Dieses Projekt wurde für Durchbruch biomedizinische Forschung von der UCSF-Programm finanziert werden (finanziert zum Teil von der Sandler-Stiftung), der NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738) und der Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ wurde durch ein Postdoc-Stipendium von der NIH (T32HL007731) unterstützt. Die Autoren sind allein verantwortlich für den Inhalt dieser Arbeit, die nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

Alle Verfahren hier skizziert wurden von der Institutional Animal Benutzung und Pflege Ausschuss an der University of California, San Francisco genehmigt. HINWEIS: Kurz nachdem das Herz aus dem Maus - Thorax, koronare Retroperfusion verwendet wird Extraktion effizient die extrazelluläre Matrix mit Kollagenase und Protease XIV zu verdauen. Die Ventrikel werden dann isoliert, mechanisch dissoziiert und in eine Einzelzellsuspension filtriert. Schwerkraftsedimentation durchgeführt wird Kardiomyozyten, die getrennt sind von Stromazellen, wie Fibroblasten und Endothelzellen durch ihre hohe Dichte zu isolieren. Die gereinigten Kardiomyozyten können für Wochen auf Laminin beschichteten Polystyrol und transduziert mit Adenovirus Genvektoren kultiviert werden. 1. Cardiomyocyte Isolation <ol><li> Bereiten Sie Puffer, OP - Station und Perfusionsgerät <ol><li> Bereiten Sie Puffern und Medien gemäß Table 1. </li><li> Schalten Sie zirkulierendes Wasserbad, eingestellt Eingangstemperatur so, dass die Ausgabe von erhitztem Wassermantel mit einer Temperatur von 37 ° C erreicht. </li><li> Saubere Perfusionssystem nach mit 70% Ethanol gespült. Dann entfernen Sie alle Spuren von Ethanol aus dem System durch mit mehreren Volumina von sterilem Wasser gespült wird. </li><li> Legen Sie das Perfusionssystem mit Perfusions - Puffer (Tabelle 1). Erste Ablaufwasser aus dem System, dann mit 2 Volumina Perfusionspuffer spülen. Füllen Sie dann den toten Raum mit Perfusionspuffer, so dass die innere Säule des Wärmejacke mit Perfusionspuffer gefüllt ist, aber die Blasenfreimachungsmittel Kammer ist leer. TIPP: Achten Sie darauf , keine Luftblasen vorhanden sind , in der Zeile unter der Blasenfreimachungsmittel Kammer. Zum Entfernen von widerspenstigen Blasen, greifen alle Absperrhähne und erlauben Druck aufzubauen innerhalb der Linie für ein paar Sekunden. Dann lassen Sie die untere Absperrhahn, so dass die Hochdruck-Perfusion Puffer Strahl aus der Steckdose; die schnelle Strömung und Turbulence helfen Blasen entfernen, die in der Nähe der Perfusions-Ausgang gefangen werden. </li><li> Bereiten Sie eine Spritze mit Nadel werden für Aorten-Kanülierung verwendet. Bringen Sie eine 18 G stumpfe Nadel in eine 1-ml-Spritze mit Perfusions-Puffer gefüllt. Entfernen Sie Luftblasen und fixieren Sie die Spritzeneinheit an einem Arm des Sezieren miscroscope Illuminator mit Labor-Band. TIPP: Um eine stumpfe dige Nadel aus einer abgeschrägten Nadel, transect die Nadelwelle mit Drahtschneider erstellen. Dann schärfen die Spitze mit einem Schleifstein, bis die Spitze flach ist. Hinweis: Die Verwendung einer Rasierklinge , um ein Verrutschen der Aorta von der Nadel während der Kanülierung reduzieren, die Welle der Kanülierung Nadel