Die Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research und der Sandler Foundation, March of Dimes Grant Nr. 1-FY18-394 und 1DP2NS116769-01, den NIH Director's New Innovator Award (DP2NS116769) an F.F. und das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK121169) an F.F., H.M. wird unterstützt durch das Postdoktorandenstipendium der Larry L. Hillblom Foundation, NIH T32-DK007418-Stipendium und UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research unabhängiges Postdoc-Stipendium.

1. Vorbereitung der Medien
HINWEIS: Bei den im Protokoll genannten Konzentrationen handelt es sich um Endkonzentrationen der Medienkomponenten. Bereiten Sie alle Medien unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube vor und lagern Sie sie bei 4 °C im Dunkeln. Innerhalb von 2 Wochen verbrauchen.
<ol><li>hPSC-Erhaltungsmedium: Mischen Sie das zuführfreie hPSC-Erhaltungsmedium (20 μl/ml) mit dem Basismedium.</li>
	<li>Medium A: Geben Sie das knochenmorphogenetische Protein 4 (BMP4; 1 ng/ml), SB431542 (10 μM) und CHIR99021 (600 nM) zum Differenzierungsbasismedium.</li>
	<li>Medium B: Fügen Sie SB431542 (10 μM) und CHIR99021 (1,5 μM) zum Differenzierungsbasismedium hinzu.</li>
	<li>Medium C: Fügen Sie SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) und RA (1 μM) zum Differenzierungsbasismedium hinzu.</li>
	<li>Neuralleiste vollständig (NCC) Medium: FGF2 (10 ng/ml), CHIR99021 (3 μM), N2-Supplement (10 μl/ml), B27-Supplement (20 μl/ml), L-Glutamin-Supplement (10 μl/ml) und MEM NEAAs (10 μl/mL) zum neurobasalen Medium hinzufügen.</li>
	<li>ENC-Medium: Geben Sie GDNF (10 ng/ml), Ascorbinsäure (100 μM), N2-Supplement (10 μL/ml), B27-Supplement (20 μL/mL), L-Glutamin-Supplement (10 μL/ml) und MEM NEAAs (10 μL/ml) zum neurobasalen Medium.</li>
	<li>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 1x: 500 mM EDTA (1000x) auf eine Endkonzentration von 500 μM in PBS verdünnen. HINWEIS: Verwenden Sie Ca2+ undMg 2+ freies PBS in diesem Protokoll, sofern nicht anders angegeben.</li>
</ol>2. Beschichtung von Kulturplatten
<ol><li>Mit Basalmembranmatrix beschichtete Platten: Tauen Sie ein 500 μl gefrorenes Aliquot der Basalmembranmatrix schnell auf und verdünnen Sie es in 50 ml gekühltem DMEM:F12, indem Sie es mit einer serologischen 50-ml-Pipette kräftig pipettieren. Die Vertiefungen werden mit der verdünnten Basalmembran-Matrixlösung (100 μl pro cm2 Vertiefungsfläche) bestreicht und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Saugen Sie das Beschichtungsmedium vor der Verwendung an. Um eine Verkleisterung der Basalmembranmatrix zu verhindern, führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich durch und verwenden Sie kaltes DMEM:F12 zum Auflösen des gefrorenen Aliquots. HINWEIS: Die Temperatur der Basalmembranmatrix sollte während des Auftauens (auf Eis) und des Aliquotierens (Röhren auf Eis) kalt gehalten werden, um eine Koagulation zu verhindern.</li>
	<li>PO/FN/Laminin-beschichtete Platten: Bereiten Sie eine 15 μg/ml Polyornithin (PO)-Lösung in PBS vor, indem Sie einen 1000-fachen Stoff verdünnen. Die Vertiefungen werden mit 100 μl PO/PBS-Lösung pro cm2 Vertiefungsoberfläche bestreicht und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wird PO/PBS aspiriert und die Vertiefungen mit 100 μl procm2 Well-Oberfläche mit frisch hergestellter FN/Laminin/PBS-Lösung bestrichen, die 2 μg/mL Fibronektin (FN) und 2 μg/mL Laminin enthält. Die Platten können nach einer minimalen Inkubation von 2 Stunden bei 37 °C verwendet werden. FN/Laminin/PBS vor Gebrauch aspirieren.</li>
