Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
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Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute Zuschuss HL-36573 unterstützt. Wir danken Herrn David Sowa für die Bearbeitung dieses Manuskript.

Alle Forschung an Mäusen wurde nach Verfahren und Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt, und die Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Toledo, Hochschule für Medizin und Lebenswissenschaften genehmigt. 1. Perfusionssystem Vorbereitung <ol><li> Der Tag vor der Isolierung, füllen die gesamte Durchblutung System (einschließlich Stauseen) mit einer Lösung von alkalischen schnell rückstandsfreie Reinigungsmittel. Lassen Sie die Lösung in das System für einige Stunden oder über Nacht einweichen. </li><li> Am nächsten Morgen, stellen Sie den Thermocycler Temperatur auf 37 ° C und die Lösung, um sich aufzuwärmen. Entfernen Sie die Reinigungslösung und spülen Sie das System gründlich mit sterilisiertem destilliertem Wasser. Vergessen Sie nicht, alle Seitenäste. </li><li> Füllen Sie das System mit Perfusionspuffer über eine Konstante Schlauchpumpe und zeichnen mögliche Luftblasen aus der Aorta Kammer (Luftfalle) mit einer seitlich angebrachten Spritze zum Schutzdas Herz von der koronaren Okklusion. Die Strömungsrate der peristaltischen Pumpe regelmäßig überprüft werden. </li></ol> 2. Herstellung von Puffern, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Perfusion Buffer: Stellen Sie 500 ml 1x Perfusionspuffer vor der Verwendung. Diese Calcium-freien Puffer enthält 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0,6 mM Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSO 4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO 3, 10 mM KHCO 3, 0,032 mM Phenolrot, 30 mM Taurin, 10 mM BDM und 5,5 mM Glucose. Den pH-Wert auf 7,0 mit 2 M HCl und durch ein 0,2 um Filter, Lagerung bei 4 ° C Anmerkung: a) Die Perfusionslösung sollte am gleichen Tag hergestellt werden, wenn es verwendet wird. In einigen Fällen ist es akzeptabel, die Lösung weniger als 3 Tage bei 4 ° C aufbewahren b) Dieser Puffer hat einen hohen Kalium-Konzentration von bis zu 15,3 mM, die die Herzmuskelzellen Ruhe halten können, zu reduzieren ATP consumption und erhöhen die Ca 2 +-Fähigkeit tolerant. </li><li> Digestion Buffer (300 U / ml, 25-50 ml / Herz): Vorbereitung unmittelbar vor der Perfusion. Wiegen 15.000 U Gesamtaktivität von Typ-II-Kollagenase, in 50 ml Perfusionspuffer in Kultur Haube lösen. In 25 ul 100 mM CaCl 2 (Stammlösung, Filter sterilisiert), um die endgültige Calciumkonzentration machen 50 uM. Wärmen Sie den Puffer auf 37 ° C, wenn Sie bereit für die Isolierung. Im Gegensatz zu Trypsin, Collagenase am besten in Gegenwart von 50-100 &amp;mgr; M Ca 2 +. </li><li> Anschlagpuffer (50 ml / Herz): Betreiben Sie in Kultur Kapuze. Mischungs 45 ml Perfusionspuffer mit 5 ml sterilem FBS. <ol><li> Ca 2 +-Lösung I (12,5 &amp;mgr; M Ca 2 +): In 2,5 &amp;mgr; l 100 mM CaCl 2 und 20 ml Stoppuffer und mischen. </li><li> Ca 2 +-Lösung II (100 &amp;mgr; M Ca 2 +): In 10 ul 100 mM CaCl 2 und 10 ml Stoppuffer und mischen. </li><li> Ca 2 +-Lösung III (400 &amp;mgr; M Ca 2 +): In 40 ul 100 mM CaCl 2 und 10 ml Stoppuffer und mischen. </li><li> Ca 2 +-Lösung IV (900 &amp;mgr; M Ca 2 +): In 90 ul 100 mM CaCl 2 und 10 ml Stoppuffer und mischen. </li></ol></li><li> Plating-Medium (50 ml / Herz): Transfer 43 ml MEM mit 2 mM L-Glutamin und 1,26 mM CaCl 2 in ein steriles 50-ml konischen Röhrchen in Kultur Kapuze und 5 ml FBS, 1 ml BDM-Stammlösung ( 500 mm, filtersterilisiert), und 0,5 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml). Mischen und ins Gleichgewicht für 2-3 Stunden vor myocyte Isolation in 2% CO 2, 37 ° C Inkubator mit den Kappen lose. Kurz vor myocyte Beschichtung, 0,5 ml 200 mM ATP (pH-Wert 7,2, Stammlösung, Filter-sterilisiert) in das Medium. </li><li> Kulturmedium (50 ml / Herz): Transfer 48 ml MEM mit 2 mM L-Glutamin und 1,26 mM CaCl 2 in ein steriles 50-ml konischen Röhrchen in Kultur Kapuze und 1 ml BDM-Stammlösung (500 mM, filter sterilisiert) und 0,5 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml). Mischen und ins Gleichgewicht in 2% CO 2, 37 ° C Inkubator vor myocyte Isolation. Vor der Verwendung werden 0,5 ml einer 100 mg / ml BSA (sterilfiltriert) in das Medium. Hinweis: Die Verwendung von 2% CO 2-Inkubator ermöglicht die Aufrechterhaltung der Kultur bei mittlerer pH 6,9 bis 7,0, die die myoctyes behalten ihre stäbchenförmige Morphologie bis zu 24 Stunden hilft. </li><li> Laminin (1-2 &amp;mgr; g / cm 2)-beschichteten Schalen oder Platten: Transfer 200 ul 1 mg / ml Maus-Laminin natürliche zu 20 ml sterilisiertem PBS (w / o Calcium und Magnesium) und mischen. 