aufrauen. Sichern die Nadel durch die Nabe und die obere Welle, sah dann das Rasiermesser hin und her senkrecht zur Längsachse des Nadelschafts während des Drehens bis mehrere Nuten haben, innerhalb von 1 cm von der Spitze der Nadelschaft geschaffen. Wechseln Sie zu einem neuen Rasierapparat, wenn die Klinge stumpf wird. </li><li> Ein sauberesPetrischale unter dem Binokular das Herz während der Kanülierung zu enthalten. Positionieren Sie den Illuminator Arm, so dass die Spitze der Kanüle ist in der Nähe der Kante des Sichtfeldes, aber nicht die Dissektion zu behindern. Sicherstellen, dass die Spitze der Kanüle unter dem Rand der Petrischale ist. HINWEIS: Um zu helfen , das Herz bei der Präparation zu immobilisieren, legen Sie eine kleine (~ 5 bis 7 cm 2) Quadrat von 215 Mikron Maschen in der Petrischale. Wenn das Herz auf dieser Masche gelegt wird, wird es Reibung erzeugen während der mechanischen Manipulation des Herzens zu reduzieren, Gleit- und Drehbewegung. </li><li> Tie 2 Nähte mit losen Doppelüberhandknoten um die Nabe der Kanülennadel zur Befestigung der Aorta eingesetzt werden. </li></ol></li><li> Herz - Extraktion und Kanülierung <ol><li> Verabreichen Heparin (5 IU / g Körpergewicht) über intraperitoneale Injektion. Warten 20 min das Heparin zu erlauben, an das Herz zu zirkulieren. </li><li> Anesthetize die Maus durch intraperitoneale Injection von 20% Ethylcarbamat (2 mg Ethylcarbamat / g Körpergewicht). Beachten Sie unbedingt, bis die Maus unter tiefer Narkose (ca. 3-5 min). HINWEIS: Tiefe der Anästhesie wird durch einen Mangel an beiden toe Prise und Corneareflexe bestätigt. Wenn die Maus nicht durch 8 erreicht tiefe Narkose hat - 10 min, dann eine zusätzliche Dosis von Ethylcarbamat verabreichen. Obwohl individuelle Reaktionen auf die Anästhesie zwischen Mäusen variieren, zum Scheitern tiefe Narkose bei der ersten Dosierung eintreten kann abgebaut Ethylcarbamatgehalts zeigen, die tiefe Narkose auch nach wiederholter Gabe entgegenstehen kann. Um Abbau zu verhindern, bereiten eine frische Lösung von Ethylcarbamat vor jedem Gebrauch. </li><li> Unbeweglichkeitseffekt die Maus in die Chirurgie-Plattform von jeder dieser Teile mit chirurgischen Band zu sichern. Desinfizieren Sie den Schnittbereich mit einer liberalen Menge von 70% Ethanol. Pat trocken mit einem Labor-wischen. </li><li> Heben Sie die Haut mit einer Pinzette Gewebe direkt unterhalb des Brustbeins. Machen Sie einen seitlichen Schnitt mit einer kleinen Schere, Schneiden throigitt die Haut und Bauch. </li><li> Verwenden Sie hemostats vorsichtig auf die Brustkorbs über das Brustbein anheben. Mit Hilfe von kleinen Dissektion Schere, erweitern den Einschnitt in einer V-Form in Richtung der Achselhöhlen. Schneiden durch die erste Rippe und durchstechen die Membran auf jeder Seite. </li><li> Weiter den Brustkorb mit hemostats und verwenden kleine Iris Schere zu heben, um vollständig die Membran transect. Achten Sie darauf, nicht das Herz zu durchbohren. </li><li> Ziehen Sie die ribcage rostral angebracht hemostats verwenden und schnell, aber sorgfältig die V-förmige Einschnitt erstrecken sich auf beiden Seiten durch den Brustkorb in Richtung der Achselhöhle durch Schneiden. Ziehen Sie den