Wir danken Sacha Reichmann und Dominique Santiard-Baron für ihre Hilfe bei der Bearbeitung der RNA Aufreinigung Protokoll.

1. JOURNAL: Verfahren, um die Proben aus der OP-Block Recover Im Labor <ol><li> Holen Sie sich einen Vertrag Einfuhr von Eilschiffahrtsgesellschaft. </li><li> Füllen 10 (oder 25) bildet mit dem Versand Postanschrift des Labors, die die Ansprechpartner im Labor (Telefonnummer und E-Mail-Adresse). </li><li> Planen 10 (oder 25) Proben Formen nummeriert von 1 bis 10 (oder 25). Diese Formen sind dedizierte Bereiche auf einer) anonyme Identifikation des Patienten informieren, b) das Datum der Operation und c) alle zusätzlichen Bemerkungen der Chirurg möchte hinzufügen. Bereiten 10 (oder 25) Versandtaschen (150 x 210 mm). </li><li> Hergestellt unter Verwendung von RNAse-freie Reagenzien 25 (oder 65) ml 6 M Guanidinchlorid in Diethylpyrocarbonat (DEPC) H 2 O (GHCl) behandelten. </li><li> Füllen Sie 10 oder 25 nummerierte 5 ml sterile Polyethylen Rundbodengefäße mit 2,4 ml Lösung GHCl. </li><li> Gebrauchte Argongas, um den oberen Teil dieser Rohre zu füllen, dann drücken tightly auf der Kappe, um die Oxidation des GHCl Lösung über mehrere Jahre der Lagerung in der chirurgischen Kabinett zu verhindern. </li><li> Führen Sie alle 5-ml-Röhrchen in einem 50 ml sterile Polypropylen Spitzboden Rohr mit Schraubverschluss. Verwenden Sie ein sauberes Papiertuch, um die 5-ml-Tube in der 50 ml Tube halten, schließen Sie das Rohr. </li><li> Legen Sie die 50 ml Röhrchen auf einer Polystyrol-Rack und die Zahnstange in einem Karton mit den gepolsterten Umschläge, die Versandkosten Formen, die Proben Formen. </li><li> Fügen Sie den Anweisungen (siehe: 1,12-1,19) Innenseite des Deckels der Karton zu ihrer Lektüre zu erleichtern. </li><li> Senden Sie den Karton per Post an die Ansprechpartner in der Klinik. </li></ol> Im Krankenhaus <ol start="11"><li> Bringen Sie den Karton aus dem Schrank zu chirurgischen Operationssaal. Warnhinweis: Wenn das Verfahren beinhaltet einen immungeschwächten Patienten, der Karton sollte nicht auf den Operationssaal gebracht werden. </li><li> Während der Operation, platzieren Sie den retinalen Specimen in nummerierten 5 ml sterile Polypropylen mit GHCl Lösung gefüllt. Schließen Sie den Schlauch fest. </li><li> Bringen Sie den Schlauch kurz. </li><li> Das Röhrchen wird auf das Blut Rohr Wippe für 10 min. </li><li> Füllen Sie das beigefügte Formular Probe nummeriert. </li><li> Melden die Identifikationsnummer auf den entsprechenden Nummern 50 ml Tube. </li><li> Führen Sie die 5-ml-Tube mit dem chirurgischen Probe in die 50-ml-Tube, ersetzen Papiertaschentuch und schrauben Sie den Schlauch. </li><li> Führen Sie das Rohr und die gefüllte Probe Form hinein in eine der begleitenden gepolsterten Umschlägen. Schließen Sie es. </li><li> Rufen Sie den Eilschiffahrtsgesellschaft für die Abholung. </li></ol> 2. RNA Purification Im Labor <ol><li> Homogenisieren der Probe in seiner 5-ml-Tube mit Polypropylen GHCl Lösung mit einem Homogenisator für 1 min, während sie sich das Rohr nach oben und unten. </li><li> In 270 ul 2 M Kaliumacetat pH 5,0. Durch kräftiges Schütteln für 10 min, indem das Röhrchen auf einem Schüttler in seinerhorizontale Position (420 min -1). </li><li> Zentrifuge 10 min bei 5.000 rpm (6.500 xg) bei 20 ° C. </li><li> Saugen Sie sanft die lösliche Fraktion, ohne das Pellet. </li><li> Übertragen in eine 14 ml sterilen Röhrchen. </li><li> In 5,3 ml 100 mM Tris pH 8,0, N-Lauroylsarcosin 1%. </li><li> In 3,2 g Cäsium-Chlorid (CsCl) und mischen Sie den Schlauch durch Vortexen. </li><li> In 1,8 ml CsCl / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einem