Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute Zuschuss HL-36573 unterstützt. Wir danken Herrn David Sowa für die Bearbeitung dieses Manuskript.

Alle Forschung an Mäusen wurde nach Verfahren und Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt, und die Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Toledo, Hochschule für Medizin und Lebenswissenschaften genehmigt. 1. Perfusionssystem Vorbereitung <ol><li> Der Tag vor der Isolierung, füllen die gesamte Durchblutung System (einschließlich Stauseen) mit einer Lösung von alkalischen schnell rückstandsfreie Reinigungsmittel. Lassen Sie die Lösung in das System für einige Stunden oder über Nacht einweichen. </li><li> Am nächsten Morgen, stellen Sie den Thermocycler Temperatur auf 37 ° C und die Lösung, um sich aufzuwärmen. Entfernen Sie die Reinigungslösung und spülen Sie das System gründlich mit sterilisiertem destilliertem Wasser. Vergessen Sie nicht, alle Seitenäste. </li><li> Füllen Sie das System mit Perfusionspuffer über eine Konstante Schlauchpumpe und zeichnen mögliche Luftblasen aus der Aorta Kammer (Luftfalle) mit einer seitlich angebrachten Spritze zum Schutzdas Herz von der koronaren Okklusion. Die Strömungsrate der peristaltischen Pumpe regelmäßig überprüft werden. </li></ol> 2. Herstellung von Puffern, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Perfusion Buffer: Stellen Sie 500 ml 1x Perfusionspuffer vor der Verwendung. Diese Calcium-freien Puffer enthält 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0,6 mM Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSO 4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO 3, 10 mM KHCO 3, 0,032 mM Phenolrot, 30 mM Taurin, 10 mM BDM und 5,5 mM Glucose. Den pH-Wert auf 7,0 mit 2 M HCl und durch ein 0,2 um Filter, Lagerung bei 4 ° C Anmerkung: a) Die Perfusionslösung sollte am gleichen Tag hergestellt werden, wenn es verwendet wird. In einigen Fällen ist es akzeptabel, die Lösung weniger als 3 Tage bei 4 ° C aufbewahren b) Dieser Puffer hat einen hohen Kalium-Konzentration von bis zu 15,3 mM, die die Herzmuskelzellen Ruhe halten können, zu reduzieren ATP consumption und erhöhen die Ca 2 +-Fähigkeit tolerant. </li><li> Digestion Buffer (300 U / ml, 25-50 ml / Herz): Vorbereitung unmittelbar vor der Perfusion. Wiegen 15.000 U Gesamtaktivität von Typ-II-Kollagenase, in 50 ml Perfusionspuffer in Kultur Haube lösen. In 25 ul 100 mM CaCl 2 (Stammlösung, Filter sterilisiert), um die endgültige Calciumkonzentration machen 50 uM. Wärmen Sie den Puffer auf 37 ° C, wenn Sie bereit für die Isolierung. Im Gegensatz zu Trypsin, Collagenase am besten in Gegenwart von 50-100 &amp;mgr; M Ca 2 +. </li><li> Anschlagpuffer (50 ml / Herz): Betreiben Sie in Kultur Kapuze. Mischungs 45 ml Perfusionspuffer mit 5 ml sterilem FBS. <ol><li> Ca 2 +-Lösung I (12,5 &amp;mgr; M Ca 2 +): In 2,5 &amp;mgr; l 100 mM CaCl 2 und 20 ml Stoppuffer und mischen. </li><li> Ca 2 +-Lösung II (100 &amp;mgr; M Ca 2 +): In 10 ul 100 mM CaCl 2 und 10 ml Stoppuffer und mischen. </li><li> Ca 2 +-Lösung III (400 &amp;mgr; M Ca 2 +): In 40 ul 100 mM CaCl 2 und 10 ml Stoppuffer und mischen. </li><li> Ca 2 +-Lösung IV (900 &amp;mgr; M Ca 2 +): In 90 ul 100 mM CaCl 2 und 10 ml Stoppuffer und mischen. </li></ol></li><li> Plating-Medium (50 ml / Herz): Transfer 43 ml MEM mit 2 mM