</ol>3. Aufrechterhaltung der hPSC-Kultur
HINWEIS: Alle Zellinkubationsschritte erfolgen bei 5 % CO2 und bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator.
<ol><li>Aspirieren Sie hPSC-Medium aus der hPSC-Kultur und fügen Sie jeden zweiten Tag frisches Medium (200 μl procm2 Well-Oberfläche) hinzu, bis die Kolonien ~80% konfluiert sind.</li>
	<li>Zum Durchgang aspirieren Sie das hPSC-Medium und waschen die Zellen mit 100 μl PBS procm2 Well-Oberfläche. HINWEIS: Es ist wichtig, Ca2+ und Mg2+ freies PBS zu verwenden, um die Zellen zu waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 500 μM EDTA (100 μl procm2 Well-Oberfläche) hinzu. Setze den Deckel der Platte wieder auf. Beobachten Sie durch ein inverses Mikroskop und überwachen Sie die Zellen auf Ablösung der Kolonieränder (2-4 min).</li>
	<li>Verwenden Sie eine serologische Pipette von 5 oder 10 ml, um das gleiche Volumen an hPSC-Medium in jede Vertiefung zu übertragen, und entnehmen Sie die Zellen mechanisch, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren. HINWEIS: Die optimale EDTA-Inkubationszeit hängt von der iPSC-Linie ab. Vermeiden Sie heftiges Pipettieren, um Kolonien abzulösen, da dies zu übermäßiger Koloniedissoziation und Zelltod führen kann. Bei der Passage zum Starten einer Differenzierungsplatte inkubieren Sie die Zellen 1-2 min länger mit EDTA.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Die Zellen schleudern (2 min, 290 x g, 20-25 °C) und den Überstand vorsichtig entsorgen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen hPSC-Medium und überführen Sie sie in die Vertiefungen einer neuen, mit Basalmembranmatrix beschichteten Platte. HINWEIS: Für die regelmäßige hPSC-Wartung verwenden Sie ein Passageverhältnis von 1:18 - 1:24 (1:18 bedeutet, dass ein Drittel der aus einer einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte dissoziierten Zellen in eine vollständige neue Platte übertragen wird). Um eine Differenzierungsplatte zu starten, folgen Sie einem Passageverhältnis von 5:6.</li>
	<li>Inkubieren Sie bei 5 % CO2 und 37 °C.</li>
</ol>4. Induktion der Neuralleiste
HINWEIS: Dieser Schritt ist in Abbildung 1A schematisch dargestellt. Beginnen Sie mit der NC-Differenzierung, wenn die Zellen zu etwa 80 % konfluiert sind. Dies wird innerhalb von 1-2 Tagen erreicht, wenn die Zellen im Verhältnis 5:6 durchgelassen werden (siehe oben). Beginnen Sie die NC-Differenzierung am Tag 0 mit pluripotenten und völlig undifferenzierten hPSC-Zellen. Für eine hohe Effizienz sollten die Koloniegrenzen minimale differenzierende Zellen aufweisen. Passage und Platten-hPSC zur Differenzierung, wenn die Kolonien groß sind oder das Zentrum der Kolonie bei der Überwachung mit einem inversen Mikroskop zu verdicken/dunkeln beginnt. Die Konfluenz und Morphologie ist tendenziell zuverlässiger als die Anzahl der plattierten Zellen, da diese je nach Zelllinie variieren kann und zwischen 50.000 und 200.000 pro cm2 variieren kann.