sterilen 11 ml Polyallomer-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Mit 10 ml sterile Pasteur-Pipette, übertragen die RNA-Lösung auf 1,8 ml CsCl / EDTA, indem langsam auf dem Rand der Röhre zu verhindern, daß die Dichte Kissen. </li><li> Die Röhrchen (eine zweite Röhre enthält, die Puffer ohne Netzhaut falls erforderlich) in den Rotor. </li><li> Zentrifuge 24 h bei 32.000 rpm (225.000 xg) bei 20 ° C. </li><li> Entfernen Sie den oberen Teil der Lösung mit einer sterilen Pasteurpipette und entsorgen. </li><li> Entfernen allmählich während der Überprüfung derMoment, wenn die DNA (viskose) mit einer zweiten sterilen Pasteurpipette abgesaugt, und entsorgen. </li><li> Entfernen Sie die verbleibende Lösung kümmert sich nicht um die RNA-Pellet mit einem dritten sterilen Pasteurpipette freizugeben. </li><li> Abschnitt der Boden des Röhrchens mit einem Skalpell Flamme sterilisiert, dann die restlichen Teil des Rohres es kopfüber auf einem sterilen Blick. </li><li> Kehren Sie den Schlauch und spülen zart mit 160 ul GHCl. </li><li> Lassen Sie das Pellet trocken für 10 min. </li><li> Das Pellet in 150 ul (10 mM Tris pH 7,5 bis 1 mM EDTA - 0,1% SDS). </li><li> Übertragen Sie die Lösung in eine 2 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchens, dann ernten die restliche Pellet mit 30 ul (10 mM Tris pH 7,5 bis 1 mM EDTA - 0,1% SDS). </li><li> In 150 ul (10 mM Tris pH 7,5 bis 1 mM EDTA). </li><li> In 30 ul 3 M Natriumacetat pH 5,0, Vortex die Röhre. </li><li> In 900 ul Ethanol 100% (-20 ° C), Vortex die Röhre. </li><li> Das Röhrchen 30 min in schmelzendem Eis. </li><li> Cenfuge das Rohr 30 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie vorsichtig die lösliche Fraktion, und entsorgen Sie sie. </li><li> In 500 ul 70% Ethanol (RT), Vortex die Röhre. </li><li> Das Röhrchen 20 min bei 15.000 rpm (18.000 × g) bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie den Spülvorgang (70% Ethanol). </li><li> Kurz zentrifugieren und beseitigen das restliche Ethanol mit einer Pipette P200. </li><li> Lassen Sie das Pellet Luft trocknen für 10 min. </li><li> Das Pellet in 50 ul DEPC-behandeltem H 2 O. </li><li> Mischen Sie kräftig durch Vortexen. </li><li> Inkubieren 15 min bei 45 ° C in einem Wasserbad inkubiert. </li></ol> 3. RNA-Analyse durch Gelelektrophorese <ol><li> Gießen Sie ein Agarosegel in einem chemischen Kapuze. </li><li> In einem sterilen 1,5-ml-Röhrchen, fügen Sie 2 ul RNA analysiert werden und 6,4 ul Probenvorbereitung Puffer. </li><li> In einem zweiten 1,5-ml-Röhrchen, fügen Sie 3 ul RNA-Standards und 9,6 ul Probenvorbereitung Puffer. </li><li> Erhitzen Sie die Röhrchen 15 min bei 65 ° C, Legte sie auf Eis. </li><li> 1 ul Ethidiumbromid (EB) Ladepuffer ohne Farbstoff in der RNA-Probe Rohr und 1 ul EB Ladepuffer mit Farbstoff in der RNA-Standards Rohr. </li><li> Die Elektrophorese unter 80 - 100 V Innerhalb einer chemischen Haube in Laufpuffer, bis einer der Farbstoffe (Bromphenolblau) erreicht 2/3 von der Unterseite des Gels. </li><li> Spülen Sie das Gel zweimal 15 min mit 250 ml de DEPC-behandeltem 2x SSC. </li><li> Nehmen Sie ein digitalisiertes Bild unter UV-Beleuchtung. </li><li> Berechnen des Verhältnisses zwischen dem oberen Band (23S rRNA) und das untere Band (16S rRNA). </li></ol> 4. Die endgültige Reinigung der RNA <ol><li> Stellen Sie die Lautstärke der RNA-Probe auf 100 ul mit DEPC-behandeltem H 2 O (falls erforderlich). </li><li> 100 l von Acid Phenol (1 ml Phenol gesättigt in DEPC-behandeltem H 2 O + 130 ul 50 mM Natriumacetat, pH 5,2) zugeben und kräftig vortexen. </li><li> Zentrifugieren 10 min bei 13.000 rpm (15.000 × g) bei