dieser isolierten Zellen unter Verwendung des Abbildungssystems MMSYS 14,24 und Patch-Clamp, die auch diskutiert werden bewertet.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of 			Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7653</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P9333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H3375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Phosphate 			Monobasic</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S8282</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-glucose minimum</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G8270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T0625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2,3-Butanedione 			monoxime</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>B0752</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase B</td>
 <td>Roche Applied 			Science</td>
 <td>11088807001 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche Applied 			Science</td>
 <td>11088858001 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease 			XIV from Streptomyces griseus</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P5147</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin from Bovine 			Serum</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Minimum Essential 			Media</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>51411C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin solution 			from bovine serum</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A8412</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G3126</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P4333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulin-transferrin-sodium 			selenite media supplement</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>I1884</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp;region=US" target="_blank">289329</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutamate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G3291</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adenosine 			5'-triphosphate magnesium salt</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9187</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene 			glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic 			acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>E3889</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cesium Hydroxide 			Solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>232041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetraethylammonium 			hydroxide solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>86643</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>OptiVisor optical 			glass binocular 			visor</td>
 <td>Dohegan Optical 			Company Inc.</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue 			forceps, 5.5", 1x2 teeth</td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-8164</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moloney 			forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated </td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-8254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont 			#3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm</td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-4966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Packer 			Mosquito Forceps 5" Straight Flat</td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-7114</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro 			Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp </td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-5917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm</td>
 <td>Roboz Scientific</td>
 <td>RS-5907</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes

Die Verwendung von primären Kardiomyozyten (CMS) in der Kultur hat eine leistungsstarke Ergänzung zu Mausmodellen von Herzerkrankungen in unser Verständnis von Herzerkrankungen ist. Insbesondere haben die Fähigkeit, Ionen-Homöostase, Ionenkanal-Funktion, Mobil Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Kupplung und deren Veränderungen in erkrankten Bedingungen und durch krankheitsverursachende Mutationen zu studieren, um wichtige Erkenntnisse zu Herzerkrankungen geführt. Darüber hinaus haben der Mangel an einer angemessenen immortalisierten Zelllinie zu Erwachsenen CMs imitieren, und die Grenzen der Neugeborenen-CMs (die viele der strukturellen und funktionellen Biomechanik Merkmal der Erwachsenen fehlt CMs) Kultur in unserem Verständnis der komplexen Zusammenspiel zwischen Signalwege behindert, Ionenkanäle und kontraktilen Eigenschaften im erwachsenen Herzen Stärkung der Bedeutung des Studiums Erwachsenen isoliert Kardiomyozyten. Hier sind Verfahren zur Isolierung und Kultur, die Manipulation der Genexpression durch adenoviral expre präsentieren wirssed Proteine, und anschließende funktionelle Analyse von Kardiomyozyten aus der adulten Maus. Die Verwendung dieser Techniken wird dazu beitragen, mechanistischen Einblick in die zellulären Signalwege, die Erregbarkeit zu regulieren, Ca 2 + Dynamik und Kontraktilität zu entwickeln und eine viel physiologisch relevante Charakterisierung von Herz-Kreislauf-Krankheit.

Die Isolierung von adulten cardiomyoctyes Ergebnisse in stabförmigen, gestreift und Ruhe (nicht spontan schlag)-Zellen (Abbildung 5A). Tote Zellen aussehen wird gerundet und keine Riefen werden anwesend sein. Ruhende Zellen können kultiviert und mit Adenovirus-Gen-Expression (Fig. 5B und 5C) zu manipulieren, transfiziert werden. Nach 24 h der Kultur, ist die Morphologie der lebenden Zellen nicht ändern, sind sie noch Ca 2 +-tolerant, und sie können durch ...

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Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

isolation-culture-functional-characterization-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

24.3K Aufrufe.  Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School.  Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden. 

Serie: Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...