Die Forschung wird von den National Institutes of Health gewährt AI-52381, CA138623 und Kentucky Lung Cancer Research Board und institutionelle Unterstützung von James Graham Brown Cancer Center unterstützt.

Methodik Beschreibung von Mikroskop Live Cell Imaging Experimente mit TE-FM Epi-Fluoreszenz-System an Nikon Inverses Mikroskop Eclipse-TE300. Das Mikroskop mit Heiztisch ausgestattet. Ein kühles Snap HQ digital B / W CCD (Roper Scientific) Kamera und LAMDA 10-2 optischen Filter-Wechsler (Sutter Instrument Company) ist Mikroskop angeschlossen. Anregungs-und Emissionswellenlänge mit Filter Räder kontrolliert und gesteuert von Lamba 10-2 Filterrad Controller sollte Sutter Instruments Co. Belichtungszeit 500 ms genug sein, um RFP oder GFP in lebende Zellen. Hardware-Steuerung und Erfassung von Bildern von Metamorph-Software gesteuert. Die Wahl der Filter für die vorliegende Studie, setzt Filter S480/20x, S525/40m und S565/25x, S620/60m für GFP und RFP zeigen; EGFP / DsRed Dual dichroitische, Chroma Technology. Das Filterrad bietet Platz für bis zu sechs Filter-Sets. Mikroskop ist mit Vor Proscan Bühne Controller mit Joy-Stick befestigt. Alle diese Hardware-Anhänge können von Metamorph-Software gesteuert werden. Das Mikroskop ist auch mit Mikromanipulatoren an der Mikropipetten zu halten. A. Messung der Leukotrien B 4 Directed dendritische Zellen Migration Mit den oben beschriebenen Mikroskop-Einstellung, entwickelten wir Methoden für die folgenden Liganden gerichtet dendritischen Zellen Migration in Echtzeit. Zwei Mikromanipulatoren (Narishige) sind an das Mikroskop angeschlossen. Die Chemotaxis von Knochenmark der Maus abgeleiteten dendritischen Zellen (BMDCs) in Richtung LTB 4 Gradient wurde aufgezeichnet. Hier beschreiben wir die Methoden der Mikro-Pipetten Vorbereitung mit Mikro-Pipette Puller, das Laden der Liganden in Mikro-Pipette und die Einrichtung der Chemotaxis Experiment auf der beheizten Bühne des Mikroskops zu direktionale Migration von Zellen zu überwachen. Diese Methode kann angewendet, um die Wirksamkeit verschiedener Lockstoffe bei der Induktion der Migration sowie Wirkung von Inhibitoren der Chemotaxis in lebenden Zellen zu testen. Die Isolierung von BMDCs 21 von Maus hat in mehreren Publikationen, darunter JoVE den 22. beschrieben. 1. Vorbereitung der BMDCs <ol><li> Plate BMDCs (nach Kultivierung für 10 Tage) auf das Deckglas unten Fluoro Teller und lassen sie für 16 Stunden vor dem Experiment zu wachsen. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 3 ml 1X PBS mindestens 2-mal (durch Zugabe von 3 ml 1X PBS, um die Platte und das Absaugen des Puffers out). </li><li> 2 ml des 1XPBS auf den Teller. Die Zellen sind nun bereit für das Experiment. Halten Sie die Zellen in 37 ° C Inkubator vor dem Experiment. </li></ol> Vorbereitung der Ligand geladen Mikropipette: <ol start="4"><li> Fix die Glaskapillaren (Glass-Standard, 0,75 mm x 0,4 mm; 6 &quot;, Kat. Nr. 625500, AM Systems, INC) auf der vertikalen Mikropipette Abzieher (Narishige International USA, Inc). </li><li> Halten Sie die Temperatur bei 52 ° C und ermöglichen das Glas zu schmelzen und ziehen auseinander, um scharfe Kante Tipps zu bilden. </li><li> Befestigen Sie die Pipette auf die Mikro-Pipettenhalter. </li><li> Glätten Sie die Ecken und Kanten der Mikropipette mit Micro Schmiede M-900 (Narishige International USA, Inc) durch die Beobachtung unter dem Mikroskop. </li><li> Bereiten Sie mindestens 10-20 Pipetten für jedes Experiment. Hinweis: Die Mikropipetten können auch von World Precision Instruments (μ TIP, T1801TW1F) erworben werden. </li><li> Nehmen Sie gewünschte Konzentration (500 &amp;mgr; l von 100 nM LTB 