mittleren Abschnitt des Brustkorbs voll und legte sich die angeschlossenen hemostats in Position zu halten. </li><li> Entfernen Sie den Herzbeutel mit einer feinen Pinzette. </li><li> Während sanft das Herz mit einer gebogenen Pinzette heben, transect die Venen und an das Herz befestigt Arterien. Ab sofort legen Sie das Herz in eiskaltem Perfusionspuffer Muskelkontraktion zu verlangsamen. </li><li> Legen Sie das Herz in einer Petrischale unterein Präpariermikroskop (Platz auf einem kleinen Stück von 215 &amp; mgr; m-Mesh bei der Präparation zu helfen, zu immobilisieren). Trim überschüssige nicht-Herzgewebe mit feinen Iris Schere. Vorsicht, wenn Sie in der Nähe der Aorta zu schneiden. </li><li> TRANSECT die Aorta in der Nähe der brachioencephalic Arterie, und darauf achten, nicht zu lassen, Blasen oder Gewebedebris die Öffnung ein. </li><li> Füllen Sie die Petrischale das Herz mit eiskaltem Perfusionspuffer, so dass der Flüssigkeitspegel steigt über die Öffnung der Kanüle enthält. Ummanteln die Aorta auf die Kanüle, so dass die Spitze auf die Aortenklappe gerade distal ist. TIP: Um die Gefahr der Luftembolie zu verringern, leicht die Spritze an der Kanüle drücken vor Kanülierung, um mögliche Luftblasen zu entfernen , die am Ende der Kanüle entwickelt haben. Darüber hinaus halten die Spitze der Kanüle und die Aorta unter der Oberfläche der Lösung zu vermeiden, Blasen einzuführen, während die Aorta Ummantelung. </li><li> Schieben Sie eine vorgebundene 7-0 Seidennaht nach untender Schaft der Nadel und Kanülierung Position gerade über der Spitze der Nadel. Ziehen Sie den Knoten mit einer feinen Pinzette. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer zweiten Naht knapp über dem ersten platziert. HINWEIS: Sicherstellen , dass die Spitze der Nadel noch oberhalb der Aortenklappe ist vor und nach dem Anziehen. </li><li> Langsam drücken Sie die Spritze 0,5 ml Perfusionspuffer durch die Koronargefäße auszuwerfen. HINWEIS: Wenn die Kanülierung erfolgreich war, wird Blut sichtbar gemacht werden , um die Koronargefäße zu verlassen und aus den dorsalen Venen und Arterien Pooling. WICHTIG: Die Zeit von der Öffnung der Brusthöhle (insbesondere die Membran Punktierung) Perfusion Erstausbildung sollte hypoxischen Exposition und maximieren das Überleben und die Gesundheit der isolierten Kardiomyozyten zu reduzieren , minimiert werden. Idealerweise sollte diese Zeit weniger als 5 min. </li></ol></li><li> Perfusions HINWEIS: Die RetroperfusionVorrichtung bequem in einer sauberen Umgebung auf einem Standard-Labortisch betrieben werden oder in einer laminaren Strömungshaube platziert Sterilität zu maximieren. Doch nach Perfusion abgeschlossen ist, Arbeit sollte unter laminaren Strömung durchgeführt werden, um Verunreinigungen zu minimieren. <ol><li> Sanft, aber bestimmt die Kanüle Nabe von der Spritze (mit sterilen Handschuhen) entfernen sich langsam durch hin und her drehen. Während die Kanülierung Nadel Abziehen der Spritze langsam Perfusionspuffer in die Nadel-Hub, um Luftblasen während der Perfusion zu verhindern auszuwerfen. </li><li> Entfernen Sie die Umlauffangrohr von unterhalb der Perfusions-Auslassanschluss und ersetzen mit einem Abfallfangbecher. Bringen Sie