<ol><li>Ersetzen Sie an Tag 0 das hPSC-Erhaltungsmedium durch Medium A mit 1 ng/ml BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μl Medium pro cm2 Well-Oberfläche).</li>
	<li>An Tag 2 sollten die Zellen zu 100 % konfluent sein. Aspirieren Sie verbrauchtes Medium A schonend und füttern Sie Zellen mit Medium B mit 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μl Medium pro cm2 Well-Oberfläche). HINWEIS: Wenn Kulturen während der NC-Induktion wachsen, können sich Zellen von der darunter liegenden Monoschicht lösen. Vermeiden Sie übermäßigen Zellverlust, indem Sie alte Medien vorsichtig entfernen und frische Medien an der Seite der Vertiefung hinzufügen.</li>
	<li>Füttern Sie die Zellen an Tag 4 erneut mit Medium B (200 μl Medium pro cm2 Well-Oberfläche).</li>
	<li>Ersetzen Sie an Tag 6 Medium B durch Medium C mit 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 und 1 μM Retinsäure (400 μl Medium procm2 Well-Oberfläche).</li>
	<li>An den Tagen 8 und 10 wie an Tag 6 füttern.</li>
</ol>5. ENC-Sphäroidbildung
HINWEIS: Dieser Schritt ist in Abbildung 1B schematisch dargestellt.
<ol><li>An Tag 12 wird Medium C vorsichtig aspiriert und die Zellen mit 100 μl PBS procm2 Well-Oberfläche gewaschen. Das gleiche Volumen der Zellablösungslösung zugeben und 30 min bei 5 % CO2 und 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellablösungslösung durch Zugabe des gleichen Volumens NCC-Mediums, das 10 ng/ml FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μl/ml N2-Supplement, 20 μl/mL B27-Supplement, 10 μl/mL L-Glutamin-Supplement und 10 μl/mL MEM NEAA enthält. Entnehmen Sie mit einer serologischen Pipette die Einzelzellsuspension und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Die Zellen schleudern (2 min, 290 x g, 20-25 °C) und den Überstand vorsichtig entsorgen.</li>
	<li>Fügen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette 12 ml (für eine volle 6-Well-Platte) NCC-Medium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen vollständig, indem Sie 1-2 Mal mechanisch auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Platte mit extrem niedrigem Anhaftungsgrad. HINWEIS: Etwa 10 cm2 ENC-Monolayer-Zellen werden in 2 ml NCC-Medium resuspendiert und in eine Vertiefung einer Platte mit extrem niedrigem Attachment übertragen. Dies entspricht einer vollständigen 6-Well-NC-Induktionsplatte, die in eine vollständige 6-Well-Aufsatzplatte mit extrem niedrigem Aufsatz übertragen wird.</li>
	<li>Schwenken Sie die Platten an Tag 14 vorsichtig, bis sich kleine Sphäroide in der Mitte jeder Vertiefung angesammelt haben. Aspirieren Sie mit einer P1000-Mikropipette und in langsamen kreisenden Bewegungen das verbrauchte NCC-Medium um den Umfang jeder Vertiefung. Versuchen Sie zu vermeiden, die frei schwebenden Sphäroide zu entfernen.</li>
	<li>Füttern Sie die Zellen mit dem ursprünglichen Volumen des NCC-Mediums.</li>
</ol>6. DE Induktion
HINWEIS: Dieser Schritt ist in Abbildung 1B schematisch dargestellt.
<ol><li>Wenden Sie an Tag 15 die gleiche Technik wie an Tag 14 an, um das Medium vorsichtig zu entfernen und die Sphäroide mit PBS zu waschen. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich und vermeiden Sie die Sphäroide.</li>