1 ml auf 35-mm-Platten, 2,5 ml auf 60-mm-Schalen, oder 5 ml bis 100-mm-Schalen, schütteln gleichmäßig bedecken die Oberflächen und in 2% CO 2, 37 ° C Inkubator bis Myozyten-Beschichtung. Hinweis: Wenn der Schalen oder Platten nicht am Tag beschichtet verwendet werden, können sie mit Parafilm versiegelt und bei 4 ° C über Nacht (langsame Coating) gespeichert. Die Abdichtung ist requIRED Verdunstung und Verunreinigung zu verhindern. Beschichteten Platten können bei 4 ° C für bis zu 1 Woche aufbewahrt. </li></ol> 3. Maus Herz Aus-und Kanülierung <ol><li> Weichen Sie die Schere und Pinzette in 70% Ethanol für 30 Minuten und lassen Sie sie trocknen. </li><li> Wiegen Sie die Maus, um 0,1 Gramm. Nehmen Sie seine Körpergewicht, Stamm, Geschlecht und Geburtsdatum. </li><li> Injizieren 200 ul Heparin (100 IU / Maus) ip 10 min vor der Anästhesie, um die Koagulation von Blut in die Koronararterien zu verhindern. Anesthetize die Maus mit 200 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin durch ip-Injektion und warten 5-10 Minuten, bis die Maus nicht mehr reagiert bis zum Schwanz / Zeh drückt. </li><li> Sichern Sie die Maus in die Rückenlage, indem Sie vorsichtig die Festsetzung der Vorderpfoten und Hinterpfoten an einen pinnable Arbeitsfläche (dh Styropor) auf einem Tierchirurgie Fach oder Tischbank in der Nähe der Perfusion System. </li><li> Wischen Sie die Brust und Bauch mit 70% Ethanol. Machen Sie eine Mittellinie Haut incision von Mitte Bauch auf die Membran mit einer chirurgischen Schere. </li><li> Schneiden Sie die Membran mit einem anderen chirurgischen Schere und halten Sie das Brustbein mit gekrümmten gezackten Pinzette. Schneiden bilateral und Retroflect Brustkorb, das Herz freizulegen. </li><li> Heben Sie das Herz etwas mit feinen geschwungenen gezackt und atraumatischen Pinzette und sezieren das Herz aus dem Brustraum so nah wie möglich an der dorsalen Thoraxwand. </li><li> Übertragen Sie das Herz zu einer 100-mm-Schale mit kaltem Perfusionspuffer. Sorgfältig schneiden Sie das Bindegewebe wie Lunge, Thymus und Bronchien. </li><li> Identifizieren Sie die Aorta und ihre Schädel Zweige, die in der Regel von Thymus und Fettpolster versteckt sind. Schneiden Sie die Aorta unterhalb der ersten Filiale 13, fassen Sie die Aortenwand, heben Sie die Herzen und leicht rutschen sie auf die Perfusion mit Flüssigkeit gefüllte Aorten-Kanüle (1,0 mm OD Kanüle aus rostfreiem Stahl mit stumpfen / flachen Spitze und Kerben 1 und 2 mm über die Spitze, oder ein 22 G wiederverwendbare Fütterung Nadel) unter Verwendung von zwei ultrafeinen Spitze-forceps. Hinweis: a) Die Perfusion Flüssigkeit sollte bei Herz-Kanülen tropft von Gasblasen aus der Eingabe der Herzkranzgefäße zu verhindern; b) Halten Sie die Spitze der Kanüle direkt über der Aortenklappe. </li><li> Klemmen Sie die Aorta an der Kanüle und Ligation der Aorta an der Kanüle mit 6-0 chirurgische Seide. Die ganze Kanülierung sollte weniger als 120 Sekunden dauern. </li></ol> 4. Herzdurchblutung und Verdauung <ol><li> Perfundieren das Herz mit Calcium-freier Perfusion Puffer bei Flussrate von 4 ml / min ca. 4-5 min, bis die Abwässer deutlich geworden, dann, um die Verdauung Puffer, der 50 uM CaCl 2 ein-und durchströmen für 3,5 bis 20 min je nach Mausstamm, Perfusionsdruck und Collagenase-Aktivität. Erhöhen Sie ggf. die Aorta Druck auf 70-80 mmHg, wenn verdauen. Wenn nötig, kann die Enzym Perfusat für die Verdauung zurückgeführt werden. Typischerweise 300 U / ml Enzympuffer wird ein Herz in 10-12 min bei einer Flussrate von 4 ml / min zu verdauen;Wenn die Anwendung Nachlast Druck bei 70 mmHg, wird 300 U / ml nur 3,5-5,5 min bei einer Flussrate von 4 ml / min statt. </li><li> Stoppen Sie die Verdauung, wenn das Herz wird leicht blass und schlaff. Es sollte schwammig sein, wenn