die Nadelnabe an den Luer - Adapter, der mit dem Perfusionssystem Auslaöffnung befestigt ist (1, 2) an dem Wassermantel, während die Pumpe bei der niedrigsten Einstellung ausgeführt (15 RPM, ~ 6 ml / min). TIPP: Wenn die Nadel - Hub an den Luer - Adapter verbinden, lassen Sie den tropf Perfusionspuffer conNECT auf die Flüssigkeit in der Nadelnabe, um die Einführung Blasen zu vermeiden. </li><li> Perfuse das Herz ohne Rezirkulation bis 8 ml Perfusionspuffer haben durch den Zulaufschlauch abgesaugt worden. HINWEIS: Das Volumen des Perfusionspuffer durch den Einlassschlauch in diesem Schritt abgesaugt nimmt ein Totvolumen von 7 ml für das Perfusionssystem, insgesamt 15 ml Perfusionspuffer durch das Herz gepumpt geben. </li><li> Entfernen Sie das Einlassrohr aus dem Perfusions-Puffer. Damit die Luft durch den Einlass angesaugt werden, um weniger als das Totvolumen des Systems. ANMERKUNG: Das Volumen der Luft in diesem Schritt abgesaugt müssen die Koronargefäße Luft zu verhindern eingestellt werden eindringt (siehe Schritt 1.3.7). </li><li> Platzieren Sie die Einlassröhre in den Verdauungspuffer (Tabelle 1), knapp über dem Boden des Röhrchens. Ziehen Sie langsam und lassen Sie das Einlassrohr genug Volumen zu aspirieren zu vermeiden, dass die Rohrfüllung. </li><li> Visualisieren und folgen der Luftblase zwischendie Perfusionspuffer und die Verdauungspuffer, wie es durch den Wärmemantel bewegt. Beachten Sie die Höhe der Perfusions-Puffer in der Mitte des Wärmejacke beginnen zu fallen, sobald die Luftblase, die de-Blasenkammer erreicht. Sobald der Verdauungspuffer die de-Blasenkammer erreicht, wird der Pegel der Flüssigkeit in dem Wärmemantel stabil bleiben. WICHTIG: Wenn der Pegel des Perfusionspuffer zu niedrig ist , die Austrittshahn schließen und den Ablasshahn öffnen. Lassen Sie die Ebene auf ein angenehmes Niveau zu steigen (3-5 Zoll über dem Auslass-Port). Dann stoppen Sie die Transfusionspumpe und schließen Sie die Entlüftungshahn. Öffnen Sie den Auslassanschluss Absperrhahn und starten Sie den Perfusions-Pumpe. </li><li> Sehen Sie sich die Lösung aus dem Herzen entstehen. Als der letzte der Perfusionspuffer beginnt das Herz und die Verdauungspuffer verlässt durch das Herz zirkuliert, bis hellbraune Farbe Änderung wird klar aufgrund der Anwesenheit von Kollagenase beobachtet werden. </li><li> Perfuse das Herz mit Verdauungspufferfür ca. 10 bis 15 min. Das Herz wird slouching beginnen, wie das Kollagen abgebaut wird und es verliert mechanische Unterstützung. </li></ol></li><li> Mechanische Distanzierung und Reinigung <ol><li> Entfernen Sie das Herz aus der Kanüle mit einer Pinzette und in einem trockenen Petrischale. Schnell schneiden extra ventrikuläre Gewebe feine Iris Schere. Übertragen Sie die Ventrikel auf eine frische Petrischale mit Perfusionspuffer zu waschen. Bewegen Sie die Petrischale in eine sterile Haube und übertragen Sie die Ventrikel zu einem frischen, trockenen Petrischale. </li><li> Sammeln 7,5 ml Verdauungspuffer aus dem Wärmemantel und fügen 2,8 ul 1 M CaCl 2, durch Umdrehen mischen. Hinzufügen von 2 bis 3 ml Verdauungspuffer mit CaCl 2 zu den Ventrikeln in der Petrischale. HINWEIS: Die Konzentration von Ca 2+ 300-700 uM angehoben </li><li> Schnell verreiben die ventrikuläre Gewebe mit feinen Pinzetten, so dass die meisten Stücke sind kleiner als 1 mm 3. In die bleibenCa 2+ ing ergänzt Verdauungspuffer von Schritt 1.3.2 an die dissoziierten Ventrikel in der Petrischale und mischen durch vorsichtiges Schütteln. </li><li> Platzieren der Petrischale in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2. Man schüttelt die Petrischale alle 2 Minuten, bis eine ausreichende Kardiomyozyten (siehe Anmerkung unten) wurden aus dem Gewebe freigesetzt worden. HINWEIS: Die Länge der Inkubation müssen möglicherweise nach Feinabstimmung der Grad der Verdauung eingestellt werden , um den Bedürfnissen des Experiments. Im Allgemeinen erhöhen längere Inkubationszeiten Ausbeute und Reinheit, kann jedoch die Rate der Zellhaftung und das Überleben zu reduzieren. 5 - 10 min im allgemeinen ausreichend ist , um eine hohe Ausbeute (~ 5-10 x 10 5 Zellen pro Herz) zu erreichen. </li><li> Übertragen Sie die Petrischale zurück in eine Laminarströmungsabzug. Mit Hilfe einer Transferpipette in einem 45 ° Winkel geschnitten, sanft das Gewebe Pipette weiter zu distanzieren. </li><li> Verwenden Sie sterile Handschuhe, um die 215 &amp; mgr; m-Mesh in einen Kegel zu falten und eine 50 ml konischen halten über. Pipettedas dissoziierte Gewebesuspension auf das Sieb und lassen Sie das Filtrat in das 50 ml konischen abzulassen. Verwenden 7,5 ml vorgewärmtes Anschlagpuffer (Tabelle 1) , um die Kardiomyozyten aus der Petrischale durch das Sieb zu waschen, mit dem ersten Filtrat zu kombinieren. HINWEIS: Ca 2+ zu final 1.1 mM erhöht wird und die endgültige 2,5% FBS in dem Pufferanschlag neutralisiert Protease - Aktivität. </li><li> Übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konisches und ermöglichen es durch die Schwerkraft für 15 Minuten absetzen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Transferpipette, so dass nur 50 bis 100 &amp; mgr; l der Lösung über den Zellen bleibt. 10 ml vorgewärmten, ins Gleichgewicht gebracht Kulturmedien (Tabelle 1) und durch vorsichtiges Umdrehen mischen. Lassen Sie die Kardiomyozyten für 15 Minuten durch die Schwerkraft zu regeln. TIPP: Zur Erhöhung der Reinheit, wiederholen Sie Schritt 1.4.8 nach Wunsch. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Transferpipette, so dass nur 50 bis 100 &amp; mgr; l of Lösung bleibt über den Zellen. </li></ol></li></ol> 2. Cardiomyocyte Kultur <ol><li> Pre-Coat Gewebekultur-behandelte Petrischalen mit Laminin (10 ug / ml) und lagern bei 37 ° C für 2 Stunden vor dem Beschichten Zellen. Unmittelbar vor dem Plattieren von der Gewebekulturplatte, die Laminin Lösung anzusaugen. Waschen Sie einmal mit MEM oder PBS, dann absaugen Restflüssigkeit nicht adsorbierte Laminin zu entfernen. </li><li> Fügen Sie genug vorgewärmt, ins Gleichgewicht gebracht Kulturmedien, um die gewünschte Zelldichte zu erreichen, mischen durch vorsichtiges Umdrehen. Platte gewünschte Konzentration der Zellen in dem Kulturgefäß (typischerweise 5 bis 20 x 10 4 Zellen / cm 2). Um die Ausbeute an Kardiomyozyten Isolation beurteilen zu können, zählen die Zellen über Hemacytometer oder Testplatte, die durch die Dichte unter einem Mikroskop überprüft. Ein erwachsenes