Neisseria meningitidis ist eine der häufigsten Ursachen für Sepsis und Meningitidis in der menschlichen Bevölkerung auf der ganzen Welt, und die Bakterien sind auf den menschlichen Wirt beschränkt. In diesem experimentellen Protokoll beschreiben wir das maßgeschneiderte Verfahren zur Induktion von Meningokokken-Meningitidis in einem Mausmodell, das auf der intrazisternalen Inokulation von Bakterien basiert. Dieses murine Modell reproduzierte die charakteristischen pathologischen Ereignisse der Meningokokken-Meningitis als schwere menschliche Krankheit.
Es stellt also ein nützliches Werkzeug dar, um die Wirts-Pathogen-Wechselwirkung zu bewerten und den pathogenetischen Mechanismus zu analysieren, der für diese tödliche Krankheit verantwortlich ist. Das Infektionsmodell könnte nicht nur nützlich sein, um innovative therapeutische Strategien zu evaluieren, um die Bakterienreplikation direkt in CSF zu verhindern, sondern auch, um die Wirksamkeit einer möglichen passiven Immuntherapie gegen menschliche Krankheitserreger zu analysieren. Die Technik erfordert die Trainingsphase, um den Erfolg nicht nur des intrazisternalen Inokulums zu garantieren, sondern im Allgemeinen die Krankheitsinduktion.
Die Verfahren werden Roberta Colicchio und Chiara Pagliuca als Forscher und Elena Scaglione als Doktorandin, alle von meinem Labor, demonstrieren. Um zu beginnen, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus einer frischen Neisseria meningitidis Kultur auf Gonokokken Agar Platte ergänzt mit 1%Polybitox Ergänzung und impfen in 10 Milliliter GC Broth. Alle Verfahren, die die Verwendung von Meningokokken beinhalten, müssen unter einem laminaren Fluss Bio-Sicherheitswürfelschrank durchgeführt werden.
Wachsen Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius in einem Orbital-Shake-Inkubator bei 220 RPM und überprüfen Sie die optische Dichte der Kultur zu verschiedenen Zeitpunkten mit einem Spektralphotometer. Wachsen Sie die Kultur, bis sie OD600 von 0,7 erreicht, was der frühen exponentiellen Phase entspricht. Sobald diese optische Dichte erreicht ist, machen Sie gefrorene Bestände, indem Sie 10% Glycerin hinzufügen und einen Milliliter der Kultur in den Kryo-Fläschchen abgeben.
Bewahren Sie die Fläschchen bei 80 Grad Celsius auf, bis sie verwendet werden. Vor der Infektion, tauen gefrorene Bakterien bei Raumtemperatur, dann in ein Zentrifugenrohr in Zentrifuge für 15 Minuten bei 1500xG übertragen Entfernen Sie den Überstand und wieder aufhängen bei einem Milliliter frische GC-Brühe mit fünf Milligramm pro Kilogramm Eisendextran. Vor Beginn des Experiments wiegen Sie die Tiere und bewerten ihre Körpertemperatur.
Das Tier aus dem Nacken abschüssen und den Bauch mit einem 70%Ethanol desinfizieren. Etwa 2 Stunden vor der Infektion, mit einer 25-Messgerät-Nadel, injizieren Eisen Dextran intraperitoneal in den unteren rechten Quadranten des Bauches. Nach der Anästhesisierung des Tieres, überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie das Fehlen von Schmerzreaktion beim Kneifen der Zehen bestätigen.
Nachdem Sie die Maus auf den laminaren Strömungsschrank platziert haben, positionieren Sie sie in einem sternförmigen Dekubitus und dehnen Sie die Gliedmaßen und die Halswirbelsäule vorsichtig aus, um die Wirbelsäule in einer geraden Position zu halten. Um eine konsistente bakterielle Suspension zu erhalten, mischen Sie sie vorsichtig, bevor Sie sie in eine Spritze mit acht Millimeter 30-Spur-Nadel laden. Desinfizieren Sie den Kopf mit einem 70%ethanol.
Legen Sie das Tier in seitliche Recumbency, ziehen Sie die Ohren aus dem Weg, und beugen Sie den Hals mäßig. Stellen Sie sicher, dass die Mittellinie des Halses und des Kopfes in perfekt paralleler Position zur Tischplatte ist. Berühren Sie dann die Atlasflügel, stellen Sie sicher, dass sie sich überlappen, und spüren Sie den natürlichen Einzug auf der Mittellinie, wo die Nadel am ehesten in das okzipitale Loch eintritt.
Füllen Sie eine Spritze mit einer 8 Millimeter 30 Gauge Nadel mit der etablierten sub-tödlichen bakteriellen Dosis von Meningokokken oder Eisen dextran ergänzt GC Broth als Kontrolle in einem Gesamtvolumen von 10 Mikroliter. Verwenden Sie die Nadel, um den Injektionspunkt zu identifizieren und dann den Inhalt der Spritze durch ein okzipitales Gratloch in die Zisterne magna von Mäusen zu injizieren. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel nach der Injektion sicher.
Legen Sie das Tier in den Käfig unter einem laminaren Strömungsschrank. Warten Sie auf das Erwachen und die vollständige Wiederherstellung der Bewegung und gehen Sie für das Überleben der Tiere auf den infizierten Tieren, wie im Protokoll beschrieben. Nach der Anästhesisierung der Maus, desinfizieren Sie die Brust mit einem 70%Ethanol.