L-Glutamin und 1,26 mM CaCl 2 in ein steriles 50-ml konischen Röhrchen in Kultur Kapuze und 5 ml FBS, 1 ml BDM-Stammlösung ( 500 mm, filtersterilisiert), und 0,5 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml). Mischen und ins Gleichgewicht für 2-3 Stunden vor myocyte Isolation in 2% CO 2, 37 ° C Inkubator mit den Kappen lose. Kurz vor myocyte Beschichtung, 0,5 ml 200 mM ATP (pH-Wert 7,2, Stammlösung, Filter-sterilisiert) in das Medium. </li><li> Kulturmedium (50 ml / Herz): Transfer 48 ml MEM mit 2 mM L-Glutamin und 1,26 mM CaCl 2 in ein steriles 50-ml konischen Röhrchen in Kultur Kapuze und 1 ml BDM-Stammlösung (500 mM, filter sterilisiert) und 0,5 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml). Mischen und ins Gleichgewicht in 2% CO 2, 37 ° C Inkubator vor myocyte Isolation. Vor der Verwendung werden 0,5 ml einer 100 mg / ml BSA (sterilfiltriert) in das Medium. Hinweis: Die Verwendung von 2% CO 2-Inkubator ermöglicht die Aufrechterhaltung der Kultur bei mittlerer pH 6,9 bis 7,0, die die myoctyes behalten ihre stäbchenförmige Morphologie bis zu 24 Stunden hilft. </li><li> Laminin (1-2 &amp;mgr; g / cm 2)-beschichteten Schalen oder Platten: Transfer 200 ul 1 mg / ml Maus-Laminin natürliche zu 20 ml sterilisiertem PBS (w / o Calcium und Magnesium) und mischen. 1 ml auf 35-mm-Platten, 2,5 ml auf 60-mm-Schalen, oder 5 ml bis 100-mm-Schalen, schütteln gleichmäßig bedecken die Oberflächen und in 2% CO 2, 37 ° C Inkubator bis Myozyten-Beschichtung. Hinweis: Wenn der Schalen oder Platten nicht am Tag beschichtet verwendet werden, können sie mit Parafilm versiegelt und bei 4 ° C über Nacht (langsame Coating) gespeichert. Die Abdichtung ist requIRED Verdunstung und Verunreinigung zu verhindern. Beschichteten Platten können bei 4 ° C für bis zu 1 Woche aufbewahrt. </li></ol> 3. Maus Herz Aus-und Kanülierung <ol><li> Weichen Sie die Schere und Pinzette in 70% Ethanol für 30 Minuten und lassen Sie sie trocknen. </li><li> Wiegen Sie die Maus, um 0,1 Gramm. Nehmen Sie seine Körpergewicht, Stamm, Geschlecht und Geburtsdatum. </li><li> Injizieren 200 ul Heparin (100 IU / Maus) ip 10 min vor der Anästhesie, um die Koagulation von Blut in die Koronararterien zu verhindern. Anesthetize die Maus mit 200 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin durch ip-Injektion und warten 5-10 Minuten, bis die Maus nicht mehr reagiert bis zum Schwanz / Zeh drückt. </li><li> Sichern Sie die Maus in die Rückenlage, indem Sie vorsichtig die Festsetzung der Vorderpfoten und Hinterpfoten an einen pinnable Arbeitsfläche (dh Styropor) auf einem Tierchirurgie Fach oder Tischbank in der Nähe der Perfusion System. </li><li> Wischen Sie die Brust und Bauch mit 70% Ethanol. Machen Sie eine Mittellinie Haut incision von Mitte Bauch auf die Membran mit einer chirurgischen Schere. </li><li> Schneiden Sie die Membran mit einem anderen chirurgischen Schere und halten Sie das Brustbein mit gekrümmten gezackten Pinzette. Schneiden bilateral und Retroflect Brustkorb, das Herz freizulegen. </li><li> Heben Sie das Herz etwas mit feinen geschwungenen gezackt und atraumatischen Pinzette und sezieren das Herz aus dem Brustraum so nah wie möglich an der dorsalen Thoraxwand. </li><li> Übertragen Sie das Herz zu einer 100-mm-Schale mit kaltem Perfusionspuffer. Sorgfältig schneiden Sie das Bindegewebe