Raumtemperatur. </li><li> Recover sorgfältig und übertragen Sie die wässrige Phase (obere Phase) in einem Roman eine sterile 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> In 10 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 250 ul Ethanol 100% (-20 ° C). </li><li> Das Röhrchen 30 min in schmelzendem Eis. </li><li> Das Röhrchen 30 min bei 14.000 rpm (18.000 xg) bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie sorgfältig die lösliche Fraktion, und entsorgen Sie sie. </li><li> In 500 ul 70% Ethanol (Raumtemperatur), und das Röhrchen vortexen. </li><li> Das Röhrchen 20 min bei 14.000 rpm (18.000 xg) bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie den Spülvorgang (70% Ethanol). </li><li> Kurz zentrifugieren und beseitigen das restliche Ethanol mit einer Pipette P200. </li><li> Luft trocknen lassen das Pellet für 10 min. </li><li> Das Pellet in 50 ul DEPC-behandeltem H 2 O. </li><li> Inkubieren dann Röhrchen 15 min bei 45 ° C. </li><li> Messen Sie die Absorption (Abs) bei 260 nm und 280 nm auf 2 ul der RNA-Probe. Berechnet das Verhältnis Abs260/Abs280. </li> &lt;li&gt; Store die RNA-Probe bei -80 ° C (stabil für mehrere Jahre). </li></ol> 5. Lösungen und Reinigungsverfahren <ol><li> Kaliumacetat 2 M, pH 5.0: Lösen 19,6 g Kaliumacetat in 70 ml DEPC-H 2 O. behandelt Reinigen Sie das pH-Meter Sonde durch Einweichen in mit 1 M NaOH für 15 min, gefolgt von 5 Spülungen mit DEPC-behandeltem H 2 O. Auf pH 5,0 mit Essigsäure dann die Lautstärke auf 100 ml mit DEPC-H 2 O. behandelt </li><li> Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%: Man löst 2 g N-Lauroylsarcosine (unter einer Haube) in 40 ml 0,5 M Tris-Base pH 8,0. Stellen Sie die Lautstärke auf 200 ml mit DEPC-H 2 O. behandelt) CsCl / EDTA: 96 g CsCl in 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 mit DEPC-H 2 O. behandelt vorbereitet Autoklav und die Lautstärke auf 100 ml mit DEPC-behandeltem H 2 O. Überprüfen Sie für pH &lt;7,5. </li><li> Agarosegel 1%: Setzen Sie 1 g Agarose in 62 ml DEPC-H 2 O. behandelt Kochen in der Mikrowelle. In 18 ml von 12,3 MFormaldehyd, 20 ml 5x MOPS. Gießen Sie in einem chemischen Kapuze. </li><li> Probenvorbereitung Buffer: Um vorbereitet extemporary sein. Mischen Sie in einer chemischen Haube 8 ul 5x MOPS, 16 ul 12,3 M Formaldehyd und 40 ul Formamid. </li><li> EB Ladepuffer (ohne Farbstoff): Um vorbereitet extemporary sein. In 4 ul 10 mg / ml Ethidiumbromid in 20 ul 80% Glycerin mit DEPC-behandeltem H 2 O. vorbereitet </li><li> EB Ladepuffer (mit Farbstoff): Um vorbereitet extemporary sein. In 2 ul 10 mg / ml Ethidiumbromid in 10 ul 80% Glycerin enthält 0,25% Xylem cyanol, 0,25% Bromphenolblau mit DEPC-H 2 O. behandelt </li><li> Laufpuffer: Zu 60 ml 5x MOPS, fügen Sie 54 ml 12,3 M Formaldehyd und 186 ml DEPC-behandeltem H 2 O. </li><li> Inkubieren destilliertem Wasser mit 0,1% v / v Diethylpyrocarbonat für 2 Stunden bei 37 ° C unter Rühren: H 2 O DEPC-behandelt. Sterilisieren im Autoklaven. </li><li> Reinigung der Homogenisator: 25 ml Reinigungslösung (RBS) zu 1 l DEPC-behandelt H 2 O, und tauchen die Achse 1 min unter Rühren. Inkubieren 2 Std bei 60 ° C. Gründlich mit DEPC-behandeltem H 2 O Wickeln Sie das Gerät in Aluminium und in das Gerät ein. Wickeln Sie die Box. Sterilisieren im Autoklaven. </li><li> Reinigung des Elektrophoresevorrichtung: Waschen Sie das Gerät, das Fach und die 15-Brunnen komb. Inkubieren 15 min in 3% Wasserstoffperoxid. Spülen einmal mit 100% Ethanol. Air trocken. </li><li> Reinigung der Glasschalen: Reinigen Sie das Glas Gerichte RBS 2% die ganze Nacht, dann mit destilliertem Wasser vor der Sterilisation gründlich bei 200 ° C. </li></ol>