	<li>Geben Sie eine Zellablösungslösung (100 μl procm2 Well-Oberfläche) hinzu und dissoziieren Sie die Sphäroide in einzelne Zellen, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 5 % CO2 und 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Geben Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette ein gleiches Volumen ENC-Medium (enthält 10 ng/ml GDNF, 100 μM Ascorbinsäure, 10 μl/ml N2-Supplement, 20 μl/mL B27-Supplement, 10 μl/mL L-Glutamin-Supplement und 10 μL/mL MEM NEAA in neurobasalem Medium) in jede Vertiefung und brechen Sie die verbleibenden Sphäroide durch 2-3 Runden mechanisches Pipettieren. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen. HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige Scherbelastung und Zelltod, die durch erzwungenes Pipettieren oder die Verwendung von Pipetten mit kleinerer Spitzenöffnung auftreten können.</li>
	<li>Die Zellen schleudern (2 min, 290 x g, 20-25 °C) und den Überstand vorsichtig entsorgen. Fügen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette ~ 5-10 mL ENC-Medium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen vollständig, indem Sie 1-2 Mal auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Konzentration lebensfähiger Zellen mit Trypanblau und einer Zellzählmethode wie einem Hämozytometer. ACHTUNG: Trypanblau steht im Verdacht, krebserregend zu sein. Vorsichtig behandeln, sachgerecht entsorgen.</li>
	<li>Es wird ein ausreichendes Volumen des ENC-Mediums hinzugefügt, um etwa 300.000 bis 400.000 lebensfähige Zellen procm2 Oberfläche bei einer Dichte von etwa ~ 1.000.000 Zellen pro ml zu plattieren. FN/Laminin/PBS-Lösung aus den Vertiefungen der Platte aspirieren. HINWEIS: Wählen Sie das Plattenformat entsprechend den Assays, die für die EN-Kulturen geplant sind, da diese Phase den letzten Re-Plattierungsschritt des Protokolls markiert. Vorläuferzellen von enterischen Neuronen können am Tag 15 eingefroren werden. Nach der Disssoziation der Kügelchen mit der Zellablösungslösung resuspendieren Sie die Vorläuferzellen bei etwa 5 x 106 Zellen/ml in Gefriermedium wie 10 % DMSO oder Stem-cellbanker. Bei Bedarf in warmen ENC-Medien mit 5 μM Y-27632 ROCK-Inhibitor auftauen. Plattenzellen im gewünschten Plattenformat. Ersetzen Sie das Medium nach einigen Stunden durch eine frische ENC.</li>
	<li>Geben Sie die Zellen vorsichtig in die mit PO/FN/Laminin beschichteten Vertiefungen. Vermeiden Sie, dass Blasen unter der Zellsuspension eingeschlossen werden, um die Anhaftung der Zellen an die PO/FN/Laminin-Beschichtung zu verhindern, insbesondere bei der Verwendung von Platten mit kleinerer Well-Größe, wie z. B. 384-Well-Platten. Dies könnte zum Zelltod führen.</li>
	<li>Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit ENC-Medium (200 μl pro cm2 Well-Oberfläche) bis zum Tag 30-40, danach reduzieren Sie die Fütterungshäufigkeit (auf ein- oder zweimal pro Woche), verdoppeln Sie jedoch das Fütterungsvolumen (auf 400 μl Medium pro cm2 Well-Oberfläche). HINWEIS: Dies ist wichtig, da übermäßiges Entfernen und Hinzufügen von Medien die Ablösung der neuronalen Kultur von der Oberfläche der Vertiefungen erleichtern kann. Um eine Ablösung prospektiv zu verhindern, insbesondere bei längerfristigen Kulturen, ergänzen Sie ENC einmal pro Woche mit FN (2 μg/ml) und Laminin (2 μg/ml).</li>
</ol>