Maus Herz stellt typischerweise 0,5 bis 1,0 x 10 6 Zellen in diesem Stadium des Protokolls. TIPP: Wenn 96 - Well - Platten verwenden, verwenden Sie eine 1000 ul micropipette mit einem im 45 ° -Winkel geschnitten Spitze durch eine Zellschädigung zu minimieren Scherkraft. Platzieren Sie die Pipettenspitze, so dass sie den Boden des Bohrlochs während des Auswerfens der Zellsuspension berühren, um zu minimieren Einführung von Blasen. </li><li> Bewegen , um die Zellkulturschale prompt auf einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit. Ändern Sie bei Bedarf Medien ein Versauerung zu verhindern: alle 1-5 Tage, je nach Zelldichte. Minimieren Handhabung der Kulturschale in den ersten 3 bis 6 Tage, um die Befestigung an der Zellkulturoberfläche zu erleichtern. HINWEIS: Um die Zellstörung während Medienwechsel zu minimieren , wenn die Zellen noch nicht vollständig eine Halbmedienwechsel angebracht ist , durchführen. aspirieren langsam die Medien, während die Pipettenspitze knapp unter der Oberfläche der Medien zu halten. Dann langsam zusätzliche Medien hinzufügen, indem Sie die Pipettenspitze knapp über der Oberfläche der Medien gegen die Wand der Kulturschale zu halten. </li><li> Um die Lebensfähigkeit von Kardiomyozyten beurteilen zu können, prüfendie Morphologie unter Hellfeldmikroskopie. Frisch isolierte Kardiomyozyten halten eine etwa stabförmige Morphologie mit scharfen, ausgeprägten Kanten unter Hellfeldbeleuchtung (Abbildung 2). HINWEIS: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit von Zellen mit Trypanblau Färbung. </li><li> Um die Reinheit der Kardiomyozyten Isolation beurteilen zu können, überprüfen Sie die Zellmorphologie Kardiomyozyten identifizieren. Stain die Kerne mit Hoechst 33342 auf insgesamt Zellen zu identifizieren. HINWEIS: Kardiomyozyten können aus nicht-Kardiomyozyten durch ihre charakteristische Morphologie (stabförmige) und Größe (etwa 100 bis 200 &amp; mgr; m in der Länge) identifiziert werden. Alternativ frisch isolierten Herzmuskelzellen für Kardiomyozyten-spezifische Marker positiv färben, wie alpha-Actinin 26 (3C, D) oder kardiales Troponin T. 27 </li></ol> 3. Gene Transduction mit Adenoviren <ol><li> Bereiten Sie Adenovirus Zelllysat mit etablierten mETHODEN. 21 transduzieren die Kardiomyozyten mit Zelllysat von Adenovirus Produzentenzellen 10. Am Tag 0 oder Tag 1 nach der Isolierung vorsichtig das Zelllysat zu den Medien fügen Sie die Kardiomyozyten enthält. HINWEIS: Ein hoher Titer Adenoviruszubereitung erreichen wird eine starke Expression in etwa 48 bis 72 Stunden. Stellen Sie die Vielzahl der Infektion des experimentellen Design zu entsprechen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Der allgemeine Gesundheitszustand der isolierten Kardiomyozyten, hängt von mehreren wichtigen Aspekten dieses Protokolls. Erstens ist die Zeit, von der Herz Extraktion Perfusion kritisch und sollte in 5 min oder weniger durchgeführt werden. Entfernung von Calcium hilft Wechselwirkungen Zell-Zell - zu dissoziieren, aber kann sich negativ auf die Gesundheit Zelllangzeitwirkung. 29-32 Somit finden wir es ausreichend durch EGTA (Ethylenglykol - tetraessigsäure) Chelatbildung Calcium während der ersten paar Mi...

