Dysregulierte Redox-Signalisierung ist in die Pathogenese verschiedener Krankheiten involviert. Das Studium der Redoxbiologie erfordert den genauen Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies in verschiedenen Zell- und Gewebekompartimenten. Die EPR-Spektroskopie ist die einzige Methode, die freie Radikale eindeutig misst.
Dieses Protokoll zeigt eine praktische Methode zur Handhabung und Lagerung von biologischen Proben für die EPR-Spektroskopie. Diese Protokolle veranschaulichen die Verwendung von EPR und Spinsonden in zwei repräsentativen Modellen. Obwohl sie angepasst werden können, um die aktiven Arten in anderen biologischen Umgebungen zu bewerten.
Das Design des Experiments und der Umgang mit der Probe sind entscheidend für ihre Reproduzierbarkeit. Wir empfehlen, die Zelldichte zu berücksichtigen und geeignete zeitgerechte Kontrollen sicherzustellen. Beginnen Sie damit, roh 264,7 Zellen mit einem Milliliter Krebs-Henseleit-Puffer oder KHB pro Brunnen sanft zu waschen.
Und behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikroliter KHB, ergänzt mit 100 Mikromil DTPA pro Brunnen. Um mit Superoxid-Dismutase zu pretreat, fügen Sie 15 Mikroliter Superoxid-Dismutase-Lager, oder Fahrzeug, zu jedem Brunnen, und legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Am Ende der Superoxid-Dismutase-Vorbehandlung 12,5 Mikroliter 10 Millimolar CMH und 40 Mikroliter 125 Mikromolar PMA Arbeitslösung zu den entsprechenden Brunnen hinzufügen, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten.
Die Platten sofort auf Eis legen und den Puffer von jedem Brunnen in einzelne 1,5-Milliliter-Rohre auf Eis sammeln. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter frischekhB plus DTPA zu jedem Brunnen hinzu und kratzen die Zellen vorsichtig von der Unterseite jedes Brunnens. Dann die Zellsuspensionen mit Pipetten wieder aufhängen und die Zellen in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren auf Eis übertragen.
Zur Superoxiddetektion bei Raumtemperatur zunächst 50 Mikroliter eines Puffers oder einer Zellprobe in ein Kapillarrohr laden und das Rohr versiegeln. Legen Sie das Rohr sofort in das Elektronen-Paramagnetresonanz- oder EPR-Spektrometer und legen Sie die EPR-Erfassungsparameter für Raumtemperaturmessungen fest. Testen Sie immer eine leere Pufferprobe, die die gleiche Konzentration der Sonde enthält, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen wie eine Kontrolle behandelt wird.
Für die Superoxiddetektion bei 77 Grad Kelvin 150 Mikroliter einer Probe in ein ein bis zwei Zoll großes Stück gerades Polytetrafluorethylen oder PTFE,-Schläuche, mit einem Gummistopfen an einem Ende laden. Versiegeln Sie das andere Ende des Rohres mit einem zweiten Stopfen und blitzen Sie die Probe in flüssigem Stickstoff einfrieren. Entfernen Sie dann schnell die Stopfen und legen Sie die PTFE-Schläuche in ein beschriftetes Kryotube für die Lagerung flüssigen Stickstoffs.
Für EPR-Messungen den Fingerdewar des EPR-Spektrometers mit flüssigem Stickstoff füllen und den PTFE-Schlauch, der die Probe enthält, in den flüssigen Stickstoff geben. Legen Sie den Fingerdewar in das EPR-Spektrometer und legen Sie die EPR-Erfassungsparameter für Messungen auf 77 Grad Kelvin fest. Für den ROS-Nachweis im gefrorenen Lungengewebe legen Sie das Gewebe auf Trockeneis und verwenden Sie eine Pinzette, um das blitzgefrorene Gewebe auf Trockeneis zu stabilisieren.
Schneiden Sie die Probe in fünf 15 Milligramm Stücke, und wiegen Sie die Stücke in einem geteerten 1,5 Milliliter Rohr. Fügen Sie 196 Mikroliter KHB plus DTPA und vier Mikroliter CMH in die Probe ein, und inkubieren Sie die Lungenprobe für eine Stunde in einem 37 Grad Celsius Wasserbad, bevor Sie die Gewebefragmente mit einer kurzen Zentrifugation granulieren. Dann legen Sie die Probe auf Eis, bevor Sie 150 Mikroliter des Überstandes in ein Stück PTFE-Schläuche für das Einfrieren von Blitzen in Vorbereitung der EPR-Messung übertragen, wie gerade gezeigt.
Die Auswertung der gesamten Superoxidproduktion in rohen 264,7 Zellen, die mit PMA stimuliert wurden, wie gezeigt, zeigt, dass die Nitroxidkonzentration sowohl in der Zellsuspension als auch im Puffer der PMA-behandelten Zellen aufgrund der durchlässigen Natur und des schnellen Gleichgewichts der Spinsonde ähnlich ist. Das Signal der Nitroxidradikale erhöht sich in rohen 264,7 Zellen, die mit PMA stimuliert werden, im Vergleich zu Kontrollzellen, aber nicht in Zellen, die mit zellunperinabler Superoxiddismutase vorbehandelt sind. Die Konzentration von Nitroxid, die bei niedrigen Temperaturen in rohen 264,7 Zellen nach Stimulation mit PMA gewonnen wird, wird auch in Gegenwart von Superoxiddismutase im Einklang mit den Raumtemperaturdaten abgeschwächt.
Die Nitroxidkonzentration wird im Blut und bronchoalveolar Spülflüssigkeit von Bleo-Mäusen und behandelten Mäusen sowie innerhalb der Überwältigungen von geernteten Lungengewebestücken von Bleo-Mäusen und verletzten Tieren im Vergleich zu PBS-behandelten Kontrollen erhöht. Darüber hinaus zeigen Bleo-Mäuse und behandelte Tiere nach retroorbitaler Spinsondeninjektion ein höheres Spinsondensignal im Vergleich zu Kontrollen. Diese praktischen Protokolle ermöglichen es Forschern, die Produktion freier Radikale in verschiedenen Zellkompartimenten und biologischen Proben durch EPR zu testen, einschließlich Niedrigtemperaturmessungen.