4 in der aktuellen Experiment) des Liganden in 1 mL effendorf Rohr und halten Sie die Mikro-Pipettenspitze in die Lösung und damit die Lösung in die Mikropipette (back-Füllung) geben. </li><li> Nehmen Sie 1 mL von Ligand und in die Spritze (1 ccm Tuberkulin-Spritze) und langsam füllen den Liganden mit Micro-Fill-Nadel (MF 28G-5, World Precision Instruments) in Mikro-Pipette von oben. </li><li> Befestigen Sie die Schläuche, die eng anliegt, um die Pipette zu Pipette und Schlauch zur Nadel (21 G 11 / 2), die an 1 ml-Spritze, die mit Liganden gefüllt ist. </li><li> Nun vorsichtig bewegen den Liganden gefüllt Mikropipette auf dem Mikroskoptisch und fix auf Mikro-Manipulatoren. </li><li> Bewerben wenig Druck aus der Spritze, um sicherzustellen, Ligand wird langsam freigesetzt von der Spitze. </li><li> Bringen Sie die plattierten unreifen BMDCs an das Mikroskop und halten sie auf der Heizplatte (37 ° C) Bühne. </li><li> Entfernen Sie den Deckel von Fluor Gericht. </li><li> Fokussieren Sie die Zellen mit Hilfe von Öl-Immersion 60x Objektiv. </li><li> Vorsichtig bringen die Liganden geladen Pipette mit &#39;Coarse Manuelle Manipulator MN-188NE &quot;in die Nähe der Zellen. </li><li> Fokussieren Sie die Pipette mit &#39;Hydraulic Feine Micromanipulator MN-188 NE&#39;. </li><li> Bewerben wenig Druck aus der Spritze, um sicherzustellen, dass Liganden in Schale freigesetzt. </li><li> Stellen Sie die Bildaufnahme-Parameter, um in zu erwerben hellen eingereicht (10 ms Belichtungszeit) in alle 15 sec für 2 Stunden mit Metamorph-Software. </li><li> Halten Sie die Überwachung alle 30 min für progression der Migration in Richtung Liganden. </li><li> Wenn Zellen in Pipettenspitze sind überfüllt, ändern Sie die Position der Spitze in die Platte, um die Migration von Experiment fortzusetzen. </li></ol> B. Messung der GPCR (BLT1) und cytosolische Protein (β-Arrestin) Wechselwirkungen, Translokation in lebenden Zellen 1. Präparation von Plasmid-DNA-Konstrukten Die Details der DNA-Plasmid-Konstrukte wurden in Jala et al. (2005) 18 beschrieben. 2. Transfektion von humanen BLT1-RFP und β-Arrestin-GFP in RBL-2H3 Zellen <ol><li> Pflegen Sie die Ratte Basophile Leukomia (RBL-2H3) Cells (60 bis 70% Konfluenz) bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO 2 als Monolayer-Kulturen in Nährmedien (DMEM mit 15% FBS, 2 ergänzt mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin) in T75 Flaschen. </li><li> Lösen Sie die Zellen aus der Schüssel / Fläschchen mit 6 ml Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin, 0,53 mM EDTA) und Inkubation für 5 min bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO 2. Schütteln Sie die Flaschen auf den Umfang der Ablösung der Zellen zu überwachen. </li><li> Add 6 mL des Wachstums Medien Kolben mit 6 ml Trypsin-EDTA und sammeln Sie die Zellen, indem man sie durch Auf-und Abpipettieren mehrfach. Übertragen Sie die Zellen in 15 mL Falcon-Röhrchen. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer und nehmen Sie 4 x 10 6 Zellen in 15 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 480g rpm für 3 min und Resuspendieren in 200 ul der Transfektion Medien (DMEM, 20% FBS, 50 mM HEPES). Wenn Sie bis 3 Transfektionen durchzuführen planen, bereiten Sie die Zellen und tranfection Medien entsprechend durch eine Erhöhung der Zellzahl und das Volumen der Transfektion Medium. </li><li> Bereiten Sie die Plasmide auf die Konzentrationen von mindestens 1,5 ug / ul transfiziert werden. Wir bereiten die DNA-Plasmid mit QIAGEN Maxi-DNA-Plasmid-Kit. Fügen Sie die einzelnen oder beider Plasmid-DNA-Kodierung für die menschliche BLT1-RFP (25 ug) und β-arrestin1-GFP (15 ug) an sterile