Gewinnung enterischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen

<ol>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll bietet eine robuste in vitro-Methode, um enterische Neuronen aus hPSCs innerhalb von 30-40 Tagen (Abbildung 1E) und enterische Gliazellen, die das saure Gliaprotein, GFAP und SOX10 exprimieren, in älteren Kulturen zu erhalten (> Tag 55)13,14,19,22. Diese Neuronen und Gliazellen werden durch schrittweise Diff...

Das enterische Nervensystem (ENS) ist der größte Bestandteil des peripheren Nervensystems. Das ENS enthält mehr als 400 Millionen Neuronen, die sich im Magen-Darm-Trakt befinden und fast alle Funktionen des Darms steuern1. Das molekulare Verständnis der Entwicklung und Funktion des ENS und seiner Defekte bei enterischen Neuropathien erfordert den Zugang zu einer zuverlässigen und authentischen Quelle für enterische Neuronen. Der Zugang zu menschlichem Primärgewebe ist begrenzt, und Tiermodelle können die wichtigsten Krankheitsphänotypen bei vielen enterischen Neuropathien nicht rekapitulieren. Die Technologie der humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) hat sich als äußerst vorteilhaft erwiesen, da sie eine unbegrenzte Quelle für die gewünschten Zelltypen bietet, insbesondere für solche, die nur schwer aus Primärquellen isoliert werden können 2,3,4,5,6,7. Im Folgenden stellen wir Ihnen eine schrittweise und robuste In-vitro-Methode zur Gewinnung von ENS-Kulturen aus hPS-Zellen vor. Diese skalierbaren hPSC-abgeleiteten Kulturen eröffnen Wege für Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und können transplantierbare Zellen für die regenerative Medizin bereitstellen.
Die enterischen Neuronenlinien stammen von Neuralleistenzellen (NC) ab, die während der Embryogenese dem ENS-Entwicklungspfad folgen. In Embryonen entstehen NC-Zellen entlang der Ränder der gefalteten Neuralplatte. Sie vermehren sich, wandern und führen zu vielen verschiedenen Zelltypen, darunter sensorische Neuronen, Schwann-Zellen, Melanozyten, kraniofaziale Skelett- und enterische Neuronen sowie Gliazellen 8,9,10. Die Entscheidung über das Zellschicksal hängt von der unterschiedlichen Region entlang der anterior-posterioren Achse ab, aus der die NC-Zellen hervorgehen, d.h. kraniale NC, vagale NC, Rumpf-NC und sakrale NC. Das ENS entwickelt sich aus vagalen und sakralen NC-Zellen, wobei erstere aufgrund der ausgedehnten Wanderung entlang des Darms und der Besiedlung des Darms die Population der enterischen Neuronen dominieren11.
Die Ableitung von NC-Zellen aus PSCs beinhaltet üblicherweise eine Kombination aus dualer SMAD-Hemmung und Aktivierung des WNT-Signalwegs12,13. Bis vor kurzem wurden bei allen NC-Induktionsprotokollen Serum und andere tierische Produktzusätze unter den Kulturbedingungen verwendet. Chemisch undefinierte Medien verringern nicht nur die Reproduzierbarkeit der NC-Induktion, sondern stellen auch eine Herausforderung für mechanistische Entwicklungsstudien dar. Um diese Herausforderungen zu meistern, entwickelten Barber et al.14 ein NC-Induktionsprotokoll unter chemisch definierten Kulturbedingungen und waren daher gegenüber alternativen Methoden, die auf Serumersatzfaktoren (z. B. KSR) basieren, vorteilhaft13,14. Dies wurde durch den Ersatz von Basalmedien und die Optimierung eines ursprünglich von Fattahi et al. vorgestellten Protokolls zur Ableitung enterischer NC-Zellen aus hPSCs erreicht. Dieses verbesserte System ist die Grundlage des hier vorgestellten hPSC-Differenzierungsprotokolls. Sie beginnt mit der Induktion von enterischen Neuralleistenzellen (ENC) in einem Zeitraum von 15 Tagen durch präzise Modulation der BMP-, FGF-, WNT- und TGFβ-Signalwege zusätzlich zu Retinsäure (RA). Anschließend leiten wir die ENS-Linien ab, indem wir Zellen mit dem von Gliazelllinien abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) behandeln. Alle Medienzusammensetzungen sind chemisch definiert und liefern innerhalb von 30-40 Tagen robuste enterische neuronale Kulturen.
Zusätzlich zu dem hier beschriebenen Monolayer-Zellkultursystem wurden alternative NC-Induktionsansätze entwickelt, die frei schwebende Embryoidkörper verwenden15,16. Es wurde gezeigt, dass wandernde Zellen in diesen Kulturen NC-Marker exprimieren, wobei eine Untergruppe die vagale NC repräsentiert. Co-Kulturen mit primärem Darmgewebe wurden verwendet, um enterische NC-Vorläufer in diesen Kulturen anzureichern. Die Medienzusammensetzungen in diesen Studien enthalten eine Kombination verschiedener Faktoren wie Nervenwachstumsfaktor, NT3 und vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor. Zu diesem Zeitpunkt ist noch nicht vollständig klar, wie sich diese Faktoren auf die Bindungsidentitäten der enterischen Neuronen auswirken könnten. Für einen effizienten Vergleich der enterischen NC-Induktion in der Monoschicht und den Embryoidkörper-basierten Kulturen sind weitere Daten erforderlich. Angesichts der unterschiedlichen Kulturlayouts in diesen Strategien sollte der Einsatz jeder Methode in Betracht gezogen und entsprechend der spezifischen Anwendung optimiert werden.
Das hier vorgestellte Protokoll ist reproduzierbar und wurde von uns und anderen erfolgreich mit verschiedenen hPSC-Linien (induziert und embryonal) getestet 8,14,16.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (serum free, minus vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix, Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14133-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model no. 5810R</td>
			<td>02262501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution, Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1475-0511, 1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation base medium, Essential 6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 no glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pluripotent stem cells, H9 ESC</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>RRID: CVCL_1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with controlled humidity, temperature and CO2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Herralcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1300 series class II, type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3400-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement, Glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAAs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plates, Falcon</td>
			<td>BD</td>
			<td>353934, 353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>CTS</td>
			<td>A1370701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca and Mg free)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z768715-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E, 13-678-11F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of enteric nervous system lineages from human pluripotent stem cells

