Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, ob blutgetragene Bakterien die Blut-Hirn-Schranke überqueren können, um das zentrale Nervensystem und das Gehirn zu infizieren. Mit dieser Technik können Bakterienzahlen im Blut und Hirngewebe infizierter Tiere bestimmt werden, während die Anzahl der Bakterien, die sich in den Blutgefäßen des Gehirns befinden, ausgeschlossen wird. Demonstrieren sie das Verfahren wird Pallab Ghosh, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor.
Nach 72 Stunden nach der Infektion, stellen Sie ein automatisiertes Perfusionssystem auf eine Durchflussrate von vier Milliliter PBS ergänzt mit 10 Millimolar EDTA pro Minute. Und legen Sie das eingeschläferte Tier in die Supine-Position in eine Sezierpfanne. Bestätigen Sie die Euthanasie durch mangelnde Reaktion auf Pfoten-Pinch.
Und den Bauch mit 75% Ethanol befeuchten. Verwenden Sie eine Schere, um einen Bauchwandschnitt direkt unter dem Rippenkäfig zu machen, um das Zwerchfell und die viszeralen Organe freizulegen. Und schneiden Sie das Zwerchfell, um die Brusthöhle zu öffnen.
Schneiden Sie den Reibekäfig bilateral, um den linken Ventrikel freizulegen, und verwenden Sie Zangen, um das Herz sanft zu greifen. Legen Sie eine 21-Spur-Schmetterlingsnadel, die mit dem Perfusionssystem verbunden ist, in den linken Ventrikel ein und schneiden Sie vorsichtig das rechte Atrium, um etwa 200 Mikroliter Blut in eine Zwei-Milliliter-Röhre mit 10 Millimolar EDTA zu sammeln, um eine Gerinnung zu verhindern. Dann durchdringen Sie das Tier für vier Minuten mit 15 bis 20 Milliliter PBS plus EDTA.
Nach vollständiger Perfusion erscheinen Gehirn und Leber blanchiert und stellen sicher, dass die verbleibenden Bakterien aus den geernteten Organen stammen und nicht das zirkulierende Blut. Übertragen Sie die interessierten Organe nach der Perfusion sorgfältig in einzelne sterile, 15-Milliliter konische Röhren, die fünf Milliliter sterile vier Grad Celsius PBS pro Röhre enthalten. Um das Gehirn nach der Enthauptung zu ernten, verwenden Sie eine Schere, um die Kopfhaut auf der Mittellinie zwischen den Augen zu schneiden, wobei die Spitzen gegen den Schädel gedrückt werden, um überschüssiges Gewebe nach Bedarf zu trimmen.
Legen Sie vorsichtig eine Spitze der Schere in das Foramen magnum und schneiden Sie seitlich in den Schädel auf beiden Seiten. Schneiden Sie vorsichtig den Schädel zwischen den Augen die Mittellinie im Schädel hinunter, wobei Sie darauf achten, seitlichen Druck auszuüben und Eine Störung des Gehirns zu vermeiden. Öffnen Sie mit Zangen den Schädel, um das Gehirn freizulegen, und legen Sie einen Spachtel zwischen der Unterseite des Gehirns und der Schädelbasis, um das Gehirn vorsichtig in eine 15-Milliliter-Röhre mit fünf Millilitern vier Grad Celsius PBS zu übertragen.
In einem Biosicherheitsschrank die Spitze einlegen und einen Gewebehomogenisator 10 Sekunden lang in sequenziellen 5%Bleichmittel, sterilem Wasser, 75% Ethanol und sterilen Wasserlösungen in separaten 15-Milliliter-Konikonröhren ausführen. Wenn die Spitze gründlich sterilisiert wurde, homogenisieren Sie das infizierte Gehirn in seiner Röhre. Wenn keine sichtbaren Gewebefragmente übrig bleiben, sterilisieren Sie die Spitze erneut, um eine bakterielle Übertragung auf die nächste Organprobe zu verhindern, und homogenisieren Sie das nächste Organ.
Wenn alle Organe homogenisiert sind, bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen jedes Organs in sterilem PBS vor und verfestigen die Verdünnungen auf Gehirn-Herz-Infusionsagarplatten. Dann inkubieren Sie die homogenaten Verdünnungskulturen bei 37 Grad Celsius über Nacht und zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte, um die Gesamtzahl der Bakterien pro Organ oder Milliliter Blut zu bestimmen. Die Berechnung der bakteriellen Belastungen in L.monocytogenes-infizierten Mausorganen, wie sie gerade nachgewiesen wurde, legt nahe, dass die Perfusion nach der Infektion die bakterielle Belastung im Blut oder in den Organen infizierter Mäuse, die in dieser repräsentativen Studie untersucht wurden, nicht signifikant verändert.
Im Anschluss an dieses Verfahren können Listeria monocytogenes-infizierte Organe für zusätzliche Analysen wie die histopathologische Verarbeitung weiterverarbeitet werden, um zusätzliche Fragen zur Infiltration von Entzündungszellen in infizierte Mausorgane im Vergleich zu nicht infizierten Kontrolltieren zu beantworten. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, zu denken, um Störungen des Gehirns zu vermeiden und minimalen Kontakt zwischen der Schere und dem Gehirngewebe zu halten.