sanft eingeklemmt. </li></ol> 5. Cells Dissoziation und Calcium Wiedereinführung <ol><li> Ziehen Sie die Aorta aus der Kanüle mit 70% Ethanol-getränkten Zange und legte das Herz in eine sterile 60-mm-Schale, die 2,5 ml Aufschlusspuffer. Bewegen Sie in die Kultur mit sterilen Haube liefert, bleiben bewusst sterile Techniken für diese und Follow-up-Maßnahmen. </li><li> Entfernen Aorta, Atrien und der großen Gefäße mit feinen chirurgischen Schere. Necken Sie vorsichtig die Herzkammer in 10-12 kleine Stücke mit zwei feinen Spitze Pinzette. </li><li> Vorsichtig pipettieren Herzstücke und Zellen auf und ab ~ 10x mit einem 10-ml Transferpipette und Transfer zu einem 15-ml-Polypropylen-konischen Rohr dann. Mit 7,5 ml Calciumlösung I mit 12,5 uM CaCl 2 und Transfer Spülen Sie den Tellerdiese in das Rohr, wodurch ein Endvolumen von 10 ml gelöst. </li><li> Pipette vorsichtig die Zellsuspension nach oben und unten mit einer feinen Spitze-Transferpipette, die große Stücke von Herzgewebe zu zerstreuen. </li><li> Anschließend zentrifugieren für 3 Minuten bei 20 × g zur Abtrennung kleiner nicht-Myozyten-Zellen, wie Endothelzellen und Fibroblasten. </li><li> Absaugen der Überstand und resuspendieren myocyte Pellet in 10 ml Calcium-Lösung, die ich mit einem Zuschlag von 100 ul 200 mM ATP (pH-Wert 7,2, Stammlösung, Filter-sterilisiert). Lassen Sie das Rohr in der Haube für 3-5 min. </li><li> Über duplizieren 10 ul Aliquoten zu einer Hämazytometer zu stabförmige und runde Muskelzellen zählen. Berechnen der Gesamtzahl von Myozyten und berechnet den Prozentsatz von stabförmigen Myozyten. </li><li> Zentrifugieren Sie die Muskelzellen für 3 min bei 20 x g. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml Calcium-Lösung II, enthaltend 100 &amp;mgr; M CaCl 2. Dispersions die Myozyten mit der feinen Spitze-Transferpipette durch Pipettierenoben und unten. </li><li> Wiederholen des obigen Schritts (5.8) unter Verwendung von Calciumlösung III (400 &amp;mgr; M CaCl 2) und IV (900 &amp;mgr; M CaCl 2) auf. </li><li> Für Maus myocyte Primärkultur, suspendieren die endgültige myocyte Pellet in 5 ml Plattierungsmedium. Zählen der Gesamtzahl von Myozyten und berechnet den Prozentsatz von stabförmigen Myozyten. </li></ol> 6. Zellkultur <ol><li> Die Konzentration an stabförmigen Myozyten 25.000 stabförmigen Myozyten / ml in einem 50-ml-Röhrchen. Vorsichtig pipettieren Muskelzellen mit einem 10-ml-Pipette, um sie gut zu suspendieren. Vermeiden Zellzentrifugation in der Pipette und Rohr gleich Zelldichte für jede Schüssel oder Platte zu gewährleisten. </li><li> Nach Absaugen der Laminin-Beschichtungslösung, die Platte Muskelzellen in diese Gerichte oder Platten. Sanft gleiten die Teller oder Platten nach vorne und hinten und von Seite zu Seite in einem kreuzartigen Muster drei bis vier Mal an der Oberfläche des Kulturhaube. </li><li> Die Schalen oder Platten in einer 2% CO2-Inkubator bei 37 ° C. Inkubation für 1-3 h auf Myozyten Befestigung mit einer Geschwindigkeit von etwa 80% zu ermöglichen. </li><li> Nach der Befestigung vorsichtig absaugen das Medium, das ungebunden Muskelzellen und Zelltrümmer. Kulturmedium hinzufügen, vorsichtig an den Seiten der Gerichte oder Platten. Führen Sie diese Mediumwechsel nacheinander. Die Gerichte oder Platten sofort in den Inkubator zurück. </li><li> Nach O / N-Kultur können die Muskelzellen auf das gleiche Medium ohne BDM vor dem Studium der kurzfristigen Zell-Signal verändert werden. Halten Sie das BDM in Langzeitkultur für hypertrophe oder Apoptose-Assays. Hinweis: BDM (2,3-Butandion Monoxim) kann die Myosin-ATPase hemmen und Kontraktion. Die Hemmung der Myosin-basierte Kontraktion leicht reversibel. Es wird berichtet, dass BDM kann einige mögliche Nebenwirkungen, wie etwa die eines nicht-spezifischen Phosphatase, erhöhte Calcium-Freisetzung aus SR und Veränderung der freien Calcium-Konzentration und zellulären elektrischen prope habenrties, so vor der Behandlung, der BDM sollte entfernt werden. Ferner wird in einigen Fällen eine bestimmte Myosin II Inhibitor blebbistatin könnte eine Alternative zu Kardiomyozyten Medikament Kontraktion 8,9 hemmen. Doch in unserem Fall ist BDM besser als blebbistatin aus Gründen der Qualität und Quantität der Kardiomyozyten. </li></ol>

