Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus National Institutes of Health (P30 HL101302 und RO1 HL109439 um JC) und der American Heart Association (SDG 5270005 JC) unterstützt. A. Barazia wurde von einem T32HL007829 NIH Ausbildungsförderung unterstützt.

Ein. Vorbereitung der Intravital Mikroskop (Abbildung 1A) <ol><li> Bereiten Superfusion Puffer (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 17 mM NaHCO 3, pH 7,4). </li><li> Schalten Sie eine Durchblutungsstörung Wasserbad auf eine Temperatur von Puffer und eine thermo-kontrollierten Decke bei 37 ° C zu halten Belüften mit Stickstoffgas Puffer (5% CO 2 mit Stickstoff ausgeglichen). </li><li> Schalten Sie den Mikroskop-System (Sutter Lambda DG-4 High-Speed-Wellenlänge Wechsler, Arbeitsplatzrechner, Olympus BX61W Mikroskop, MPC-200 Multi-Manipulator, ROE-200 Phase-Controller, High-Speed-Kamera, und Verstärker). </li><li> Für die Gefäßentzündung Modell verwenden eine 100% dichroitischen Spiegel. Zur Thrombusbildung durch Laser Schädigung induzieren, Ersetzen einer 100%-Spiegel mit einem 50/50%-Spiegel und drehen auf einer Mikrospitze Laserablationssystem. </li></ol> 2. Vorbereitung der Cremaster Muskel für Intravital Mikroskopie (Abbildung 1B) <ol><li> Anesthetize amännliche Maus (6-8 Wochen alt, C57BL / 6) durch ip-Injektion von Ketamin (125 mg / kg Körpergewicht (BW)) und Xylazin (12,5 mg / kg KG). Die University of Illinois Institutional Animal Care und Formate gebilligten alle Tierhaltung und experimentellen Verfahren. Für eine Gefäßentzündung Modell, injizieren murine TNF-α (0,5 ug in 250 ul Kochsalzlösung) intrascrotally in eine Maus 3 Stunden vor der Bildgebung (2-2.5 Stunden vor der Operation). </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einem thermo-kontrollierten Decke bei 37 ° C auf einem intravital Mikroskop Fach. </li><li> Ziehen Sie die Haut auf der Oberfläche des Halses mit einer Pinzette und einschneiden horizontal die Mittellinie des Halses Haut bis zu 1 cm mit einer Schere. </li><li> Öffnen Sie vorsichtig die zervikalen Muskeln mit stumpfen Schere und entfernen Sie die Muskeln rund um die Luftröhre. </li><li> Kanülieren eine PE90 Rohr in Luftröhre Atemnot zu beseitigen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die linke Seite des zervikalen Muskeln und zu isolieren, die Halsschlagader vom umgebenden Gewebe. </li><li> C jährlichspät ein PE10 Rohr in der linken Halsschlagader zur Infusion von Antikörpern und zusätzliche Anästhetika. </li><li> Ziehen Sie vorsichtig und einschneiden die Skrotalhaut horizontal. Um Gewebe Integrität während des Experiments zu erhalten, wurde vorgewärmtem Puffer über dem OP-Feld superfundiert. </li><li> Drücken Sie auf den Unterleib mit einer Pinzette und vorsichtig einen Hoden mit der anderen forcep. </li><li> Entfernen Sie die umliegende Bindegewebe rund um die Hoden. </li><li> Inzision des M. cremaster vertikal und glätten den Muskel über einem Deckglas auf einem intravital Mikroskop Schale durch Pinning der Peripherie. </li><li> Erlauben 10-20 min für die Muskel vor der Datenerfassung stabilisieren. M. cremaster Arteriolen (für Thrombusbildung) und Venolen (für Gefäßentzündung) mit einem Durchmesser von 30-45 um wurden für unsere Studie ausgewählt. </li><li> Um Anästhesie Bedingungen aufrechtzuerhalten, einzuflößen 30-50 ml des gleichen Narkose ca. alle 30 min durch die Vena cannulus. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Intravital Mikroskopie für TNF-α-induzierte vaskuläre Inflammation <ol><li> Nach Platzierung der Maus auf den intravital Mikroskop, offene SlideBook 5,0 Software und klicken Sie auf &quot;Focus Window&quot; in der Menüleiste, um die entsprechende Optik und objektive (60X) eingestellt. </li><li> Infuse DyLight 488-konjugierten Ratte-anti-Maus-CD42c (0,1 ug / g BW in 100 ul Kochsalzlösung) und Alexa Fluor 647-konjugierten Ratte-anti-Maus-Gr-1-Antikörper (0,05 pg / g BW in 100 ul Kochsalzlösung) über einen Vena cannulus . </li><li> Zum Menüleiste und klicken Sie auf &quot;Image Capture&quot; in der Symbolleiste. </li><li> Ein neues Menü öffnet