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	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Entwicklung eines Verfahrens zur Gewebe Erholung von der OP-Block ist wesentlich für die Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Man sollte beachten, dass diese Art der Operation in Not und die Augenärzte Betriebssystem haben wenig Zeit, um in einer biologischen Forschungsprogramm teilnehmen, wenn sie tätig wird geübt. Diese Retinektomie auch stochastisch in jeden Dienst durchgeführt, so dass der einfachere Weg zu statistischen Zahlen erreichen, mit einem Netzwerk zu arbeiten. In einem solchen Netzwerk ist ...

Die wichtigste therapeutische Ziel in Netzhautablösung (RD) ist, einen Weg zu Photorezeptor Zellschäden und Netzhautentzündungen aus der Abtrennung von den Photorezeptoren der retinalen pigmentierten Epithelzellen begrenzen finden. Während RD, sind RPE-Zellen aktiviert, wandern, dedifferenzieren, und vermehren sich an der Oberfläche der abgelösten Netzhaut ausübt kontraktilen Kräfte führt zu Komplikationen. Transcriptomics Analyse der RD ist ein Weg, um Zielgene mit modifizierten Ausdruck identifizieren nach RD und damit zukünftige therapeutische Moleküle, die endgültige visuelle Ergebnis in Kombination mit Chirurgie verbessern könnte. Es ist bekannt, Ribonukleinsäure (RNA) ist nicht stabil wie Desoxyribonukleinsäure (DNA), wobei letztere ausgiebig für genetische Studien verwendet wird, hatte seine Stabilität die Sequenzierung des Neandertaler-Genoms von paläontologischen Proben von mehr als 30.000 Jahre alt 2 zulässig. Die Transkription der DNA der Gene aus dem Genom in Boten-RNA istHauptprozess in der Genexpression und der mRNA ist, um ein Signal zu bilden labil. RNAs sind sehr schnell durch RNAse Enzyme, die das Signal zu beenden. Wenn Gewebe aus einem Organismus isoliert werden, sind die RNAs sehr oft abgebaut, bevor der Ausdruck in einem Forschungslabor untersucht wird. Gestörter RNA ist nicht für die Analyse der Genexpression geeignet. Da das Laborpersonal nicht in der Chirurgie zu beteiligen, wurde ein Verfahren entwickelt, das einfach und erfordert lediglich, dass der Chirurg das Gewebe in eine geeignete RNAse-freie Lösung zu erholen. Die RNA aus den Geweben ist stabil und kann ohne Anzeichen von Abbau nach 72 Stunden bei Raumtemperatur in dieser Lösung analysiert werden. Die RNAs von Proben werden durch ein standardisiertes Verfahren, das eine Ultrazentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten nachdem das Labor 3 übertragen wurden gereinigt. Dann werden die Qualität der RNA durch Agarose-Gelelektrophorese und mittels RT-PCR untersucht. Die RNA Aufreinigung Protokoll hat dieVorteil der Trennung der Moleküle nach ihrer Dichte, die sich für die DNA und RNA ist und gewährleistet, dass die RNA nicht durch eine DNA-Moleküle, die Artefakt-Signale in Genexpressionsstudien erzeugen verunreinigt. Darüber hinaus werden die Transfer-RNAs (tRNAs), die quantitativ sind die häufigsten RNA in einer Zelle gemäß der gleichen physikalischen Eigenschaft aus der ribosomalen RNA (rRNA) und die Messenger-RNA (mRNA), die beiden zuletzt die das abgetrennte Endprodukt des Reinigungsprozesses. Die Entfernung der tRNA aus der Herstellung ist nützlich, da die meisten der Mikroarray Analyseprotokollen bei dem durch Verwendung von Reverse Transkriptase und RNA-Polymerasen, die von tRNA 4-6 gehemmt werden. Die gereinigte RNA von chirurgischen Proben markiert sind unter Verwendung des Standardprotokolls und hybridisiert mit einem Microarray-Chip und die Ergebnisse wurden mit zwei komplementären Verfahren der False Discovery-Verfahren und unter Verwendung eines neuartigen Verfahrens zur gegenseitigen Information und Visualisierung basierendzed auf der web-basierten Server Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