Elektrophorese Küvetten, (Bio-Rad # 16552088), die 0,4 cm Elektrodenabstand hat. </li><li> Nehmen Sie 200 ul der oben resuspendierten Zellen und legen Sie sie in Küvetten, die entweder hBLT1-RFP oder β-arrestin1-GFP oder beide zusammen und mischen sie vorsichtig mit 1 ml sterilen Pipette. </li><li> Verlassen Sie die oben Küvetten bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Elektroporieren die Zellen in Gene Pulser II mit 250 V und Kapazität 500 uF. </li><li> Nach der Elektroporation lassen die Zellen bleiben bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Nehmen Sie 1 mL der regelmäßigen Wachstumsmedium und mischen Sie es mit elektroporiert Zellen in den Küvetten. </li><li> Verteilen Sie 300 ul dieser Mischung in 35 mm Gewebe-Glasboden Kulturschalen (Fluoro Gericht, World Precision Instruments) mit 2 mL der regelmäßigen Wachstums Medien und inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO 2. Lassen Sie die Zellen zu Boden der Schale haften. </li><li> Ersetzen Sie die Medien nach 1 h Inkubation mit regelmäßigen Nährmedien und ihnen erlauben bei 37 ° C wachsen in einer angefeuchteten Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO 2-Inkubator für 18-24 Stunden. </li></ol> 3. Live Cell Imaging Erwerb von Bildern <ol><li> Nach 18-24 Stunden, waschen Sie die Zellen 2 oder 3 mal mit 2 ml warmes Phenolrot freien RPMI mit 10 mM HEPES, pH 7,55 (2 ml des warmen Medien direkt auf den Teller und saugen Medien. Wiederholen Sie 2 oder 3 mal). Fügen Sie 1,8 ml warmes Phenolrot freien RPMI mit 10 mM HEPES. </li><li> Platz 30 mm Deckglas-Boden Kulturschalen mit RBL-2H3-Zellen, mit hBLT1-RFP und β-arrestin1-GFP auf der beheizten Mikroskoptisch (37 ° C) transfiziert. </li><li> Sammeln Sie die Zelle Bilder bei 600x Vergrößerung mit 60 X Ziel Nikon Plan Apo 60X/1.4 numerische Apertur Ölimmersion (erhältlich in unserem Mikroskop-System). </li><li> Setzen Sie einen Öltropfen auf dem 60 x Objektiv Linse und konzentrieren sich die Zellen mit regelmäßigen Hellfeld Durchlicht durch Berühren der Unterseite der Platte. </li><li> Zur Überwachung der Fluoreszenz der transfizierten Proteine, Wechsel von Hellfeld (Durchlicht) zur Fluoreszenz-Filter (RFP-Filter, wenn Sie Rezeptor oder GFP zu sehen, wenn Sie β-arrestin1 sehen wollen). </li><li> Wählen Sie die hellen und gesunden Zelle, die hBLT1-RFP drückt auf der Zelloberfläche mit RFP-Filter und das Bild aufzunehmen. </li><li> Dann GFP-Filter Verschiebung und stellen Sie sicher, dass β-Arrestin-GFP im Zytoplasma exprimiert und das Bild aufzunehmen. Dann pseudo Farbe sowohl die Bilder, vor der Aufnahme Zeit zu leben Zelle Bilder erloschen, um sicherzustellen, dass Durchscheinen der Fluoreszenz ist nicht an, die zwischen RFP und GFP. </li><li> Sobald die Wahl der Ihr Handy aus, legen Sie die Parameter entsprechend Ihren Zweck mit einer Software (Metamorph Software in diesem Fall). </li><li> In der aktuellen Demo sind sechzehn Bit-Bilder mit dem kam erworbenra Binning auf 1 X 1 mit 60 X Ziel Nikon Plan Apo 60X/1.4 numerische Apertur Ölimmersion kombiniert. </li><li> Sammeln Sie die Fluoreszenzbilder für RFP und GFP Fluorochrome gleichzeitig bei 30 sec Zeitabstand (wenn die Translokation / Interaktionen zu schnell sind, kann man die Zeitintervalle zu reduzieren) dieser mit Filterräder von Metamorph-Software gesteuert. </li><li> Die Kamera Belichtungszeiten auf 1000 msec für RFP und GFP. (Stellen Sie den spezifischen Belichtungszeiten entsprechend der Fluoreszenzintensität von RFP und GFP). </li><li> Zunächst sammeln die Bilder für 1 min ohne Zugabe von Liganden, die als 0 Zeitpunkt dient. </li><li> Fügen Sie die 200 ul von Ligand (ab Lager von 10 pM bis zu