wie Lunge, Thymus und Bronchien. </li><li> Identifizieren Sie die Aorta und ihre Schädel Zweige, die in der Regel von Thymus und Fettpolster versteckt sind. Schneiden Sie die Aorta unterhalb der ersten Filiale 13, fassen Sie die Aortenwand, heben Sie die Herzen und leicht rutschen sie auf die Perfusion mit Flüssigkeit gefüllte Aorten-Kanüle (1,0 mm OD Kanüle aus rostfreiem Stahl mit stumpfen / flachen Spitze und Kerben 1 und 2 mm über die Spitze, oder ein 22 G wiederverwendbare Fütterung Nadel) unter Verwendung von zwei ultrafeinen Spitze-forceps. Hinweis: a) Die Perfusion Flüssigkeit sollte bei Herz-Kanülen tropft von Gasblasen aus der Eingabe der Herzkranzgefäße zu verhindern; b) Halten Sie die Spitze der Kanüle direkt über der Aortenklappe. </li><li> Klemmen Sie die Aorta an der Kanüle und Ligation der Aorta an der Kanüle mit 6-0 chirurgische Seide. Die ganze Kanülierung sollte weniger als 120 Sekunden dauern. </li></ol> 4. Herzdurchblutung und Verdauung <ol><li> Perfundieren das Herz mit Calcium-freier Perfusion Puffer bei Flussrate von 4 ml / min ca. 4-5 min, bis die Abwässer deutlich geworden, dann, um die Verdauung Puffer, der 50 uM CaCl 2 ein-und durchströmen für 3,5 bis 20 min je nach Mausstamm, Perfusionsdruck und Collagenase-Aktivität. Erhöhen Sie ggf. die Aorta Druck auf 70-80 mmHg, wenn verdauen. Wenn nötig, kann die Enzym Perfusat für die Verdauung zurückgeführt werden. Typischerweise 300 U / ml Enzympuffer wird ein Herz in 10-12 min bei einer Flussrate von 4 ml / min zu verdauen;Wenn die Anwendung Nachlast Druck bei 70 mmHg, wird 300 U / ml nur 3,5-5,5 min bei einer Flussrate von 4 ml / min statt. </li><li> Stoppen Sie die Verdauung, wenn das Herz wird leicht blass und schlaff. Es sollte schwammig sein, wenn sanft eingeklemmt. </li></ol> 5. Cells Dissoziation und Calcium Wiedereinführung <ol><li> Ziehen Sie die Aorta aus der Kanüle mit 70% Ethanol-getränkten Zange und legte das Herz in eine sterile 60-mm-Schale, die 2,5 ml Aufschlusspuffer. Bewegen Sie in die Kultur mit sterilen Haube liefert, bleiben bewusst sterile Techniken für diese und Follow-up-Maßnahmen. </li><li> Entfernen Aorta, Atrien und der großen Gefäße mit feinen chirurgischen Schere. Necken Sie vorsichtig die Herzkammer in 10-12 kleine Stücke mit zwei feinen Spitze Pinzette. </li><li> Vorsichtig pipettieren Herzstücke und Zellen auf und ab ~ 10x mit einem 10-ml Transferpipette und Transfer zu einem 15-ml-Polypropylen-konischen Rohr dann. Mit 7,5 ml Calciumlösung I mit 12,5 uM CaCl 2 und Transfer Spülen Sie den Tellerdiese in das Rohr, wodurch ein Endvolumen von 10 ml gelöst. </li><li> Pipette vorsichtig die Zellsuspension nach oben und unten mit einer feinen Spitze-Transferpipette, die große Stücke von Herzgewebe zu zerstreuen. </li><li> Anschließend zentrifugieren für 3 Minuten bei 20 × g zur Abtrennung kleiner nicht-Myozyten-Zellen, wie Endothelzellen und Fibroblasten. </li><li> Absaugen der Überstand und resuspendieren myocyte Pellet in 10 ml Calcium-Lösung, die ich mit einem Zuschlag von 100 ul 200 mM ATP (pH-Wert 7,2, Stammlösung, Filter-sterilisiert). Lassen Sie das Rohr in der Haube für 3-5 min. </li><li> Über duplizieren 10 ul Aliquoten zu einer Hämazytometer zu stabförmige und runde Muskelzellen zählen. Berechnen der Gesamtzahl von Myozyten und berechnet den Prozentsatz von stabförmigen Myozyten. </li><li> Zentrifugieren Sie die Muskelzellen für 3 min bei 20 x g. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml Calcium-Lösung II, enthaltend 100 &amp;mgr; M CaCl 2. Dispersions die Myozyten mit der feinen Spitze-Transferpipette durch Pipettierenoben und unten. </li><li> Wiederholen des obigen Schritts (5.8) unter Verwendung von Calciumlösung III (400 &amp;mgr; M CaCl 2) und IV (900 &amp;mgr; M CaCl 2) auf. </li><li> Für Maus myocyte Primärkultur, suspendieren die endgültige myocyte Pellet in 5 ml Plattierungsmedium. Zählen der Gesamtzahl von Myozyten und berechnet den Prozentsatz von stabförmigen Myozyten. </li></ol> 6. Zellkultur <ol><li> Die Konzentration an stabförmigen Myozyten 25.000 stabförmigen Myozyten / ml in einem 50-ml-Röhrchen. Vorsichtig pipettieren Muskelzellen mit einem 10-ml-Pipette, um sie gut zu suspendieren. Vermeiden Zellzentrifugation in der Pipette und Rohr gleich Zelldichte für jede Schüssel oder Platte zu gewährleisten. </li><li> Nach Absaugen der Laminin-Beschichtungslösung, die Platte Muskelzellen in diese Gerichte oder Platten. Sanft gleiten die Teller oder Platten nach vorne und hinten und von Seite zu Seite in einem kreuzartigen Muster drei bis vier Mal an der Oberfläche des Kulturhaube. </li><li> Die Schalen oder Platten in einer 2% CO2-Inkubator bei 37 ° C. Inkubation für 1-3 h auf Myozyten Befestigung mit einer Geschwindigkeit von etwa 80% zu ermöglichen. </li><li> Nach der Befestigung vorsichtig absaugen das Medium, das ungebunden Muskelzellen und Zelltrümmer. Kulturmedium hinzufügen, vorsichtig an den Seiten der Gerichte oder Platten. Führen Sie diese Mediumwechsel nacheinander. Die Gerichte oder Platten sofort in den Inkubator zurück. </li><li> Nach O / N-Kultur können die Muskelzellen auf das gleiche Medium ohne BDM vor dem Studium der kurzfristigen Zell-Signal verändert werden. Halten Sie das BDM in Langzeitkultur für hypertrophe oder Apoptose-Assays. Hinweis: BDM (2,3-Butandion Monoxim) kann die Myosin-ATPase hemmen und Kontraktion. Die Hemmung der Myosin-basierte Kontraktion leicht reversibel. Es wird berichtet, dass BDM kann einige mögliche Nebenwirkungen, wie etwa die eines nicht-spezifischen Phosphatase, erhöhte Calcium-Freisetzung aus SR und Veränderung der freien Calcium-Konzentration und zellulären elektrischen prope habenrties, so vor der Behandlung, der BDM sollte entfernt werden. Ferner wird in einigen Fällen eine bestimmte Myosin II Inhibitor blebbistatin könnte eine Alternative zu Kardiomyozyten Medikament Kontraktion 8,9 hemmen. Doch in unserem Fall ist BDM besser als blebbistatin aus Gründen der Qualität und Quantität der Kardiomyozyten. </li></ol>

<ol>
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Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Für die beste Vorbereitung, sind die wichtigsten Schritte: 1) unverzüglich Anschließen der Maus Herz mit der Kanüle nach der Exzision; 2) geeignete Herzdurchblutung. Beachten Sie auch, dass die Wasserqualität, die Durchblutung Temperatur, pH-Puffer, Sterilisation, chemische Reinheit und sauber, nicht kontaminierte Rohre und Kammern sind ebenfalls wichtige Faktoren. 18,2 mOhm Molekularbiologie-Grade-H 2 O ist sehr für Puffer Vorbereitung empfohlen. Der pH-Wert von 200 mM ATP Stammlösung sollte auf 7,2, ein Schritt, der leic...