Netzhautablösung (RD) beschreibt eine Trennung der Neuroretina aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Das RPE ist wichtig für die normale Funktion der lichtempfindlichen Nervenzellen, die Photorezeptoren. Ablösung der Netzhaut von der RPE schafft eine physische Lücke, die mit extrazellulären Flüssigkeit gefüllt ist. RD initiiert zellulären und molekularen unerwünschten Ereignisse, die sowohl die Neuroretina und die RPE da die physiologischen Austausch von Ionen und Metaboliten stark gestört wird beeinflussen. Die Folge für das Sehen ist auf die Dauer der Abteilung seit einer schnellen reapposition der beiden Geweben führt zur Wiederherstellung des Sehens 1 verbunden. Die Behandlung von RD ist ausschließlich chirurgisch. Entfernen des Glaskörpers (Vitrektomie) wird durch die Entfernung nicht wesentlicher Teil der Netzhaut um die freistehende Fläche zu Netzhautablösung begünstigen gefolgt. Die entnommenen Proben sind retinale res nullius (nichts) und damit in der Regel verworfen.Um RNA aus diesen chirurgischen Proben zu erholen, haben wir das Verfahren Journal, dass RNA Erhaltung ermöglicht während der Übertragung aus dem OP-Block an das Labor. Wir haben auch ein Protokoll zur standardisierten RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation zu reinigen, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für globale Genexpressionsanalyse sind. Die Qualität der RNA wurde sowohl durch RT-PCR und Microarray-Analyse bestätigt. Die Analyse der Daten zeigt eine gleichzeitige Einbeziehung der Entzündung und Photorezeptordegeneration während RD.

Das Verfahren Journal (Abbildung 1) ermöglicht es uns erholen Exemplare der Netzhaut von der chirurgischen Block gereinigte RNA, und das Transkriptom der Netzhautablösung zu analysieren. Netzhautablösung führt zur Hochregulation des Monozyten chemotaktische MCP1 Gen CCL2, und in der Abnahme der Expression der Stange Photorezeptor Transduzieren Gen GNAT1, die Kurzwelle Kegel Opsin OPN1SW und die homeogene CRX (Abbildung 2). Die Induktion von Entzü...

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Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Wir verwendeten Retina Proben aus Retinektomie für eine Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Wir entwickelten ein Verfahren, das RNA Konservierung zwischen den chirurgischen Blöcke und Labor ermöglicht. Wir standardisierten ein Protokoll zur RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für Microarray-Analyse sind zu reinigen.

Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K Aufrufe.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. Wir verwendeten Retina Proben aus Retinektomie für eine Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Wir entwickelten ein Verfahren, das RNA Konservierung zwischen den chirurgischen Blöcke und Labor ermöglicht. Wir standardisierten ein Protokoll zur RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für Microarray-Analyse sind zu reinigen.

Serie: Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Forschung

Medizin

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. Recent technological progress has enabled the fabrication of microelectrode arrays that allow recording the activity of multiple individual neurons in the neocortex of the human brain. These arrays have the potential to bring unique insight onto the neuronal correlates of cerebral function in health and disease. Furthermore, the identification and decoding of volitional neuronal activity opens the possibility to establish brain-computer interfaces, and thus might help restore lost neurological functions. The implantation of neocortical microelectrode arrays is an invasive procedure requiring a supra-centimetric craniotomy and the exposure of the cortical surface; thus, the procedure must be performed by an adequately trained neurosurgeon. In order to provide an opportunity for surgical training, we designed a procedure based on a human cadaver model. The use of a formaldehyde-fixed human cadaver bypasses the practical, ethical and financial difficulties of surgical practice on animals (especially non-human primates) while preserving the macroscopic structure of the head, skull, meninges and cerebral surface and allowing realistic, operating room-like positioning and instrumentation. Furthermore, the use of a human cadaver is closer to clinical daily practice than any non-human model. The major drawbacks of the cadaveric simulation are the absence of cerebral pulsation and of blood and cerebrospinal fluid circulation. We suggest that a formaldehyde-fixed human cadaver model is an adequate, practical and cost-effective approach to ensure proper surgical training before implanting microelectrode arrays in the living human neocortex.

We designed a procedure in which a formaldehyde-fixed human cadaver is used to assist neurosurgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain.

Chirurgische Ausbildung für die Implantation der neokortikalen Mikroelektrode Arrays mit einem Formaldehyd-feste menschliche Kadaver-Modell

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnose und chirurgische Behandlung von Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...