Kultivierten Kardiomyozyten werden häufig zur Überwachung des Zellverhaltens in einer gut kontrollierten Umgebung in vitro verwendet. Beispielsweise morphologischen, elektrischen, biochemischer oder mechanische Zelleigenschaften auf Substraten konstruiert, 1,2 in definierten Medien, und in Reaktion auf niedermolekularer Wirkstoffe, Peptide, Genregulation, 3 oder elektrische Stimulation untersucht. 4 Die zelluläre Inhalt kann auch definiert Kokulturen gesteuert werden. 5 Diese in vitro - Experimente in großem Medikament oder genetischen Screens nützlich sind , und in vivo - Verfahren für verschiedene Arten von Untersuchungen ergänzen cardiomyocyte biology beteiligt sind . Die langfristige Kultur ermöglicht experimentelle Wege, die Zeit erfordert ein erweitertes phänotypische Veränderungen zu erreichen. Ein aktuelles Beispiel ist die von erwachsenen Säugetieren Kardiomyozyten Proliferation, wo Entdifferenzierung, Zellzyklus-Wiedereintritt und die Zellteilung wird in der Regel untersucht über seVeral Tage bis Wochen. 6,7 Hier erleichtert die erweiterte Kulturzeit genetische Manipulation, 7,8 funktionellen Entdifferenzierung (zB sarcomeric Demontage) 9 und möglicherweise Transkriptions Entdifferenzierung. 6 Nachfolgende Zellzyklus Wiedereintritt und die Zellteilung benötigt noch längere Kulturzeiten , vor allem, wenn mehrere Runden der Division sind die experimentellen Ziel zu beobachten. Die Bedeutung der Kardiomyozyten Zellzyklus ist von zentraler Bedeutung für mehrere aktuelle Schlüssel wissenschaftlichen Arbeiten in Herzregeneration, wo der Entdifferenzierung und Proliferation von bereits bestehenden Kardiomyozyten hat für Herzregeneration in Zebrabärbling und neugeborenen Mäusen verantwortlich gezeigt. 10-12 Somit ist die Möglichkeit , Entdifferenzierung und Zellzyklus - Wiedereintritt in Säuger adulten Kardiomyozyten bleibt eine zentrale Frage in der menschlichen Herzregeneration zu stimulieren 13-15 I n - vitro - Experimente in den Zellzyklus von Säugetier-Cardio - StudiumMyocyten haben überwiegend Rattenquellen verwendet, die aufgrund ihrer relativen Leichtigkeit der Langzeitkultur im Vergleich zu Mausmodellen. 16 jedoch murinen Systemen eine reiche Quelle von gut charakterisierten transgenen Werkzeuge und Krankheitsmodelle bieten, die sowohl in in vitro und in vivo nützlich sind , Protokolle. Beispielsweise Cre-basierten lineage Verfolgung hat die Identifizierung von vorbestehenden Kardiomyozyten als Quelle von regenerierenden Myokard in der neonatalen Mäuseherzen in vivo aktiviert. 12 In - vitro - Studien von Lineage-verfolgt neonatalen Maus Kardiomyozyten aktiviert haben die Untersuchung von Wechselwirkungen mit stromal Zellen durch Kokultur mit Fibroblasten. 5 jedoch aufgrund seiner Herausforderungen bestehen 17 wenige Berichte über die Isolierung und die langfristige Kultur von erwachsenen Maus Kardiomyozyten. 18,19 Die Isolierung von lebensfähigen adulten Maus Kardiomyozyten für kurzfristige Kultur allein bekannt ist eine herausfordernde Aufgabe. Diese Protocol liefert eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie rentabel Kardiomyozyten von erwachsenen Mäusen zu erreichen, die für sowohl kurzfristige als auch langfristige Untersuchungen verwendet werden kann. Kardiomyozyten mit diesem Protokoll isoliert effizient mit adenoviralen Vektoren 20,21 und kultiviert Wochen transduziert werden. Diese Methoden stellen ein leistungsfähiges System Kardiomyozyten Biologie in vitro zu studieren. Die hier beschriebenen Verfahren basieren auf mehreren Elementen aus früheren Arbeiten Variationen der Langendorff - Perfusion unter Verwendung von retrograden. 18,22 Obwohl mehrere Protokolle auf der Isolierung von erwachsenen Maus Kardiomyozyten für kurzfristige Kultur und Studie 23-25 ​​der Vorteil veröffentlicht Dieses Protokoll ist die Fähigkeit, die isolierte Kardiomyozyten langfristig Kultur. Dies wird bei der Untersuchung von zellulären Prozessen beteiligt ektopische Genexpression und erfordern längere Zeit, beispielsweise in zellularen Umprogrammierung Strategien nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heated water jacket</td><td>Radnoti</td><td>158831</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water