Mit einer 25-Meter-Nadel ziehen 600 bis 700 Mikroliter Blut durch Herzpunktion der Brusthöhle. Sammeln Sie das Blut in einer Röhre mit 3,8% Natriumcitrat und speichern Sie bei 80 Grad Celsius für die später lebensfähige Bakterielle Zellzahl Auswertung. Legen Sie die eingeschläferte Maus in die Supine-Position.
Mit Schere und Zange schneiden Sie das Fell entlang der sagittalen Ebene des Körpers. Mit Stiften, fixieren Sie die Haut mit dem Fell an den Seiten des Körpers. Verwenden Sie scharfe Schere, um die Peritonealmembran abzuschneiden.
Dann mit Schere und Einwegzange, verbrauchen Sie die Organe, wie Milz und Leber, und legen Sie jeweils in einer separaten sterilen Petrischale mit einem Milliliter GC Brühe mit 10% Glycerin ergänzt. Mit einem Kolben einer Fünf-Millimeter-Spritze die Organe bei Raumtemperatur etwa zwei bis drei Minuten mechanisch homogenisieren, bis eine einzellige Suspension gebildet wird, und in eine scurdent Kryo-Durchstechflasche übertragen. Legen Sie das Rohr sofort auf das Trockeneis.
GC AgarPlatten mit Antibiotika herstellen und vor dem Einsatz bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Stunden trocknen. Bereiten Sie 10 vollständige serielle Verdünnungen der Proben in GC Broth aus jedem homogenisierten Gewebe vor. Platten Sie sie auf GC AgarPlatten platten und über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid bebrüten.
Mit 70% Ethanol, desinfizieren Sie den Kopf einer eingeschläferten Maus. Mit einer kleinen chirurgischen Schere und einer feingekippten Stahlzange, resektieren Sie das Fell und die Haut des entfernten Kopfes, dann gehen Sie in Richtung der Oberseite des Schädels, um deutlich die Nähte zu sehen und die Öffnung des Schädels zu führen. Um den Schädel zu öffnen, legen Sie die Spitze der winzigen Schere durch das Foramen magnum.
In Richtung der Mitte des Schädels und über die Mittellinie des parietalen Knochens auf die gegenüberliegende Seite des Schädels schneiden und sanft entlang der seitlichen Gliedmaße der Lambdoid-Naht schneiden. Mit feinspitzen Zangen, beginnend von der hinteren parietalen Ecke, heben Sie den Schädel und ziehen Sie es diagonal nach oben, um das Gehirn zu entdecken, um sicherzustellen, dass das Gehirngewebe nicht an einem Knochen des Kopfes befestigt ist, wenn der Schädel angehoben wird. Verwenden Sie Einwegzange, um jegliches Bindegewebe zwischen Schädel und Gehirn zu entfernen und das Gehirngewebe nicht austrocknen zu lassen.
Verwenden Sie Einwegzange, um das Gehirn sofort in eine Petrischale mit einem Milliliter GC-Brühe mit 10% Glycerin ergänzt. Verwenden Sie den Kolben einer Fünf-Milliliter-Spritze, um das Gehirn bei Raumtemperatur etwa zwei bis drei Minuten mechanisch zu homogenisieren, bis eine einzellige Suspension gebildet wird. Übertragen Sie die Suspension in eine 2 Milliliter sterile Röhre und speichern Sie bei 80 Grad Celsius für die später lebensfähige bakterielle Zellzahl Bewertung.
Das Überleben von Mäusen, die mit 93/4286 Wildtyp- oder cssA-defekten Neisseria meningitidis-Stämmen infiziert waren, wurde untersucht. Die mittlere tödliche Dosis für den Wildstamm entsprach der Meningokokken-Herausforderung von 10 bis zur 4. KBE. Während die Sterblichkeitsrate von 10 bis zur 5. KBE 83,4% und 100% mit 10 bis zur 5. KBE-Dosis betrug.
Um die mittlere tödliche Dosis für den defekten mutierten Stamm cssA zu erhalten, war eine Dosis von 10 bis zur 8. KBE erforderlich und eine Menge von 1000 Falten höher als der Wildstamm. Nach der Injektion, Es gab eine schnelle Zunahme von Wild-Typ-Bakterien im Gehirngewebe erreichen den Höhepunkt bei etwa 24 Stunden nach der Infektion. Im Gehirn von Mäusen, die mit dem mutierten Stamm infiziert waren, sanken die lebensfähigen Zählungen im Laufe der Zeit schrittweise.
Außerdem zeigten 33,3 % der mutierten infizierten Mäuse eine bakterielle Clearance von der Infektionsstelle, im Gegensatz zu wildtypinfizierten Tieren. 48 Stunden nach der Infektion wurde die cssA defekte Mutante vollständig in Milz und Leber gelöscht, während die mit dem Wildstamm infizierten Tiere eine anhaltende Infektion aufwiesen. Die beschriebene experimentelle Methode könnte nützlich sein, um Hirnschäden im Zusammenhang mit dieser tödlichen Krankheit zu analysieren, durch ihre pathologische Bewertung, wie Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, und Hirnblutungsanalyse.