Das menschliche enterische Nervensystem (ENS) ist ein großes Netzwerk von glialen und neuronalen Zelltypen mit einer bemerkenswerten Vielfalt an Neurotransmittern. Das ENS steuert die Darmmotilität, die Enzymsekretion und die Nährstoffaufnahme und interagiert mit dem Immunsystem und dem Darmmikrobiom. Folglich sind entwicklungsbedingte und erworbene Defekte des ENS für viele menschliche Krankheiten verantwortlich und können zu Symptomen der Parkinson-Krankheit beitragen. Einschränkungen bei Tiermodellsystemen und beim Zugang zu primärem Gewebe stellen bei Studien des humanen ENS eine erhebliche experimentelle Herausforderung dar. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für eine effektive in vitro Gewinnung der ENS-Linien aus humanen pluripotenten Stammzellen, hPSC, unter definierten Kulturbedingungen vorgestellt. Unser Protokoll beginnt mit der gerichteten Differenzierung von hPSCs zu enterischen Neuralleistenzellen innerhalb von 15 Tagen und liefert innerhalb von 30 Tagen verschiedene Subtypen von funktionellen enterischen Neuronen. Diese Plattform bietet eine skalierbare Ressource für Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung, Wirkstoffforschung und regenerative Anwendungen.

The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the peripheral nervous system. The ENS contains more than 400 million neurons that are located within the GI tract and control nearly all functions of the gut1. Molecular understanding of the ENS development and function and its defects in enteric neuropathies requires access to a reliable and authentic source of enteric neurons. Access to human primary tissue is limited, and animal models fail to recapitulate key disease phenotypes in many enteric neuropathies. Human pluripotent stem cell (hPSC) technology has proven exceedingly beneficial in providing an unlimited source of desired cell types, especially those that are difficult to isolate from primary sources2,3,4,5,6,7. Here, we provide details of a stepwise and robust in vitro method to obtain ENS cultures from hPSCs. These scalable hPSC-derived cultures open avenues for developmental studies, disease modeling, and high-throughput drug screening and can provide transplantable cells for regenerative medicine.
Enteric neuron lineages are derived from neural crest (NC) cells following the ENS developmental path during embryogenesis. In embryos, NC cells emerge along the margins of the folding neural plate. They proliferate, migrate and give rise to many different cell types including sensory neurons, Schwann cells, melanocytes, craniofacial skeleton and enteric neurons and glia8,9,10. The cell fate decision depends on the distinct region along the anterior-posterior axis that the NC cells emerge from, i.e., cranial NC, vagal NC, trunk NC and sacral NC. The ENS develops from vagal and sacral NC cells with the former dominating the population of the enteric neurons owing to the extensive migration along the length of the bowel and colonizing the gut11.
Derivation of NC cells from PSCs commonly involves a combination of dual SMAD inhibition and WNT pathway activation12,13. Until recently, all NC induction protocols involved serum and other animal product additives in the culture conditions. Chemically undefined media not only lower the reproducibility of NC induction but also challenge mechanistic developmental studies. To overcome these challenges, Barber et al14 developed an NC induction protocol using chemically defined culture conditions and was hence advantageous over alternative methods that rely on serum-replacement factors (e.g., KSR)13,14. This was obtained by basal media replacements and optimizing a protocol originally presented by Fattahi et al to derive enteric NC cells from hPSCs. This improved system is the basis of the hPSC differentiation protocol that is presented here. It begins with induction of enteric neural crest (ENC) cells in a 15-day period by precise modulation of BMP, FGF, WNT and TGF&#946; signaling in addition to retinoic acid (RA). We then derive the ENS lineages by treating cells with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). All media compositions are chemically defined and yield robust enteric neuronal cultures within 30-40 days.
In addition to the monolayer cell culture system described here, alternative NC induction approaches have been developed which use free-floating embryoid-bodies15,16. Migratory cells in these cultures have been shown to express NC markers with a subset representing the vagal NC. Co-cultures with primary gut tissue have been used to enrich enteric NC precursors in these cultures. Media compositions in these studies contain a combination of different factors such as nerve growth factor, NT3 and brain-derived neurotrophic factor. At this stage, it is not fully clear how these factors might affect the enteric neuron precursor commitment identities. For an efficient comparison of the enteric NC induction in the monolayer and the embryoid-body-based cultures more data is required. Given the different culture layouts in these strategies, the use of each method should be considered and optimized according to specific application in mind.
The protocol presented here is reproducible and has been successfully tested by us and others using different hPSC (induced and embryonic) lines8,14,16.