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F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Für die beste Vorbereitung, sind die wichtigsten Schritte: 1) unverzüglich Anschließen der Maus Herz mit der Kanüle nach der Exzision; 2) geeignete Herzdurchblutung. Beachten Sie auch, dass die Wasserqualität, die Durchblutung Temperatur, pH-Puffer, Sterilisation, chemische Reinheit und sauber, nicht kontaminierte Rohre und Kammern sind ebenfalls wichtige Faktoren. 18,2 mOhm Molekularbiologie-Grade-H 2 O ist sehr für Puffer Vorbereitung empfohlen. Der pH-Wert von 200 mM ATP Stammlösung sollte auf 7,2, ein Schritt, der leic...

Kardiomyozyten sind nicht proliferativen. Es gibt einige atrialen Kardiomyozyten-Zelllinien, wie HL-1 und AT-1 Zellen von Maus Vorhof Tumoren abgeleitet sind; jedoch gibt es keine Erwachsenen ventrikulären Kardiomyozyten Zelllinien für die Forschung zur Verfügung. Primärzellkulturen von adulten Maus Kardiomyozyten eine leistungsstarke Modell für Herzforschung auf zellulärer und molekularer Ebene. Bisher sie weitgehend für biochemische, physiologische und pharmakologische Forschung 1 verwendet wurden. Darüber hinaus hat die häufige Verwendung von genetisch veränderten Mäusen effektive Methoden der Kardiomyozyten-Isolation notwendig. Kultur pur ermöglicht Bedingungen frei von Wechselwirkungen mit anderen Organen und den systemischen Kreislauf, zB durch endogene neurohormonalen und hormonähnlichen Faktoren 2,3. Allerdings kann erfolgreiche Isolierung von Kardiomyozyten Herausforderung sein. Das Protokoll wir hier vorstellen wird auf unseren Erfahrungen mit erwachsenen Ratte cardiomyocyt Basisn und die von O&#39;Connell et al 4,5 beschriebenen Methode. Vor allem im Jahr 2007 5 beschrieben sie detaillierte Techniken aus Puffer Vorbereitungen zur Zellkultur-und Funktionstest. Seit Muskelzellen der Maus sind sehr anfällig für Kontraktur im Vergleich zu den Ratten-Herzmuskelzellen, werden die Puffer oder Medien für die Durchblutung, Verdauung, Ca 2 + Duldung, Beschichtung und Kultur in der Maus-Protokoll verwendet, mit einer unspezifischen Erregung und Kontraktion Kopplung Inhibitor, 2 ergänzt, 3-Butandion Monoxim (BDM), um ihre spontane Kontraktion hemmen, daher die Rentabilität und den Ertrag von stabförmigen Muskelzellen deutlich verbessern. In der hier vorgestellten Protokoll werden die Muskelzellen in einem hohen Kalium-Puffer aus dem isolierten Herzen durch modifizierte Langendorff-Perfusion mit Kollagenase Typ II getrennt. Collagenase II effektiv bricht die interzelluläre Matrix und gibt Zellen. Die Perfusion Lösung hält auch den Zellstoffwechsel auf niedrigem Niveau 6. In additiauf das isolierte Herz System von Harvard Apparatus verwendeten wir hier für eine präzise Temperatur-und Konstantdruckregelung 7 gut entwickelt. Dieser Ansatz bietet hoch reproduzierbare und gleichmäßige Zubereitungen Populationen Zelltyp, der in Übernachtkultur zum Messen Signalproteine ​​oder 2-3 Tage alten Kultur für Herzhypertrophie Assays verwendet werden können.