Kardiomyozyten sind nicht proliferativen. Es gibt einige atrialen Kardiomyozyten-Zelllinien, wie HL-1 und AT-1 Zellen von Maus Vorhof Tumoren abgeleitet sind; jedoch gibt es keine Erwachsenen ventrikulären Kardiomyozyten Zelllinien für die Forschung zur Verfügung. Primärzellkulturen von adulten Maus Kardiomyozyten eine leistungsstarke Modell für Herzforschung auf zellulärer und molekularer Ebene. Bisher sie weitgehend für biochemische, physiologische und pharmakologische Forschung 1 verwendet wurden. Darüber hinaus hat die häufige Verwendung von genetisch veränderten Mäusen effektive Methoden der Kardiomyozyten-Isolation notwendig. Kultur pur ermöglicht Bedingungen frei von Wechselwirkungen mit anderen Organen und den systemischen Kreislauf, zB durch endogene neurohormonalen und hormonähnlichen Faktoren 2,3. Allerdings kann erfolgreiche Isolierung von Kardiomyozyten Herausforderung sein. Das Protokoll wir hier vorstellen wird auf unseren Erfahrungen mit erwachsenen Ratte cardiomyocyt Basisn und die von O&#39;Connell et al 4,5 beschriebenen Methode. Vor allem im Jahr 2007 5 beschrieben sie detaillierte Techniken aus Puffer Vorbereitungen zur Zellkultur-und Funktionstest. Seit Muskelzellen der Maus sind sehr anfällig für Kontraktur im Vergleich zu den Ratten-Herzmuskelzellen, werden die Puffer oder Medien für die Durchblutung, Verdauung, Ca 2 + Duldung, Beschichtung und Kultur in der Maus-Protokoll verwendet, mit einer unspezifischen Erregung und Kontraktion Kopplung Inhibitor, 2 ergänzt, 3-Butandion Monoxim (BDM), um ihre spontane Kontraktion hemmen, daher die Rentabilität und den Ertrag von stabförmigen Muskelzellen deutlich verbessern. In der hier vorgestellten Protokoll werden die Muskelzellen in einem hohen Kalium-Puffer aus dem isolierten Herzen durch modifizierte Langendorff-Perfusion mit Kollagenase Typ II getrennt. Collagenase II effektiv bricht die interzelluläre Matrix und gibt Zellen. Die Perfusion Lösung hält auch den Zellstoffwechsel auf niedrigem Niveau 6. In additiauf das isolierte Herz System von Harvard Apparatus verwendeten wir hier für eine präzise Temperatur-und Konstantdruckregelung 7 gut entwickelt. Dieser Ansatz bietet hoch reproduzierbare und gleichmäßige Zubereitungen Populationen Zelltyp, der in Übernachtkultur zum Messen Signalproteine ​​oder 2-3 Tage alten Kultur für Herzhypertrophie Assays verwendet werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Technologische Fortschritte haben genetisch veränderte Mäuse, einschließlich transgener und Gen-Knockout-Mäusen, ein wesentliches Instrument in vielen Forschungsfeldern. Adulte Kardiomyozyten sind weit verbreitet als ein gutes Modell für die Herzzellphysiologie und Pathophysiologie sowie für pharmazeutische Intervention angenommen. Genetisch veränderte Mäuse, schließen die Notwendigkeit für komplizierte Kardiomyozyten Infektionsprozessen, um den gewünschten Genotyp, was ineffizient aufgrund der terminalen Differenzierung Kardiomyozyten &#39;sind zu generieren. Isolation und Kultur von hoher Quantität und Qualität funktionellen Kardiomyozyten wird dramatisch profitieren Herz-Kreislaufforschung und ein wichtiges Instrument für die Zellsignalübertragung Forschung und Wirkstoffentwicklung. Hier beschreiben wir eine gut etablierte Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus, die mit wenig Training umgesetzt werden können. Die Maus Herz herausgeschnitten und zu einem isolierten Herzsystem Kanüle, dann mit einem Calcium-frei und hoch p blutetenotassium Puffer, gefolgt von Typ-II-Kollagenase-Verdauung im Langendorff-Modus retrograde Perfusion. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Sammlung von Funktions erwachsenen Maus Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

1. Erfolgreiche Isolation Quantifizierung Zwei Kriterien werden verwendet, um den Erfolg der Isolation zu quantifizieren: erstens, die Gesamtzahl der Kardiomyozyten isoliert, und zweitens, das Verhältnis von stabförmigen Calcium-tolerant zu runden nicht tolerant Muskelzellen. Generell dieses Protokoll dauert etwa 75-90 min von Herzen Entfernung zu myocyte Beschichtung und Erträge rund 1 Mio. stabförmigen Kardiomyozyten (70-90% der Gesamt geerntet Muskelzellen) von einer erwachsenen Maus Her...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.3K Aufrufe.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen. 

Serie: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Forschung

Biologie

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...