einer Endkonzentration von 1 M) nach 1 min, ohne die Platte / oder Zell-Position. </li><li> Die Fluoreszenz-Bilder werden für 60 min nach der Zugabe des Liganden gesammelt und gespeichert als TIFF-Bilder mit aufsteigender Reihenfolge der Dateinamen. </li><li> Alle diese Dateien können als Stapel-Dateien mit individuellen / kombiniert Fluoreszenzbilder mit Zeitstempeln mit der Software vorgenommen werden. </li></ol> Prozess von Bildern und Quantifizierung der Fluoreszenz von Proteinen und Lokalisierung <ol><li> Erwerben Sie die Bilder mit Normalpapier (keine Zellen) mit RFP und GFP Fluoreszenz-Filter und speichern Sie sie als Hintergrundbilder. Verwenden Sie diese Bilder von den tatsächlichen Daten erhaltenen Bilder oben abziehen. </li><li> Bereiten Sie den Stapel von Bildern individuell für RFP und GFP Bilder. </li><li> Select / definieren die verschiedenen Regionen (Oberfläche vs cytosolische), um die Fluoreszenz-Intensität des RFP und GFP (BLT1 und β-Arrestin Translokation) messen </li><li> Zeichnen Sie die Menge Fluoreszenzintensitäten als Funktion der Zeit. Dieser Graph wird den Informationen über die Kinetik der Translokation von bestimmten Moleküls. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse A. Messung der Leukotrien B 4 Directed dendritische Zellen Migration Die Methode in diesem Protokoll beschrieben wurde verwendet, um die dendritischen Zellen die Migration in Richtung Leukotrien B 4 (Abbildung 1 und die angeschlossenen Video-1) 21 zu bestimmen. Wir können gelten ähnliche Methodik auf die chemotaktische Fähigkeit von Zellen, um einen bestimmten Liganden in lebenden Zellen zu bestimmen. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Knochenmark der Maus abgeleiteten dendritischen Zellen Migration hin zu 100 nM LTB 4. Video 1. Live Zellmigration von BMDCs Richtung LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Boddulrui_Video1.AVI">Klicken Sie hier, um Video zu sehen</a> . B. Messung der GPCR (BLT1) und cytosolische Protein (β-Arrestin) Wechselwirkungen, Translokation in lebenden Zellen Nach Abschluss dieses Verfahrens kann man die folgenden Informationen in GPCR Signalwege. <ol class="lroman"><li> Die Lokalisierung von GPCR-und zytosolischen Proteinen und Kern (Abbildung 2). </li><li> Ligand induzierten Interaktion von Oberflächen GPCR (BLT1 in diesem Fall) mit cytosolischen Protein (β-Arrestin in diesem Fall) (Abb. 3). </li><li> Kinetik der Rezeptor-Internalisierung und β-Arrestin Translokation zur Membran durch Internalisierung zusammen mit Rezeptoren (Abbildung 4) (Jala et al. 2005) 18 gefolgt. </li><li> Man kann bestimmen, der Ligand-Rezeptor-abhängige Aktivierung Status in lebenden Zellen (beigefügten Video 2) und bestimmen kritische Motive oder Prozesse in der Rezeptor-Aktivierung (Jala et al. 2005) 18 beteiligt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Expression von BLT1-RFP (A), β-Arrestin-GFP (B), pNuc-CFP (C) in RBL-2H3-Zellen. Farbe kombinierte Bild in Panel D gezeigt <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ligand induzierte Translokation des Rezeptors und β-Arrestin. Zeilenkameras der Fluoreszenz-Intensitäten in den Zellen angezeigt werden. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Kinetik der Rezeptor-Internalisierung und β-Arrestin-Translokation bei der Zugabe von 1 uM LTB 4. Die Fluoreszenzintensitäten wurden als eine Funktion der Zeit an der Membran und cytosolische Standorte der Zelle gemessen. Video 2 Live Bildgebung von Zellen, die BLT1-RFP und β-Arrestin-GFP bei der Zugabe von 1 uM LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Bodduluri_Video2.AVI">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a>