<table><tbody><tr><td>Isolated heart system for small rodent</td><td>Harvard Apparatus</td><td>IHSR-mouse 73-4019</td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-2816</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11294-00</td><td></td></tr><tr><td>Straight sharp serrated scissors</td><td>Fine science tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>Serrated Graefe forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved, serrated Graefe forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Straight Mini Serrefines clamps</td><td>Fine science tools</td><td>18054-28</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11575-032</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Mucosal universal detergent</td><td>Sigma</td><td>Z637181</td><td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Technologische Fortschritte haben genetisch veränderte Mäuse, einschließlich transgener und Gen-Knockout-Mäusen, ein wesentliches Instrument in vielen Forschungsfeldern. Adulte Kardiomyozyten sind weit verbreitet als ein gutes Modell für die Herzzellphysiologie und Pathophysiologie sowie für pharmazeutische Intervention angenommen. Genetisch veränderte Mäuse, schließen die Notwendigkeit für komplizierte Kardiomyozyten Infektionsprozessen, um den gewünschten Genotyp, was ineffizient aufgrund der terminalen Differenzierung Kardiomyozyten &#39;sind zu generieren. Isolation und Kultur von hoher Quantität und Qualität funktionellen Kardiomyozyten wird dramatisch profitieren Herz-Kreislaufforschung und ein wichtiges Instrument für die Zellsignalübertragung Forschung und Wirkstoffentwicklung. Hier beschreiben wir eine gut etablierte Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus, die mit wenig Training umgesetzt werden können. Die Maus Herz herausgeschnitten und zu einem isolierten Herzsystem Kanüle, dann mit einem Calcium-frei und hoch p blutetenotassium Puffer, gefolgt von Typ-II-Kollagenase-Verdauung im Langendorff-Modus retrograde Perfusion. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Sammlung von Funktions erwachsenen Maus Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

1. Erfolgreiche Isolation Quantifizierung Zwei Kriterien werden verwendet, um den Erfolg der Isolation zu quantifizieren: erstens, die Gesamtzahl der Kardiomyozyten isoliert, und zweitens, das Verhältnis von stabförmigen Calcium-tolerant zu runden nicht tolerant Muskelzellen. Generell dieses Protokoll dauert etwa 75-90 min von Herzen Entfernung zu myocyte Beschichtung und Erträge rund 1 Mio. stabförmigen Kardiomyozyten (70-90% der Gesamt geerntet Muskelzellen) von einer erwachsenen Maus Her...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

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Serie: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Forschung

Biologie

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Medizin

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und

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