Autor im Rampenlicht: Robuste Kultur menschlicher enterischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Differenzierung der Abstammungslinien des enterischen Nervensystems von humanen pluripotenten Stammzellen

Here we provide a method for generation of human enteric neurons from human pluripotent stem cells under fully defined conditions, and we use these cells in order to understand human enteric nervous system development and function. So I think human enteric nervous system development, physiology and pathophysiology has been a great challenge, and it's because of the rarity of the enteric nervous system cells and the transient nature of the neural crest progenitors, and difficulty in access to tissue and isolation of the tissue. This is a robust platform for generating authentic and functional human enteric neurons from HPSCs, and by overcoming longstanding technical challenges in tissue access, it provides scalable cultures of enteric nervous system components for disease modeling, drug discovery, and studying ENS developments and function.

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Ableitung der enterischen Neuralleiste und enterischer Neuronen aus hPSCs unter Verwendung chemisch definierter Kulturbedingungen (Abbildung 1A-B). Die Erzeugung hochwertiger Neuronen hängt von einem effizienten Induktionsschritt der enterischen Neuralleiste ab. Dies kann visuell beurteilt werden, indem die Morphologie der frei schwebenden Kugeln überprüft wird, die mit glatten Oberflächen mit einer Größe von etwa 0,1 - 0,4 mm r...

Die Ableitung von Abstammungslinien des enterischen Nervensystems (ENS) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) bietet eine skalierbare Zellquelle zur Untersuchung der ENS-Entwicklung und -Krankheit sowie zur Verwendung in der regenerativen Medizin. Hier wird ein detailliertes in vitro Protokoll zur Gewinnung enterischer Neuronen aus hPSCs unter chemisch definierten Kulturbedingungen vorgestellt.

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Generierung menschlicher enterischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen unter vollständig definierten Bedingungen vor, und wir verwenden diese Zellen, um die Entwicklung und Funktion des menschlichen enterischen Nervensystems zu verstehen. Ich denke also, dass die Entwicklung, Physiologie und Pathophysiologie des menschlichen enterischen Nervensystems eine große Herausforderung war, und das liegt an der Seltenheit der Zellen des enterischen Nervensystems und der vorübergehenden Natur der Vorläufer der Neuralleiste sowie an den Schwierigkeiten beim Zugang zu Gewebe und der Isolierung des Gewebes. Dies ist eine robuste Plattform für die Generierung authentischer und funktionsfähiger menschlicher enterischer Neuronen aus HPSCs und bietet durch die Überwindung langjähriger technischer Herausforderungen beim Gewebezugang skalierbare Kulturen von Komponenten des enterischen Nervensystems für die Modellierung von Krankheiten, die Wirkstoffforschung und die Untersuchung von ENS-Entwicklungen und -Funktionen.

differentiation-enteric-nervous-system-lineages-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

845 Aufrufe.  University of California, San Francisco. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Generierung menschlicher enterischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen unter vollständig definierten Bedingungen vor, und wir verwenden diese Zellen, um die Entwicklung und Funktion des menschlichen enterischen Nervensystems zu verstehen. Ich denke also, dass die Entwicklung, Physiologie und Pathophysiologie des menschlichen enterischen Nervensystems eine große Herausforderung war, und das liegt an der Seltenheit der Zellen des ente...