sich, in &quot;Bild&quot;, wählen Sie &quot;Bin Factor&quot; als 1x1 und wählen Sie &quot;640&quot; auf Breite und &quot;460&quot; auf der Höhe. </li><li> In &quot;Filter Set&quot;, markieren Sie die Checkbox für die Kanäle, die Sie gerne zu entlarven und die Belichtungszeit für jeden würde. Zum Beispiel, offenen Kanal: 10 ms, FITC-Kanal: 50 ms, und Cy5-Kanal: 50 ms. </li><li> Wählen Sie &quot;Time-Lapse Capture&quot; um die Anzahl der Zeitpunkte und Intervall einstellen. For die Entzündung Modell wird die Anzahl von Zeitpunkten, um 1.000-1.500 mit einem Intervall von 200 ms (: 5 min Gesamt verstrichene Zeit) gesetzt. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Test&quot;, um eine Ein-Ebenen-Bild in der angegebenen Belichtungszeit für diesen Kanal zu sehen. Passen Sie Belichtungszeit und / oder Mikroskop Licht, bis das Histogramm eine angemessene Intensitätsverteilung (Für Mehrkanal-Aufnahme, wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Kanal) zeigt. </li><li> Nachdem alle Parameter eingestellt sind (Kanäle, Belichtungszeiten, und so weiter) in der &quot;Image Capture&quot;, wählen Sie &quot;Start&quot;, um die Aufzeichnung zu beginnen. </li><li> Überwachen Wälz-und adhärente Thrombozyten und Neutrophilen für 5 min in der oberen Hälfte eines entzündeten cremaster venule in der Gefäßentzündung Modell. Acht bis zehn verschiedene Venolen in einem Maus aufgezeichnet. </li><li> Bilder wurden mit insgesamt Vergrößerung 60X (1,0 NA Wasser Immersionsobjektiv) geben eine Fenstergröße von 157 um x 118 um. </li><li> Nach Beendigung des Versuchs wurden die Mäuse über zervikalen Dislocatio euthanasiertn. </li></ol> 4. Data Analysis für die venulären Entzündung Modell <ol><li> Öffnen SlideBook 5,0 Software und klicken Sie auf &quot;Ordner&quot; auf der Menüleiste, um eine Datei zu öffnen. </li><li> Klicken Sie auf den Dropdown-Kanal-Menü und wählen Sie &quot;Öffnen, FITC, Cy5, etc.&quot; </li><li> Klicken Sie auf &quot;renormieren (roten und grünen Balken)&quot; und wählen Sie den Kanal. Ziehen Sie die roten und grünen Balken nach links oder rechts auf rund optimieren Fluoreszenzsignal. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot; und &quot;OK&quot;, um das Bild zu aktualisieren. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Thumbnail Button&quot; zur aktuellen Anzeige als Standard wählen. </li><li> Spielen erobert timelapse Bild, und zählen Walz-und adhärenten Neutrophilen während der 5-Minuten-Zeitraum. </li><li> Um Thrombozyten Thrombusbildung zu analysieren, &quot;Mask&quot; und wählen Sie &quot;Create&quot;. </li><li> Nennen Sie eine Maske und mark &quot;In dem aktuellen Bild&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Large Bleistiftsymbol&quot; in &quot;Marquee Tool&quot; in der Hauptansicht. </li><li> Farbe ist ein Bereich außerhalb des Schiffes in der Hauptansicht, um einen Hintergrund-Maske eingestellt. </li><li> Gehe to &quot;Mask&quot;, klicken Sie auf &quot;Kopieren dieser Ebene&quot;, klicken Sie auf &quot;Copy-Maske in der aktuellen Zeitpunkt&quot; und wählen Sie &quot;Alle Zeitpunkte&quot;, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Um Hintergrund-Signal zu berechnen, &quot;Statistik&quot; und klicken Sie auf &quot;Mask Statistics&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Aktuelle 2D Zeitraffer-oder 4D-Image (s)&quot; in Bild Scope, und wählen Sie &quot;Entire Mask&quot; in Maske Scope. In Funktionen, wählen Sie &quot;Abgelaufene Zeit (hh: mm: ms)&quot; unter Datum der Aufnahme, wählen Sie &quot;Area (Pixel)&quot; unter Morphometrie, wählen Sie &quot;Maximum Intensity&quot; unter Intensität, und klicken Sie auf &quot;Export&quot; (Diese statistische Methode ermöglicht es uns, Berechnung Auto-Fluoreszenz Intensität (Hintergrund-Signal)). </li><li> Öffnen Sie die Textdatei in MS Office Excel und berechnen den Mittelwert der Hintergrund-Signal während der Aufzeichnungsdauer. Dies ist der Hintergrund-Fluoreszenzintensität. </li><li> Um Thrombus Intensität zu bestimmen, klicken Sie auf &quot;Large Bleistiftsymbol&quot; wieder in der &quot;Marquee Tool&quot; in der Hauptansicht. </li><li> Farbe im Inneren des Behälters in der Hauptansicht die Thrombozytenfunktion Signal gesetzt. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Mask&quot;, klicken Sie auf &quot;Kopieren dieser Ebene&quot;, klicken Sie auf &quot;Copy-Maske in der aktuellen Zeitpunkt&quot;, wählen Sie &quot;Alle Zeitpunkte&quot;, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Statistik&quot; und klicken Sie auf &quot;Mask Statistics&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Aktuelle 2D Zeitraffer-oder 4D-Image (s)&quot; in Bild Scope, und wählen Sie &quot;Entire Mask&quot; in Maske Scope. In Funktionen, wählen Sie &quot;Abgelaufene Zeit (hh: mm: ms)&quot; unter Datum der Aufnahme, wählen Sie &quot;Area (Pixel)&quot; unter Morphometrie, wählen Sie &quot;Sum Intensity&quot; unter Intensität, und klicken Sie auf &quot;Export&quot; (Diese statistische Methode ermöglichen es uns, Berechnung der Fluoreszenzintensität innerhalb des Gefäßes). </li><li> Öffnen Sie die Textdatei in MS Office Excel. Fluoreszenzsignal von Plättchen wird durch Subtraktion des Mittelwerts der Hintergrundintensität x Fläche (Pixel) aus der Summe der Intensität der Innenseite des Behälters berechnet wird. Dies ist die Fluoreszenzintensität der Blutplättchenthrombus. </li><li> Wiederholen Sie dies in 30 verschiedenen Venolen in 3-5 verschiedenen Mäusen. Dann berechnen Medianwert der Fluoreszenzintensität von Blutplättchen. </li><li> Aufanalysieren die Neutrophilen Walzen und Haftung, wurde die rollende Zustrom von Neutrophilen über 5 min in jedem venule ermittelt und als Zellzahlen pro Minute. Die Zahl der anhaftenden Neutrophilen, die stationär für&gt; 30 sec waren und langsam kroch (&lt;10 um über 30 sec), aber nicht überschlagen, wurden gezählt und als Zellzahlen pro 5 min. </li></ol> 5. Intravital Mikroskopie für Laser-induzierte arteriolären Thrombosis 5-1 Kalibrierung von Abtragslaser <ol><li> Legen Sie einen gespiegelten Folie auf Mikroskoptisch, wenden Sie einen kleinen Tropfen destilliertes Wasser bis zum oberen Rand der Folie, und stellen Sie die Intensität und Fokussierung mit dem Okular. </li><li> Öffnen Sie &quot;Focus Window&quot; und wählen Sie &quot;FRAP&quot; tab in SlideBook 5,0 Software. </li><li> Stellen Sie die Laserleistung bei 40-50, und setzen Sie beide &quot;Doppelklick Wiederholungen&quot; und &quot;Doppelklick Größe&quot; bis 8. Markieren Sie auf der &quot;Guide&quot;-Box zu bringen, eine Reihe von Fadenkreuz. </li><li> Wählen Sie die &quot;Pfeil&quot;-Symbol in der Taskleiste on die oben auf dem Bildschirm. </li><li> Unter dem &quot;FRAP Alignment&quot;, klicken Sie &quot;Fire next&quot;. Ein kleiner Fleck sollte in der Nähe der unteren linken Ecke auf dem Monitor erscheinen. Sobald der Fleck erscheint, doppelklicken Sie auf die Mitte des darauf klicken. Einmal angeklickt, sollte eine andere Stelle über angezeigt und auf der rechten Seite der ersten Stelle, doppelklicken Sie darauf. Wiederholen Sie dies für 16 Punkte (die 16 th Spot wird in der rechten unteren Ecke angezeigt.) Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;, wenn Sie fertig die Kalibrierungsparameter zu aktualisieren. </li><li> Um die Genauigkeit der Kalibrierung zu testen, auf dem &quot;Center&quot; button-einen kleinen Fleck auf sollte in der Mitte des Bildschirms angezeigt. Wenn nicht, wiederholen Sie die Kalibrierung, bis die gewünschte Genauigkeit erreicht ist. </li></ol> 5-2 Laser-induzierte arteriolar Thrombusbildung <ol><li> Legen Sie eine narkotisierten Maus (siehe das Verfahren der 2-2 bis 2-12) auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Unter dem &quot;Capture&quot;-Fenster, wählen Sie ein Protokoll oder eine neue erstellen. Die Einstellungen sind wie folgt: CY5 (70 ms Belichtungszeit), Open (10 msec Exposition) und FITC (50 msec Exposition). Das Bild wird über 20 min (ca. 2.400 Zeitpunkten mit einem Intervall von 500 ms) erfasst. </li><li> Infundieren DyLight 488-konjugierten Anti-Maus-CD42c und Alexa Fluor 647-konjugierten Anti-Maus-Gr-1-Antikörpern wie oben beschrieben. </li><li> Optimieren Mikroskop Parameter einschließlich Fluoreszenz und Hellfeld in 3-3 bis 3-7 beschrieben. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Test&quot;, um die ordnungsgemäße Hellfeld Intensität oder Antikörper-Signal, Arteriole Platzierung und Ausrichtung zu gewährleisten. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot;, um die Bildaufnahme zu initiieren. </li><li> Vor dem Brennen der Abtragslaser, stellen Sie sicher, dass der Mauszeiger das Symbol ausgewählt wurde und dass der Gefäßwand ist ein klarer Fokus. </li><li> Um den Laser abfeuern, doppelklicken Sie auf eine Stelle 2-3 um intern auf der Gefäßwand. Verletzung der Arteriolen Endothelzellen bewirkt eine visuelle Form Veränderung, die offensichtlich sein sollte im Hellfeld Bild, gefolgt von Thrombozyten Akkumulation. Monitor ThrombusBildung für 5 min nach dem Laser Verletzungen. </li><li> Fünf Minuten nach der Laser-Verletzung (der Thrombus Größe sollte nun stabil sein) pause und stornieren die Aufnahme. Anschließend starten Sie eine Aufnahme mit 2400 Punkte mit einem 500 ms Intervall auf adhärente Thrombozyten und rollenden / anhaftenden Neutrophilen für 20 min aufnehmen. Drei bis fünf Arteriolen in einem Maus aufgezeichnet. </li><li> Nach Beendigung des Versuchs wurden die Mäuse über Genickbruch getötet. </li></ol> 6. Data Analysis für die Arteriolen Thrombose-Modell <ol><li> Fahren Sie über die Schritte 4.1 bis 4.5. </li><li> Um den Hintergrund Fluoreszenzintensität während der Thrombozyten Thrombusbildung zu erhalten, gehen Sie über Stufen 4,7 bis 4,14. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Mask&quot;, klicken Sie auf &quot;Segment&quot;, wählen Sie FITC im Kanal, und legen Sie den Mittelwert der Hintergrund-Signal auf Low. Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot; und &quot;OK&quot;. </li><li> Die Fluoreszenzintensität von Blutplättchenthrombus (DyLight 488-konjugierten Anti-CD42c-Antikörper) zu analysieren, </strong&gt; über Stufen 4,18 durchlaufen 4,19. Um die Antikörper-Signals zu berechnen, &quot;Summe Intensity&quot; wird von der Hintergrund subtrahiert (&quot;Maximum Intensity&quot; x &quot;Bereich (Pixel)&quot;). Dies ist die Fluoreszenzintensität der Blutplättchenthrombus. </li><li> Um die Rollen und anhaftenden Neutrophilen quantifizieren, spielen die timelapse und zählen die Anzahl der Zellen, die sichtbar in den Blutplättchenthrombus über 20 min rollen. Rollende wird als eine Abnahme der neutrophilen Geschwindigkeit definiert, während die Interaktion mit dem Blutplättchenthrombus für mindestens 2 Sekunden. Anhaftenden Neutrophilen gelten alle Neutrophilen, die an den Blutplättchen-Thrombus bleibt mindestens 2 min definiert. Die Zahl der rollenden und adhärenten Neutrophilen wurde als Zellzahlen pro 20 min vorgestellt. Walzgeschwindigkeit wurde berechnet unter Verwendung eines Teilchens Tracking-System. </li></ol>

<ol>
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C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1:+its+role+as+a+selectin+counterreceptor+in+leukocyte-endothelial+and+leukocyte-platelet+interaction.">The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction.</a> Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).</li><li>Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-neutrophil-interactions:+linking+hemostasis+and+inflammation.">Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation.</a> Blood Rev. 21, 99-111 (2007).</li><li>Chen, J., Lopez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+platelets+with+subendothelium+and+endothelium.">Interactions of platelets with subendothelium and endothelium.</a> Microcirculation. 12, 235-246 (2005).</li><li>Konstantopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+levels+of+shear+support+neutrophil-platelet+adhesion+and+neutrophil+aggregation+in+blood+via+P-selectin+and+beta2-integrin.">Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin.</a> Circulation. 98, 873-882 (1998).</li><li>Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+platelet-polymorphonuclear+leukocyte+interactions:+new+clues+to+the+antithrombotic+properties+of+parnaparin,+a+low+molecular+weight+heparin.">Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin.</a> Haematologica. 90, 833-839 (2005).</li><li>Hidalgo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+interactions+enabled+by+polarized+neutrophil+microdomains+mediate+thromboinflammatory+injury.">Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury.</a> Nat. Med. 15, 384-391 (2009).</li><li>Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+extracellular+protein+disulfide+isomerase+during+thrombus+formation+in+mice.">A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disulfide+isomerase+capture+during+thrombus+formation+in+vivo+depends+on+the+presence+of+beta3+integrins.">Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins.</a> Blood. 120, 647-655 (2012).</li><li>Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-versus+microparticle-mediated+tissue+factor+transfer+during+arteriolar+thrombus+development.">Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development.</a> Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).</li><li>Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+imaging+of+platelets,+tissue+factor+and+fibrin+during+arterial+thrombus+formation+in+the+mouse.">Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse.</a> Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).</li><li>Barthel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+1,3+fucosyltransferases+are+master+regulators+of+prostate+cancer+cell+trafficking.">Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).</li><li>Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule:+more+than+a+carcinoma+marker+and+adhesion+molecule.">Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule.</a> The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).</li><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li><li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1(+)+cell+subpopulations+during+microbial+infection.">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanzielles Interesse.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Echtzeit-Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündung und Thrombose zu visualisieren. Zuvor ähnliche fluoreszenzmikroskopische Ansätze gemeldet wurden, um die molekularen Mechanismen der Thrombusbildung und vaskuläre Entzündungen zu studieren. 8,12 Da die heterotypische Zell-Zell-Interaktion könnte für Vaso-Okklusion wichtig, an der verlet...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>0409-4888-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>0409-2051-05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic Tubing (PE 90)</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>427421</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic Tubing (PE 10)</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>427401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine TNF-&alpha;</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>410-MT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody</td>
			<td>Emfret Analytics</td>
			<td>X488</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NESLAB EX water bath/circulator</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX61W microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-100 Power</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG-4</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC-200 multi-manipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROE-200 stage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C9300 high-speed camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensifier</td>
			<td>Video Scope International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ablation Laser</td>
			<td>Photonic Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice

Wechselwirkung von aktivierten Blutplättchen und Leukozyten (hauptsächlich Neutrophile) auf der aktivierten Endothel vermittelt Thrombose und vaskuläre Entzündung. 1,2 Während Thrombusbildung an der Stelle der Verletzung arteriolären unterstützen Blutplättchen Anhänger der aktiviertes Endothel und subendothelialen Matrixproteinen neutrophilen rollenden und Haftung. 3 Umgekehrt unter venulären entzündlichen Erkrankungen können Neutrophile Anhänger der aktiviertes Endothel unterstützt Haftung und Akkumulation von zirkulierenden Blutplättchen. Heterotypische Blutplättchen-Aggregation neutrophilen erfordert sequentiellen Prozessen von den spezifischen Rezeptor-counter Rezeptor-Wechselwirkungen zwischen Zellen. 4 Es ist bekannt, aktivierten Endothelzellen Adhäsionsmolekülen wie von Willebrand-Faktor freizusetzen, initiiert somit Plättchenadhäsion und Akkumulation unter Hochscherbedingungen. 5 Außerdem aktivierten Endothelzellen unterstützt Neutrophilen rolling und Haftung durch die Expression Selektine eined interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1), bzw. bei niedrigen Shear-Bedingungen. 4 Platelet P-Selektin interagiert mit Neutrophilen durch P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1), dadurch Induzieren Aktivierung der neutrophilen β2 Integrinen und feste Haftung zwischen zwei Zelltypen. Trotz der Fortschritte in der in vitro-Experimenten, bei denen heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen in Vollblut oder isolierte Zellen, 6,7 ermittelt werden diese Studien nicht manipulieren kann Oxidationsmittel Stressbedingungen bei Gefäßerkrankungen. In diesem Bericht mit fluoreszenzmarkierten, spezifische Antikörper gegen eine Maus Blutplättchen und Neutrophilen-Marker beschreiben wir eine detaillierte Protokoll zu intravitalmikroskopische heterotypische Wechselwirkungen von Blutplättchen und Neutrophilen auf der aktivierten Endothelzellen während TNF-α-induzierte Entzündung oder nach laserinduzierten überwachen Verletzungen M. cremaster Mikrogefäßen von lebenden Mäusen.

Verwendung einer detaillierten Intravitalmikroskopie Analyse waren heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen auf der aktivierten Endothel visualisiert durch Infusion von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen ein Plättchen (CD42c) oder Neutrophilen Marker (Gr-1) in einen Live-Mäusen. In einem Modell der TNF-α-induzierte venulären Entzündungen, wurden die meisten Rollen Neutrophilen stabil an das Endothel vermutlich durch Interaktion von aktivierten β2 Integrine mit ...

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Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

real-time-imaging-heterotypic-platelet-neutrophil-interactions-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen....

Serie: Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways activated during cardiovascular pathologies are, however, limited by the lack of robust and physiologically relevant methods. In order to model pathological vascular events we have developed an in vitro assay for studying the interaction between endothelium and whole blood. The assay consists of primary human endothelial cells, which are placed in contact with human whole blood. The method utilizes native blood with no or very little anticoagulant, enabling study of delicate interactions between molecular and cellular components present in a blood vessel.
We investigated functionality of the assay by comparing activation of coagulation by different blood volumes incubated with or without human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Whereas a larger blood volume contributed to an increase in the formation of thrombin antithrombin (TAT) complexes, presence of HUVEC resulted in reduced activation of coagulation. Furthermore, we applied image analysis of leukocyte attachment to HUVEC stimulated with tumor necrosis factor (TNF&#945;) and found the presence of CD16+ cells to be significantly higher on TNF&#945; stimulated cells as compared to unstimulated cells after blood contact. In conclusion, the assay may be applied to study vascular pathologies, where interactions between the endothelium and the blood compartment are perturbed.

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen humanem Vollblut und Endothel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...