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Live Cell Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktion und Wechselwirkungen der Proteine, wie sie in real-time auftreten zu demonstrieren. Die Methoden in diesem Manuskript beschrieben zeigen deutlich, dass LTB 4 kann eine schnelle Migration von dendritischen Zellen zu induzieren. Diese Methoden erweitern nicht nur die Aspekte der LTB 4-Funktion, um diverse Zelltypen, erlauben sie ähnliche Methoden, um eine Vielzahl von anderen Chemokinen angewendet werden und Prüfung ihrer Wirksam...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell lines:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CRL-2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Delbecco's modified Eagle&#x2019;s Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol red free RPMI or DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11835-030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES (1M)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Others:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>FD35-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>16552088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instruments/software:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser II electroporater </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Universal Imaging</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical Micro-pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Forge M-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hadraulic Micromanipulator MO-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coarse Manual Manipulator, MN-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA constructs:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (&beta;-arrestin1-GFP in present study).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

real-time imaging of leukotriene b4 mediated cell migration and blt1 interactions with &beta;-arrestin

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) gehören zu den sieben Transmembran-Protein-Familie und vermitteln die Transduktion der extrazellulären Signale an intrazelluläre Reaktionen. GPCRs Kontrolle vielfältigen biologischen Funktionen wie Chemotaxis, intrazellulären Calcium-Freisetzung, Genregulation in einem Liganden abhängigen Art und Weise über heterotrimeren G-Proteine ​​1-2. Ligandenbindung induziert eine Reihe von Konformationsänderungen führt zu einer Aktivierung der heterotrimeren G-Proteine, die Ebenen der Botenstoffe wie zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), Inositol-Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DG) modulieren. Einhergehend mit Aktivierung des Rezeptors Ligandenbindung löst auch eine Reihe von Veranstaltungen an den Rezeptor Signalgebung über Desensibilisierung, Zwangsverwaltung und / oder Internalisierung zu dämpfen. Die Desensibilisierung Prozess der GPCRs erfolgt über Rezeptor-Phosphorylierung durch G-Protein-Rezeptor-Kinasen (GRKs) und die anschließende Bindung von β-arrestins 3. β-arrestins sind cytosolische Proteine ​​und Translokation zur Membran auf GPCR-Aktivierung, die Bindung an phosphorylierte Rezeptoren (meistens) gibt es durch die Erleichterung des Rezeptor-Internalisierung 4-6. Leukotrien B 4 (LTB 4) ist ein pro-inflammatorischen Lipidmolekül aus Arachidonsäureweg und vermittelt seine Aktionen über GPCRs, LTB 4-Rezeptor 1 (BLT1, ein Rezeptor mit hoher Affinität) abgeleitet und LTB 4-Rezeptor-2 (BLT2, ein Rezeptor mit niedriger Affinität ) 7-9. Die LTB 4-BLT1 Weg hat sich gezeigt, kritisch zu sein in mehrere entzündliche Erkrankungen wie Asthma, Arthritis und Atherosklerose 10-17. Das vorliegende Papier beschreibt die Methoden entwickelt, um LTB 4-induzierte Leukozyten-Migration und die Wechselwirkungen von BLT1 mit β-Arrestin und Rezeptor-Translokation in lebenden Zellen mit Mikroskopie-Techniken 18-19 überwachen. Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen aus C57BL / 6 Mäuse wurden isoliert und kultiviert wie zuvor 20-21 beschrieben. Diese Zellen wurden im Live Cell Imaging-Methoden getestet, um LTB 4 induzierten Zellmigration zu demonstrieren. Der menschliche BLT1 wurde mit rot fluoreszierendes Protein (RFP-BLT1) am C-Terminus und β-arrestin1 mit grün fluoreszierende Protein (β-arr-GFP) markiert markiert und transfizierten der beiden Plasmide in Rat Basophile Leukomia (RBL-2H3)-Zelllinien 18-19. Die Kinetik der Wechselwirkung zwischen diesen Proteinen und Lokalisation wurden unter Verwendung lebender Zellen Video-Mikroskopie. Die Methoden in der aktuellen Papier beschreiben die Verwendung von mikroskopischen Techniken, um die funktionellen Antworten von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in lebenden Zellen zu untersuchen. Das vorliegende Papier beschreibt auch die Verwendung von Metamorph Software, um die Fluoreszenz-Intensitäten zu quantifizieren, um die Kinetik der Rezeptor und cytosolische Protein-Interaktionen zu bestimmen.

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Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

Dieses Papier beschreibt die Methodik auf die chemotaktische Reaktion von Leukozyten an spezifische Liganden zu bestimmen und zu identifizieren Wechselwirkungen zwischen den Rezeptoren auf der Zelloberfläche und zytosolischen Proteinen unter Verwendung von Live Cell Imaging Verfahren.

Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

12.7K Aufrufe.  University of Louisville. Dieses Papier beschreibt die Methodik auf die chemotaktische Reaktion von Leukozyten an spezifische Liganden zu bestimmen und zu identifizieren Wechselwirkungen zwischen den Rezeptoren auf der Zelloberfläche und zytosolischen Proteinen unter Verwendung von Live Cell Imaging Verfahren.

Serie: Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mithilfe der Echtzeit-Zellanalyse

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies bei Neutrophilen, die mit Meningitic Escherichia Coli infiziert sind

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...