Serie: Autor im Rampenlicht: Robuste Kultur menschlicher enterischer Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls bowel motility, enzyme secretion, and nutrient absorption and interacts with the immune system and the gut microbiome. Consequently, developmental and acquired defects of the ENS are responsible for many human diseases and may contribute to symptoms of Parkinson's disease. Limitations in animal model systems and access to primary tissue pose significant experimental challenges in studies of the human ENS. Here, a detailed protocol is presented for effective in vitro derivation of the ENS lineages from human pluripotent stem cells, hPSC, using defined culture conditions. Our protocol begins with directed differentiation of hPSCs to enteric neural crest cells within 15 days and yields diverse subtypes of functional enteric neurons within 30 days. This platform provides a scalable resource for developmental studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative applications.

Deriving enteric nervous system (ENS) lineages from human pluripotent stem cells (hPSC) provides a scalable source of cells to study ENS development and disease, and to use in regenerative medicine. Here, a detailed in vitro protocol to derive enteric neurons from hPSCs using chemically defined culture conditions is presented.

Forschung

Neurowissenschaften

Formation of Neural Crests from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To induce neural crest formation, replace the maintenance medium of the human pluripotent stem cell culture with 200 microliters of medium A per square centimeter of the well-surface. Incubate the culture under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius for two days. Gently aspirate the medium from the well-containing 100%confluence cells then pipette about 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface area.On day four, feed the cells with 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface. Incubate the cells for two more days, then replace the medium B with 400 microliters per square centimeter of medium C.

Bildung von Neuralleisten aus humanen pluripotenten Stammzellen für die Erforschung des enterischen Nervensystems

Differentiation of Enteric Neural Crest Spheroid and Neuronal Induction from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To begin, take 12-day cultures of human pluripotent stem cells that have been subjected to neural crest induction. Gently aspirate medium C from the cells. Add 100 microliters of PBS per square centimeter of well surface area to wash the cells, and then remove the PBS.Add an equal volume of cell detachment solution to the cells and incubate for 30 minutes under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius. Add an equal volume of NCC medium into the plate. Then, use a serological pipette to harvest the cell suspension and transfer it to a 15-milliliter conical tube.Spin the cells at 290G for two minutes between 20 to 25 degrees Celsius. Carefully discard the supernatant without disturbing the cell pellet. Use a 10-milliliter serological pipette to pipette 12 milliliters of NCC medium to the cell pellet.Mechanically pipette the suspension up and down to create a suspension. Then, transfer the cell suspension to an ultra low attachment plate. On day 14, gently swirl the cell culture plates to gather small spheroids at the center of each well.Use a P1000 micro pipette to slowly aspirate the spent medium from the circumference of each well. Refeed the cells with the original volume of NCC medium. On day 15, carefully remove the medium.Add PBS to the wells to wash the spheroids. Then, remove as much PBS as possible, ensuring spheroids are not disturbed. Next, add 100 microliters of cell detachment solution per square centimeter of well surface area.Incubate the cells in the solution for 30 minutes under 5%carbon dioxide at 37 degrees Celsius. With a 10-milliliter serological pipette, add an equal volume of ENC medium to each well. Mechanically pipette the solution to break any remaining spheroids.Then transfer the cells to a 50-milliliter conical tube. Discard the supernatant after centrifuging as before. Then, resuspend the cells in 5 to 10 milliliters of ENC medium.Count the concentration of viable cells using trypan blue and hemocytometer. Now, add enough volume of ENC medium to plate about 300, 000 to 400, 000 viable cells per square centimeter of surface area, and a density of about 1 million cells per milliliter. Then, aspirate the solutions from the wells.Next, add the cells to a plate with PO/FN laminin coated wells. Feed cells every other day with 200 microliters of ENC medium per square centimeter of well surface area until days 30 to 40. High quality free floating spheres with smooth surfaces were observed after neural crest induction.The spheroids expressed the neural crest marker SOX10. Neurites were observed between days 25 to 30 during the enteric neuron induction.

Differenzierung der enterischen Neuralleisten-Sphäroide und der neuronalen Induktion aus humanen pluripotenten Stammzellen für die Erforschung des enterischen Nervensystems