bath, Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pump</td><td>Watson-Marlow</td><td>323</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Exelta</td><td>63042-090</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 curved forceps</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Small dissection scissors</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Extra fine bonn scissors</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine spring scissors</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S25837</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S25414</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>86329</td><td></td></tr><tr><td>Butane dione monoxime (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP310100</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Novo Nordisk</td><td>393153</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-288</td><td></td></tr><tr><td>Protease, type XIV</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>JRS</td><td>43613</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invitrogen</td><td>NC9141851</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Carbamate</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA44804-18</td><td></td></tr><tr><td>215 micron mesh</td><td>Component supply</td><td>U-CMN-215-A</td><td></td></tr><tr><td>20 G blunt ended needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305183</td><td></td></tr><tr><td>20 G beveled needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tape</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td>Silk suture, 7-0</td><td>Teleflex</td><td>15B051000</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha-actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21121</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes

Kultivierten Kardiomyozyten können verwendet werden , cardiomyocyte biology studieren Techniken , die zur in vivo - Systeme ergänzen. So ermöglicht beispielsweise die Reinheit und Zugänglichkeit der in vitro Kultur feine Kontrolle über biochemische Analysen, Echtzeit- Bildgebung und Elektrophysiologie. Langzeitkultur von Kardiomyozyten bietet Zugang zu zusätzlichen experimentellen Ansätzen, die in kurzen Zeitkulturen werden nicht abgeschlossen. Beispielsweise die in vitro Untersuchung der Entdifferenzierung, Zellzyklus - Wiedereintritt und die Zellteilung bisher weitgehend auf Ratten - Kardiomyozyten beschränkt, die in Langzeitkultur robuster zu sein scheinen. Allerdings machen die Verfügbarkeit einer umfassenden Werkzeugpalette von transgenen Mauslinien und gut entwickelten Krankheitsmodelle Maus Systeme attraktiv für Herzforschung. Obwohl mehrere Berichte von Kardiomyozyten Isolation erwachsenen Maus vorhanden sind, zeigen einige Studien ihre langfristige Kultur. Der hier präsentierte, ist ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für dieIsolation und langfristige Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten. Zunächst wird retrograden Langendorff-Perfusion verwendet effizient das Herz mit Proteasen zu verdauen, durch die Schwerkraft Sedimentation Reinigung gefolgt. Nach einer Zeit der Entdifferenzierung nach der Isolierung haften die Zellen allmählich auf die Kultur und für Wochen kultiviert werden. Adenovirus Zelllysat wird verwendet, um effizient die isolierten Cardiomyocyten transduzieren. Diese Methoden bieten eine einfache, aber leistungsfähige Modellsystem Herz Biologie zu studieren.

Ein Wildtyp erwachsenen ICR (CD1) Maus Herz ergibt typischerweise 500.000 bis 1 Million Kardiomyozyten aus einer erfolgreichen Isolierung. Unmittelbar nach der Isolierung behalten die Zellen , die ein meist stabförmiges Aussehen (3A) mit intaktem Sarkomeren und kann für funktionelle Studien verwendet werden cardiomyocyte Kontraktilität beteiligt sind . Ein hoher Prozentsatz der stabförmigen Kardiomyozyten (über 90%) ist ein Hinweis auf wirksame Perfusion und Verdauu...

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Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

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Research

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Biology

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Serie: Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Forschung

Biologie

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Medizin

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...